光谱法研究Zn%5E%282%2B%29与TEVp之间的相互作用.pdf

光谱法研究 与 之间的相互作用朱国飞余 凯夏 杰余素鹏周 安马 超(贵州理工学院食品药品制造工程学院贵州 贵阳)摘 要:为了探究金属离子对 结构和功能的影响促进 在去除重组蛋白融合标签中的应用采取荧光光谱、圆二色谱等光谱方法研究 与 之间的相互作用 紫外光谱及内源荧光实验结果表明 与 的相互作用为静态淬灭机制 同步荧光光谱、三维荧光光谱以及圆二色谱实验结果表明 与 的结合会引起蛋白构象发生改变导致 的 折叠结构降低螺旋结构增加蛋白色氨酸残基微环境发生改变造成疏水性增强、极性减弱关键词:光谱方法相互作用 引言烟草蚀纹病毒蛋白酶()是一种重组 型半胱氨酸蛋白酶来源于烟草蚀纹病毒()含氨基酸 个分子量 较易在工程菌中进行有效表达反应条件相对温和能够特异性识别(/)七氨基酸序列因此是去除重组蛋白融合标签的重要蛋白酶之一 为进一步了解应用环境对 结构和功能的影响在前期、两种金属离子与 相互作用研究的基础上本实验采用紫外光谱、内源荧光光谱、圆二色谱等多种光谱技术探究 与 相互作用具体情况通过研究金属离子对 结构与功能的影响有助于加深对 催化机制的认识为 的工程化改造及应用提供依据和帮助 材料与方法.材料与仪器(纯度)本实验室纯化所得氯化锌 分析纯磷酸盐 分析纯 型 计(成都方舟科技有限责任公司)紫外可见分光光度计(上海元析仪器有限公司)型荧光分光光度计(日本日立公司)型圆二色谱仪(日本)溶液:和/(/的 缓冲液.(最适)待用.实验方法.紫外可见光谱检测向石英比色杯中加入 的 溶液(/)再依次定量添加 溶液在维持总体积几乎不变前提下使 的终作用浓度为朱国飞等:光谱法研究 与 之间的相互作用收稿日期:基金项目:贵州省科技厅贵州理工学院科技合作计划项目(黔科合字)贵州理工学院高层次人才科研启动项目()作者简介:朱国飞()男四川邛崃人博士副教授主要研究发酵工程与生物制药通信作者:马 超()男吉林吉林人博士主要从事蛋白质工程与生物制药/每次加入混匀平衡 常温扫描 .荧光光谱检测样品处理同紫外可见光谱(.)检测参数:激发电压 激发狭缝 发射狭缝 分别在、和 三个恒温条件检测内源荧光光谱:激发波长为 和 扫描范围设置为 同步荧光光谱:检测波长差(激发光波长 发射光波长)分别为 和 时的同步荧光光谱检测范围设置为 三维荧光光谱:激发间隔 激发波长设置为 发射波长设置为 .圆二色谱检测向 样品(/)中分次定量加入 溶液(使终作用浓度分别为/)每次加入混匀平衡 激发光狭缝 发射光狭缝 检测范围 开启光谱校正扫描速度中速所有光谱实验重复 次 并扣除缓冲液背景.酶活检测 融合蛋白 蛋白酶/(作用浓度)/的 缓冲液(.)定容至 酶切 电泳检测酶活 结果与分析.紫外可见光谱在./曲线 分别代表为、/时紫外可见光谱实验结果如图 所示 由图 可知:随着 浓度增加 位于 及 附近的紫外吸收强度均开始降低暗示 与 发生了结合 芳香族氨基酸残基的微环境发生了改变图 与 相互作用的紫外可见光谱.与 相互作用对内源荧光的影响当 值为.温度为 时内源荧光实验结果如图 所示 ()()图 与 相互作用的内源荧光光谱 由图 可知当激发波长分别是(图)和(图)时逐渐提高 浓度 的荧光强度均呈现规律性的降低(自身没有荧光)且最大发射峰明显蓝移暗示 和 朱国飞等:光谱法研究 与 之间的相互作用间发生了明显作用 和 残基周围微环境发生变化导致疏水性升高极性降低根据 方程则有/()其中为添加 前 荧光强度 为添加 后 的荧光强度为对应 浓度为动态荧光淬灭速率常数为生物大分子荧光平均寿命(约为)为 动态淬灭常数当温度为、时淬灭常数 分别为(.)、(.)、(.)/()远大于淬灭剂对生物大分子的最大扩散碰撞淬灭速率常数./()且随着作用温度的升高 逐渐降低表明 与 的相互作用机制为静态淬灭如图 和表 所示图 时不同温度条件下 与相互作用的 曲线表 与 相互作用的动态淬灭常数 与动态荧光淬灭速率常数 温度/()/()方程系数.同步荧光测定 对 构象的影响当 ./同步荧光实验是在荧光扫描过程中激发波长与发射波长保持恒定的波长差()当 时能够高选择性地呈现酪氨酸()的光谱学特征而当 时则呈现色氨酸()的光谱学特征如图 所示 ()()图 的同步荧光光谱 由图 可知当 分别为 和 时保持 浓度不变逐渐增加 浓度二者荧光强度均呈现规律性降低且 基团的荧光波峰明显蓝移表明 的加入影响了 酪氨酸和色氨酸残基的微环境尤其是对色氨酸()影响更大导致色氨酸残基的疏水性逐渐升高极性逐渐降低.三维荧光光谱三维荧光光谱是用于研究生物大分子与药物小分子相互作用后结构变化的一种常用方法 实朱国飞等:光谱法研究 与 之间的相互作用验结果分别如图 和表 所示未添加 前和添加 后相比荧光峰(主要是 和 残基引起的)和峰(主要表现多肽链的荧光特征)的强度都有所减少(峰 为瑞利散射峰)并且发生了蓝移(峰 蓝移 峰 蓝移 )表明 与 结合导致蛋白多肽链收紧和 残基微环境疏水性升高极性降低 ()三维光谱图 ()俯视图 ()三维光谱图 ()俯视图图 与 相互作用的三维荧光光谱图表 与 相互作用的三维荧光光谱参数样品峰/强度峰/强度.对 二级结构及其功能的影响圆二色谱能够较为精准地检测蛋白二级结构的改变 ./分别为、/时远紫外圆二色谱如图 所示 由图 可知随着 浓度的增加 在 处的吸收强度逐渐增加暗示 的加入导致 二级结构发生了变化 通过 软件对二级结构进行估算结果如表 所图 远紫外圆二色谱分析 与 的结合作用示:未加入 时 含有约.螺朱国飞等:光谱法研究 与 之间的相互作用旋.折叠.转角以及.无规则卷曲与先前的研究结果高度一致 随着 加入转角及无规则卷曲结构未发生较大变化但 螺旋结构明显增加而 折叠结构明显减少表 对 的二级结构的改变:螺旋/折叠/转角/无规则卷曲/.结语本文利用紫外、荧光等多种光谱方法研究了与 的相互作用 内源荧光光谱研究结果显示 与 发生静态淬灭作用引起内源荧光发生淬灭 同步荧光和三维荧光光谱等研究结果表明与 结合导致蛋白多肽链收紧酪色氨和酸氨酸残基的微环境产生相应变化其中色氨酸残基微环境变化较大亲水性降低非极性增强 圆二色谱试验结果表明与 的结合导致 的 螺旋结构增多折叠结构减少通过本实验的研究 初步阐明了 与 的相互作用的基本信息为 的推广和应用提供了重要理论依据参考文献:.:.:.():.():.:.().:.():.朱琳马明硕柳彩云.光谱法研究铜离子荧光探针与人血清白蛋白的相互作用.应用化工():.():.:.由耀辉熊林颖陈虹等.单宁酸与大豆分离蛋白相互作用研究.中国油脂():.():.李红许茜郑晓丽等.人参皂苷 与血清白蛋白相互作用立体选择性的光谱及分子对接研究.光谱学与光谱分析():.黄芳董澄宇张丽杨等.光谱法和分子对接模拟技术研究左氧氟沙星与人血清白蛋白的相互作用.光谱学与光谱分析():.:.:.(责任编辑:曾 萍)朱国飞等:光谱法研究 与 之间的相互作用