重组DNA技术教学.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,科学出版社案例式教材生物化学课件,#,#,科学出版社案例式教材,生物化学,课件,#,单击此处编辑母版标题样式,#,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,科学出版社案例式教材,生物化学,课件,1,科学出版社案例式教材,生物化学,课件,重组,DNA,技术,第二十章,recombinant DNA technique,2,科学出版社案例式教材,生物化学,课件,基本概念,克隆,(clone):,来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。,获取同一拷贝的过程称为克隆化,(cloning),，即无性繁殖。,DNA,克隆,3,科学出版社案例式教材,生物化学,课件,基本概念,技术水平：,分子克隆,(molecular clone),（即,DNA,克隆）,细胞克隆,个体克隆（动物或植物）,4,科学出版社案例式教材,生物化学,课件,基本概念,应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的,DNA,）与载体,DNA,接合成一具有自我复制能力的,DNA,分子,复制子,(replicon),，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一,DNA,分子，也称,基因克隆或重组,DNA(recombinant DNA),。,DNA克隆,5,科学出版社案例式教材,生物化学,课件,基本概念,目的：,分离获得某一感兴趣的基因或,DNA,获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）,基因工程,(genetic engineering),实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组,DNA,工艺学。,6,科学出版社案例式教材,生物化学,课件,自然界,DNA,重组和基因转移是经常发生的,一、同源重组是最基本的,DNA,重组方式,二、细菌的基因转移与重组,接合作用,转化作用,三、病毒的作用,7,科学出版社案例式教材,生物化学,课件,重组,DNA,技术的发展简史,1960,1970,年重组,DNA,工具的研究,90,（载体、酶）。,1972,年，,Berg,等第一次完成,DNA,体外重组实验。,1973,年，,N.Cohen,、,W.Boyer,第一次完成克隆。,1980,年，重组胰岛素进入市场。,1985,年，,Mulis,完成,PCR,技术。,1996,年，克隆羊,Dolly(1963,童第周克隆鱼,),。,20,世纪,90,年代启动人类基因组计划。,8,科学出版社案例式教材,生物化学,课件,第一节 重组,DNA,技术的基本过程,1.,分,2.,切,3.,接,4.,转,5.,筛,6.,表达,9,科学出版社案例式教材,生物化学,课件,第二节 重组,DNA,技术中常用工具酶,工 具 酶,功 能,限制性核酸内切酶,识别特异序列，切割,DNA,DNA,连接酶,催化,DNA,中相邻的,5,磷酸基和,3,羟基末端之间形成磷酸二酯键，使,DNA,切口封合或使两个,DNA,分子或片段连接,DNA,聚合酶,合成双链,cDNA,分子或片段连接,缺口平移制作高比活探针,DNA,序列分析,填补,3,末端,Klenow,片段,又名,DNA,聚合酶,I,大片段，具有完整,DNA,聚合酶,I,的,5,3,聚合、,3,5,外切活性，而无,5,3,外切活性。常用于,cDNA,第二链合成，双链,DNA 3,末端标记等,反转录酶,合成,cDNA,替代,DNA,聚合酶,I,进行填补，标记或,DNA,序列分析,多聚核苷酸激酶,催化多聚核苷酸,5,羟基末端磷酸化，或标记探针,末端转移酶,在,3,羟基末端进行同质多聚物加尾,碱性磷酸酶,切除末端磷酸基,科学出版社案例式教材生物化学课件,10,一、限制性核酸内切酶,概念：,是一类能识别双链,DNA,分子中的某些特定核苷酸序列，并由此切割,DNA,双链结构的核酸内切酶，又称为限制酶。,科学出版社案例式教材生物化学课件,11,（一）限制性核酸内切酶的命名,H,in,d,属,种,株,序,H,aemophilus,in,fluenzae R,d,株,流感嗜血杆菌,d,株的第三种酶,第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；,第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；,第四个字母代表菌株；,用罗马数字表示发现的先后次序。,科学出版社案例式教材生物化学课件,12,（二）限制性核酸内切酶的类型,型限制性核酸内切酶,型限制性核酸内切酶,（应用广泛）,型限制性核酸内切酶,作用,与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源,DNA,，保护自身,DNA,科学出版社案例式教材生物化学课件,13,（三）,型限制性核酸内切酶,特点：,型限制酶识别双链,DNA,中,4,8,个核苷酸组成的特定序列，从其识别序列内切割,DNA,分子中的磷酸二酯键，产生含,5-P,和,3-OH,的产生粘性末端或平末端。,功能：,根据需要在特定的位点精确切割双链,DNA,分子。,14,科学出版社案例式教材,生物化学,课件,识别序列特点：,回文结构,(palindrome),GG,A,T,CC,CC,T,A,GG,科学出版社案例式教材生物化学课件,15,（,1,）,产生,5,突出,粘性末端,(,sticky end,),E,coR,I,*,GAATTC,*,*,CTTAAG,*,5,3,5,3,*,G,*,C T T A A,5,3,3,5,OH,P,A A T T C,*,G,*,5,3,3,5,P,OH,科学出版社案例式教材生物化学课件,16,（,2,）产生,3,突出,粘性末端,P,st,I,*,CTGCAG,*,*,GACGTC,*,5,3,5,3,5,3,3,5,OH,P,*,C T G C A,*,G,5,3,35,OH,P,A C G T C,*,G,*,科学出版社案例式教材生物化学课件,17,（,3,）产生,平末端,(,blunt end,),*,GATATC,*,*,CTATAG,*,5,3,5,3,5,3,3,5,OH,P,*,GAT,*,CTA,5,3,3,5,OH,P,ATC,*,TAG,*,EcoR,18,科学出版社案例式教材,生物化学,课件,同裂酶（,isoschizomer,）,又称异源同工酶，指来源不同识别序列相同的酶,同尾酶（,isocaudamer,）,识别序列与切割位点相互有关的一类酶,可变酶,此类酶是,型限制酶的特例，识别,DNA,序列中的一个或几个碱基是可变的，并且识别序列往往超过,6,个核苷酸,科学出版社案例式教材生物化学课件,19,(,四）限制酶作用的影响因素,DNA,底物的纯度,DNA,的甲基化程度,DNA,分子的结构,酶切反应的温度,酶切反应的时间,酶切反应的缓冲体系,20,科学出版社案例式教材,生物化学,课件,名称 识别序列及切割位点,名称识别序列及切割点,切割后产生突出末端,:,BamH,5,G,GATCC.3,Bgl,5,A,GATCT.3,EcoR,5,G,AATTC.3,Hind,5,A,AGCTT.3,Hpa,5,C,CGG.3,Mbo,5,GATC.3,Nde,5,GA,TATG.3,切割后产生,3,突出末端,:,Apa,5,GGGCCC.3,Hae,5,PuGCGC,Py.3,Kpn,5,GGTAC,C.3,Pst,5,CTGCA,G.3,Sph,5,GCATG,C.3,切割后产生平末端,:,Alu,5,AG,CT.3,EcoR,5,GAT,ATC.3,Hae,5,GG,CC.3,Pvu,5,CAG,CTG.3,Sma,5,CCC,GGG.3,限制性内切核酸酶,科学出版社案例式教材生物化学课件,21,二、连接酶,(DNA ligase),将两条双链,DNA,片段连接起来，实现,DNA,的,体外重组,功能：,催化两条,双链,DNA,分子的,互补粘性末端,或,平末端,的,5,磷酸,基团与,3,羟基,形成,磷酸二酯键,22,23,科学出版社案例式教材生物化学课件,24,常用的,DNA,连接酶,1.,大肠杆菌,DNA,连接酶,2.T4 DNA,连接酶,25,科学出版社案例式教材,生物化学,课件,DNA,连接酶对黏性末端的连接效率远高于平末端的连接效率。,连接黏性末端的温度一般在,4,15,。,连接酶的用量在平末端连接高于黏末端。,ATP,的反应浓度：,10mol/L,1 mmol/L,。,载体与目标基因的摩尔数比值：,110,13,。,影响,DNA,连接酶作用的因素,科学出版社案例式教材生物化学课件,26,三、,DNA,聚合酶,能够把脱氧核糖核苷酸,连续地,添加到双链,DNA,分子引物链的,3-OH,末端,，催化核苷酸的聚合作用,类型：,大肠杆菌,DNA,聚合酶,Klenow,片段,Taq DNA,聚合酶,逆转录酶,科学出版社案例式教材生物化学课件,27,四、其它修饰酶,1.,末端脱氧核苷酸转移酶：,主要作用是在外源,DNA,片段及载体分子的,3-OH,加上互补的同聚物尾巴，形成人工黏性末端,28,科学出版社案例式教材,生物化学,课件,29,科学出版社案例式教材,生物化学,课件,2.,多核苷酸激酶：,在重组,DNA,技术中，多核苷酸激酶可用于标记,DNA,的,5,末端，也可使缺失,5-P,末端的,DNA,发生磷酸化作用。,30,科学出版社案例式教材,生物化学,课件,3.,碱性磷酸酶：,能特异地切除,DNARNA,和,dNTP,上,5,磷酸基团。在重组,DNA,技术中，用碱性磷酸酶去除载体分子或,DNA,片段的,5-P,，以防止发生自身连接。,31,科学出版社案例式教材,生物化学,课件,32,科学出版社案例式教材,生物化学,课件,科学出版社案例式教材生物化学课件,33,第三节 重组,DNA,技术中常用载体,定义,为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些,DNA,分子。,常用载体,质粒,DNA,噬菌体,DNA,病毒,DNA,34,科学出版社案例式教材,生物化学,课件,克隆载体,(cloning vector),为使插入的外源,DNA,序列被扩增而特意设计的载体称为,克隆载体,。,表达载体,(expression vector),为使插入的外源,DNA,序列可转录翻译成 多肽链而特意设计的载体称为,表达载体,。,科学出版社案例式教材生物化学课件,35,作为基因工程载体所需具备的基本条件,能自主复制,有多个单一酶切位点，称为多克隆位点（,MCS,），利于外源,DNA,分子插入,具有两个以上的选择性遗传标记，便于重组体的筛选和鉴定,分子量小，以容纳较大的外源,DNA,拷贝数高,具有较高的遗传稳定性,36,科学出版社案例式教材,生物化学,课件,一、质粒载体,质粒,(plasmid),特点,:,能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。37,科学出版社案例式教材,生物化学,课件,（一）,pBR322,质粒载体（克隆,6kb,）,科学出版社案例式教材生物化学课件,38,（二）,pUC19,质粒载体,LacZ,基因与,-,半乳糖苷酶,X-gal,，,5-,溴,-4,氯,-3-,吲哚,-D-,半乳糖苷,MCS,区段：来自,M13,噬菌体,科学出版社案例式教材生物化学课件,39,二、噬菌体（,bacteriophage,）载体,（一）,噬菌体,(phage),载体,（二）粘粒,(cosmid),载体,（三）,M13,噬菌体载体,科学出版社案例式教材生物化学课件,40,噬菌体插入较大外源,DNA,片段（,23kb,）,41,科学出版社案例式教材,生物化学,课件,与质粒载体相比，其突出优点是可插入较大外源,DNA,片段,噬菌体的感染效率远高于质粒载体的转化效率,42,科学出版社案例式教材,生物化学,课件,三、病毒载体,质粒载体、噬菌体载体都是以原核细胞（如大肠杆菌）作为宿主细胞。近年来为适应真核细胞重组,DNA,技术的需要，特别是为实现真核基因表达或基因治疗的需要，已发展出用动物病毒改造的病毒载体。,43,科学出版社案例式教材,生物化学,课件,目前常用的病毒载体有整合型和游离型两类,逆转录病毒载体（整合型）,腺病毒载体（游离型）,44,科学出版社案例式教材,生物化学,课件,病毒载体的改造,带目标基因假病毒,包装细胞,目标基因,科学出版社案例式教材生物化学课件,45,三、人工染色体载体,酵母人工染色体载体（,YAC,）是第一个成功构建的人工染色体载体，用于在酵母细胞中克隆大片段外源,DNA,。,YAC,可接受,100kb,2 000kb,的外源,DNA,片段插入，是人类基因组计划中物理图谱绘制采用的主要载体。,科学出版社案例式教材生物化学课件,46,人工染色体载体包含的调控元件,着丝粒：以保证染色体在细胞分裂过程中正确地分配到子代细胞。,端粒：作为染色体复制所必需的成分，可防止染色体被核酸外切酶降解而缩短。,复制起始点和限制性酶切位点。,YAC,载体的两臂均带有选择标记。,原核序列及调控元件：以便于在大肠杆菌中操作。,科学出版社案例式教材生物化学课件,47,第四节 重组,DNA,技术基本原理,基本原理,目的基因的获取,DNA,导入受体细胞,外源基因与载体的连接,克隆载体的选择和构建,重组体的筛选,克隆基因的表达,科学出版社案例式教材生物化学课件,48,一、目的基因的获得,（一）化学合成法,（二）聚合酶链反应,(polymerase chain,reaction,PCR),（三）,从基因文库中筛选,科学出版社案例式教材生物化学课件,49,（一）化学合成法,要求：,已知目的基因的核苷酸序列或其,产物的氨基酸序列,由已知氨基酸序列推测可能的,DNA,序列,50,科学出版社案例式教材,生物化学,课件,（二）聚合酶链反应,PCR,法,RT-PCR,法,（三）从基因文库中筛选,基因组,DNA,文库,(genomic library)cDNA,文库,(cDNA library),基因组,DNA,文库,存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组,DNA,的集合。,51,科学出版社案例式教材,生物化学,课件,限制酶切位点,限制酶消化,除去中间片段,cos L,R cos,cos L,左臂,R cos,右臂,真核生物染,色体,DNA,限制酶部分消化,外源,DNA,与载体,DNA,混合,连接反应,体外包装,用重组噬菌体,感染大肠杆菌,20 Kb DNA,片段,cos L,R cos,20 Kb,外源,DNA,片段,基因文库,用随机切割的真核生物染色体,DNA,片段构建基因文库,52,科学出版社案例式教材,生物化学,课件,mRNA,cDNA,双链,cDNA,重组,DNA,分子,cDNA,文库,反转录酶,载体,受体菌,复制,从,cDNA,文库获取目的基因,53,科学出版社案例式教材,生物化学,课件,二、克隆载体的选择和构建,目的不同，操作基因的性质不同，载体的选择和改建方法也不同。,科学出版社案例式教材生物化学课件,54,三、目的基因的体外重组,DNA,体外重组,本质,上是一个,酶促反应,过程，在,DNA,连接酶的催化作用下，将外源,DNA,分子（目的基因）与载体,DNA,分子连接成一个重组分子的过程55,科学出版社案例式教材,生物化学,课件,（一）黏性末端连接,（二）平末端连接,（三）人工接头连接,（四）同聚物加尾连接,科学出版社案例式教材生物化学课件,56,（一）黏性末端连接,基本方法：,目的基因与载体分子经,同一限制性核酸内切酶,切割成具有,相同黏性末端,的,DNA,片段后，可通过黏末端互补配对，再借助,DNA,连接酶封闭缺口，形成完整的重组,DNA,分子,57,Bam,H,切割反应,GGATCC,CCTAGG,T4,DNA,连接酶,15,C,GATCC,G,G,CCTAG,+,目的基因用,Bam,H,切割,载体,DNA,用,Bam,H,切割,重组体,载体自连,目的基因自连,同一限制酶切位点连接,58,不同限制酶切位点的连接,Eco,R,切割位点,Bg,l,切割位点,+,Eco,R+,Bg,l,双酶切,Eco,R+,Bg,l,双酶切,T4,DNA,连接酶,15,C,重组体,科学出版社案例式教材生物化学课件,59,（二）平末端连接,限制性内切酶切割产生的平端,粘端补齐或切平形成的平端,60,目的基因,载体,限制性内切酶,限制性内切酶,T4 DNA,连接酶,15,C,重组体,载体自连,目的基因,自连,识别序列,外源,DNA,酶切位点,酶切位点,Eco,R,酶切,Pvu,酶切,粘性末端,平末端,双酶切载体,DNA,连接酶,科学出版社案例式教材生物化学课件,62,（三）人工接头连接,由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接,。,人工接头及其应用,CC,GAATTC,G,GG,CTTAAG,C,5,-,3-,Eco,R,Eco,R,Eco,R,Eco,R,科学出版社案例式教材生物化学课件,64,（四）同聚物加尾连接,在末端转移酶,(terminal transferase),的作用下，在,DNA,片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。,65,5,3,3,5,载体,DNA,5,3,3,5,目的基因,限制酶或机械剪切,限制酶,5,3,3,5,5,3,T(T),n,T,T(T),n,T,3,5,5,3,3,5,3,A(A),n,AA(A),n,A,3,5,-,核酸外切酶,-,核酸外切酶,末端转移酶,+,dATP,末端转移酶,+,dTTP,T(T),n,T,A(A),n,A,A(A),n,A,T(T),n,T,T4,DNA,连接酶,15,C,重组体,5,科学出版社案例式教材生物化学课件,66,四、重组,DNA,分子的导入,宿主细胞应具备的条件,处于感受态,对载体无严格限制,限制酶和重组酶缺陷,不对外源,DNA,进行修饰,能表达重组体所提供表型特征,67,科学出版社案例式教材,生物化学,课件,磷酸钙转染,DEAE-,葡聚糖介导转染,电穿孔转染,脂质体转染,显微注射,转化,转染,感染,科学出版社案例式教材生物化学课件,68一）根据重组载体的遗传表型进行筛选,（二）限制性核酸内切酶酶切鉴定,（三）核酸分子杂交法,（四）,PCR,法,（五）免疫化学检测法,五、重组,DNA,分子的筛选与鉴定,69,(,插入失活法,),抗药性标记选择,70,科学出版社案例式教材,生物化学,课件,筛选重组体,pUC18,71,科学出版社案例式教材,生物化学,课件,表达体系的建立：,表达载体的构建,受体细胞的建立,表达产物的分离纯化,六、克隆基因的表达,72,科学出版社案例式教材,生物化学,课件,其优点：,简单、迅速、经济、适合大规模生产,。,E.coli,表达体系的不足：,不宜表达真核基因组,DNA,；,不能加工表达的真核蛋白质；,表达的蛋白质常形成不溶性包涵体,；,很难表达大量可溶性蛋白。,1.,原核表达体系,(E.coli,表达体系最为常用,),73,科学出版社案例式教材,生物化学,课件,优点：,可表达克隆的,cDNA,及真核基因组,DNA,可适当修饰表达的蛋白质,表达产物分区域积累,缺点：,操作技术难、费时、不经济,2.,真核表达体系（酵母、昆虫、乳类动物细胞）,74,科学出版社案例式教材,生物化学,课件,第五节重组,DNA,技术与医学,的关系非常密切并前景远大,一、疾病基因的发现与克隆,根据基因定位克隆之并研究其性质，而认识疾病的分子机制。,疾病基因发现的两个典型例子,:,脆性,X,综合征,Kallmann,综合征,75,科学出版社案例式教材,生物化学,课件,二、生,物制药,利用基因工程生产有药用价值的蛋白质、多肽产品已成为当今世界一项重大产业，并将有望成为,21,世纪的支柱产业。,美国,Eli Lilly,公司于,1982,年首先利用重组,DNA,技术合成人胰岛素并投放市场，标志着生物工程药物时代的开始。迄今为止，已有,50,多种基因工程药物上市，近千种处于研发状态，形成一个巨大的高新技术产业，产生了不可估量的社会效益和经济效益。,76,科学出版社案例式教材,生物化学,课件,重组,DNA,医药产品,产 品,功 能,组织胞浆素原激活剂,抗凝,血液因子,VIII,促进凝血,颗粒细胞,-,巨噬细胞集落剌激因子,剌激白细胞生成,促红细胞生成素,剌激白细胞生成,生长因子,(bFGF,EGF),刺激细胞生长与分化,生长素,治疗侏儒症,胰岛素,治疗糖尿病,干扰素,(,1b,2a,2b,),抗病毒感染及某些肿瘤,白细胞介素,激活、剌激各类白细胞,超氧化物歧化酶,抗组织损伤,单克隆抗体,利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗,乙肝疫苗,(CHO,酵母,),预防乙肝,口服重组,B,亚单位菌体霍乱菌苗,预防霍乱,77,科学出版社案例式教材,生物化学,课件,基因诊断,(genetic diagnosis),是,利用分子生物学及分子遗传的技术和原理，在,DNA,水平分析、鉴定遗传疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突变。,又称,DNA,诊断。,三、基因诊断与治疗,（一）基因诊断的概念,78,科学出版社案例式教材,生物化学,课件,（二）基因治疗的概念,定义,基因治疗,(gene therapy),是向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。,方式,体细胞基因治疗,(somatic cell gene therapy),性细胞基因治疗,(germ line gene therapy),科学出版社案例式教材生物化学课件,79,The End,