光核桃AmRanBP1重组蛋白表达特性及其抗逆性初步研究.pdf

黑龙江农业科学 ():H e i l o n g j i a n gA g r i c u l t u r a lS c i e n c e sh t t p:/h l j n y k x h a a s e p c nD O I:/j i s s n 毕雪奇,刘璐璐,任梓齐,等光核桃Am R a n B P 重组蛋白表达特性及其抗逆性初步研究J黑龙江农业科学,():,光核桃AmR a n B P 重组蛋白表达特性及其抗逆性初步研究毕毕雪雪奇奇,刘刘璐璐璐璐,任任梓梓齐齐,马马珺珺婕婕,狄狄俊俊彤彤,罗罗秋秋香香,(东北林业大学 盐碱地植被生态恢复教育部重点实验室,黑龙江 哈尔滨 ;东北林业大学 生命科学学院,黑龙江 哈尔滨 )摘要:光核桃为蔷薇科桃属落叶乔木,具有耐寒、耐旱等优良特性.为探究R a n B P 蛋白在光核桃A m y g d a l u sm i r a(K o e h n e)中的表达条件及其在逆境胁迫防御反应中的调控作用,利用数据库中碧桃(P r u n u sp e r s i c a)的基因序列采用同源克隆得到Am R a n B P.生物信息学分析结果表明,该基因开放阅读框O R F全长 b p,编码 个氨基酸,无跨膜区域,为亲水性稳定蛋白,无信号肽结构.蛋白序列分析和系统进化分析表明,A m R a n B P 与其他植物的R a n B P 蛋白具有较高的同源性,例如苹果(M a l u s d o m e s t i c a)、大豆(G l y c i n em a x).构建了p E T a AmR a n B P 融合表达载体,优化了蛋白表达条件,即在、I P T G浓度为 mm o lL,诱导 h时可获得较高浓度的重组蛋白,对表达产物进行纯化用以制备单克隆抗体.最后,通过模拟各种非生物胁迫条件考察Am R a n B P 转化菌株在大肠杆菌中的表达模式,发现各种胁迫条件下转Am R a n B P 的菌株抗逆性均优于空载体,并且在高温、N a C l与C u S O胁迫下优势显著,进一步表明R a n B P 可能在光核桃的防御反应中发挥作用.关键词:光核桃;R a n结合蛋白;非生物胁迫收稿日期:基金项目:中央高校基本科研业务费专项资金(C A );国家自然科学基金();国家级大学生创新创业训练计划().第一作者:毕雪奇(),女,硕士研究生,从事植物逆境生理生态学研究.E m a i l:b x q c o m.通信作者:罗秋香(),女,博士,副教授,从事植物逆境生理生态学研究.E m a i l:l u o q i u x i a n g s i n a c o m.R a n结合蛋白(R a n B P)是一种富含细胞质的核质穿梭蛋白,在核转运中起重要作用.R a n B P 是最早被发现的R a n G T P酶,R a n G T P a s e循环中的关键因子,R a n B P 特异性的与R a n G T P结合调控R a n与其他因子的相互作用,R a n B P 自身没有催 化 活 性,但 可 以 使R a n G T P a s e激 活 蛋 白R a n GA P的活性提高一个数量级,同时抑制R a n的鸟苷酸交换因子R C C 的活性,水解R a n G T P形成R a n G D P .R a n B P 表观分子量 k D a,具有 个氨基酸,具有高电荷(约 A r g、A s p、G l u和L y s)及酸性碱基,并且包含个与卷曲螺旋一致序列同源的区域.R a n B P 在核质转运、核膜重建、D NA复制以及纺锤体的组装等过程中均发挥重要作用.对于R a n的发现最初与细胞周期调控有关,小鼠体细胞中的R a n B P 在G 期时表达量最低,S期开始上升,到M期开始累积达到峰值,然而在分裂末期时迅速降低可以发现R a n B P 的表达量随细胞周期的变化与其对细胞分裂调控作用相一致 .R a n B P 在多种肿瘤细胞中表达上调,人为的增加R a n B P 的表达量或许可以引起细胞的癌变,可以作为研究癌症发生机制的模型.关于R a n在植物中的功能研究也有很多进展.研究表明,拟南芥中R a n 的过表达促使完整核膜的形成,促进细胞周期进程.这与在动物细胞中发挥的作用相同.通过构建植物过表达载体,将玉米中R a n B P 转入拟南芥中,并筛选纯化至T代,通过对拟南芥野生型、突变体和过表达植株进行低温处理,发现突变体拟南芥种子显著高于野生型,测定生理指标发现突变体对冷胁迫耐受力更强,初步推断转化Z m R a n B P 基因降低了拟南芥的耐冷性.甘薯R a n基因在N a C l、低温、P E G处理和外源施加A B A后,其表达量均先迅速降低,之后表达量增加.在茶叶休眠组织中发现低温可显著影响R a n 的表达.由此可见,R a n蛋白在植物生长发育过程中发挥重要的作用.光核桃又名西藏桃,广泛分布于西藏,云南等地 .它具有突出的经济、营养和药用价值,桃仁和光核桃仁都具有活血化瘀功效 .课题组在前期关于光核桃蛋白质组的研究结果表期毕雪奇等:光核桃Am R a n B P 重组蛋白表达特性及其抗逆性初步研究明,一个R a n B P 蛋白在重度干旱后表达量骤升,而复水后骤降,推测其表达与光核桃耐逆性有关.本研究以光核桃幼苗为材料,克隆了Am R a n B P 基因,对其进行生物信息学分析,利用原核表达技术体外诱导AmR a n B P 蛋白并纯化制备单克隆抗体,分析多种逆境胁迫下,Am R a n B P 转化菌株在大肠杆菌中的表达特性.本研究为光核桃耐逆机制解析提供基础,同时为研究植物抗逆性提供新的思路.材料与方法 材料大肠杆菌感受态DH 、R o s e t t a g a m i(D E)p L y s S、重组蛋白原核表达载体p E T a由本实验室保存;p L B S i m p l eV e c t o r载体购自天根生物科技公 司;p MD T载 体 购 自T a K a R a公 司;P l a s m i d M i n iK i t、G e lE x t r a c t i o n K i t均 购 自Om e g aB I O T E X公 司;T D NA L i g a s e购 自T a K a R a生物科技公司;Q H i g h f i d e l i t yD NAP o l y m e r a s a、限制性内切酶均购自N e wE n g l a n dB i o l a b s(N E B)公司;双色预染蛋白分子量M a r k e r购 自T h e r m o F i s h e r S c i e n t i f c公 司;H i s T a gN i NT AR e s i n购自A b b i n e生物科技公司.A m R a n B P 基因的克隆由于光核桃与碧桃(P r u n u sp e r s i c a)亲缘关系较近,所以推测其Am R a n B P 基因序列与碧桃中的应当具有较高同源性.在N C B I数据库中检索 出P p R a n B P 基因序列,并根据P p R a n B P 基因序列利用P r i m e r 设计上下游引物(F:A T G T C G A G C G C C G A T G C;R:T T AT G T G T C T T T C T T C T C C T C C T C A).提取干旱处理 d后的光核桃叶片的R NA,反转录得到c D N A.以c D N A为模板,进行P C R扩增.对P C R产物进行胶回收,将回收产物与p MD T中间载体相连,过夜连接后,转入大肠杆菌DH 中,菌液均匀涂布于含有氨苄的L B固体培养基中,过夜培养.挑取单克隆菌落P C R鉴定,将有目的条带的阳性克隆摇菌后送到生物公司测序,得到测序结果进行比对.生物信息学分析利 用N C B I中G e n B a n k数 据 库 找 到AmR a n B P 在不同物 种 中 的 同 源 序 列,然 后 用D NAMAN(L y n n o nB i o s o f t)对其在不同物种中的氨基酸序列进行比对;利用ME GA (M e g a)软件 构 建 发 育 树;使 用TMHMM v 对AmR a n B P 蛋白进行在线分析;使用P r o t P a r a mt o o l分析AmR a n B P 的理化参数;利用在线网站S i g n a l P S e r v e r对AmR a n B P 蛋白信号肽进行预测;使用G e n e MAN I A网站对以拟南芥的R a n B P 为中心,预测与其相关的互作蛋白.原核表达载体的构建利用克隆获得的Am R a n B P 全长O R F,设计带 有 酶 切 位 点 的 特 异 性 上 下 游 引 物(F:G GAT C C C AG G T C G C T C C GAT;R:G T C GA C T G T G T C T T T C T T C T C C T C C,酶 切 位 点 为:B a mH I、S a lI),进行P C R扩增,将扩增后得到的片段连接到p L B S i m p l eV e c t o r中间载体上,得到Am R a n B P 质粒,将Am R a n B P 和p E T a载体质粒进行酶切,将酶切后的质粒进行连接,过夜连接后涂在含有氨苄的L B平板上,过夜培养后挑取单克隆进行培养,提取质粒D NA,双酶切鉴定后,将样品送到生物公司测序.光核桃A m R a n B P 蛋白的小量诱导及条件优化将构建好并检测正确的载体质粒转入到大肠杆菌感受态R o s e t t a g a m i(D E)p L y s S,菌液涂在含有氨苄和氯霉素的L B平板上,过夜培养后,挑取单克隆进行P C R验证,正确克隆转到L B液体培养基中(含氨苄和氯霉素)过夜培养后,取过夜菌加L B液体培养基按 比例接种,使菌液浓度O D .对I P T G浓度和菌液诱导温度的优化方法:分别添加I P T G终浓度为,和 mm o lL,在,和 下诱导h.对诱导时间的优化方法:以最适的I P T G浓度和诱导温度,分别诱导,和 h后 rm i n收集菌体,弃上清,加入 LP B S(P H )悬浮混匀后,超声破碎,取 L蛋白样品加入 LL o a d i n gB u f f e r,沸水浴 m i n后,冰浴m i n,rm i n、离心m i n,取 L用于S D S P AG E电泳.重组蛋白A m R a n B P 的大量诱导与纯化将诱导成功后的菌株加入到L B液体培养基中(含 氨 苄 和 氯 霉 素)过 夜 培 养,取 菌 液m L加入到 m LL B中,培养至菌液浓度O D 时,向瓶中加入I P T G至终浓度为mm o lL、,培养h后 rm i n、离心 m i n,弃上清,加入预冷的H i s蛋白裂解液 m L悬浮菌体并混匀,在冰上进行超声破碎,频率为 H z,每超声s,停s,设置 m i n.黑龙江农业科学期超声后,rm i n、离心 m i n,分别保留上清和沉淀用于S D S P AG E电泳.取上清进行纯化,将竖直放置的纯化柱加入m L H i s T a gN i NT A柱材料,m LB i n d i n gB u f f e r平衡后,将大量诱导所获得的上清蛋白样品加入纯化柱,加入m LB i n d i n gB u f f e r洗去纯化柱中未结合的蛋白,依次向柱中加入 倍柱体积的 mm o lL咪唑的W a s h i n gB u f f e r和倍柱体积的 mm o lL咪唑的W a s h i n gB u f f e r、倍柱体积 m m o lL咪唑的W a s h i n gB u f f e r进行洗柱、再添加倍柱体积 m m o lL 和 m m o lL咪唑的E l u t i o nB u f f e r进行洗脱.收取各部流穿液m L,最后的E l u t i o nB u f f e r全留.分别取 L流穿液样品与 LL o a d i n gB u f f e r混匀,沸水浴 m i n,S A D S P AG E电泳检测纯化结果.最后,利用透析法提高纯化蛋白的浓度,将带有样品的透析袋置于透析液(m o lL磷酸缓冲液,m o lLN a C l,m o lLE D T A)中,透析 h,透析结束后,采用B r a d f o r ds测定纯化蛋白浓度,以牛血清白蛋白(B S A)为标准蛋白.多种逆境胁迫下A m R a n B P 在大肠杆菌中的表达与抗逆性分析将 转 入 到 大 肠 杆 菌R o s e t t a g a m i(D E)p L y s S感受态的对照p E T a和p E T a Am R a n B P 菌株分别在 下培养至O D ,保证两种菌液生长密度一致,按照已优化的最佳诱导条 件 进 行 诱 导(I P T G浓 度 为 mm o lL,h).将对照p E T a和p E T a Am R a n B P 两 种 菌 液 分 别 用 含 有 mm o lLN a C l、m o lL甘露醇、m o lLC u S O和不加任何处理的液体L B培养基稀释 倍,培养 h,另外取一组高温()培养 h,每h测定次O D ,次重复.结果与分析 A m R a n B P 基因扩增结果与分析以光核桃叶片c D N A作为模板扩增A m R a n B P 基因,由图可以看到,在 b p之间存在一条明亮条带,大小约为 b p左右,与碧桃中的R a n B P 基因大小一致(b p).生物信息学分析分别选择碧桃(P r u n u sp e r s i c a)、苹果(M a l u sd o m e s t i c a)、大豆(G l y c i n em a x)、大桉(E u c a l y p t u sg r a n d i s)、拟南芥(A r a b i d o p s i s t h a l i a n a)的氨基酸序列进行对比,发现该蛋白的氨基酸序列与其他植物的R a n B P 具有较高保守区,其中与普通桃同源性达到 ,与苹果的同源性达到 (图 a).分别选择碧桃、扁桃(Pd u l c i s)、梅花(Pm u m e)、苹果、大豆、大桉、蓖麻(R i c i n u s c o m m u n i s)、毛果杨(P o p u l u s t r i c h o c a r p a)、胡杨(Pe u p h r a t i c a)、拟南芥,利用ME GA 在线软件应用最大邻近法构建系统发育树后发现,光核桃AmR a n B P 蛋白与碧桃、扁桃等植物的R a n B P 蛋白聚成一类(图 b).M a r k e r D NA M a r k e rD L ;Am R a n B P P C R产物.图Am R a n B P 基因P C R反应的凝胶电泳分析使用TMHMMv 对AmR a n B P 蛋白进行在线分析(图 a),发现AmR a n B P 没有明显的跨膜区,即为非生物膜上的功能蛋白;使用P r o t P a r a mt o o l 分析AmR a n B P 的理化参数(图 b),该蛋白质分子式、分子量和理论等电点等理化性质.AmR a n B P 的分子式为C H N O S,分子量为 ,理论等电点为 ,氨基酸总数为 ,为酸性蛋白质.采用在线软件S i g n a l P S e r v e r对A m R a n B P 蛋白信号肽进行预测(图 c),AmR a n B P 序列中无明显的信号肽序列,结果表明该蛋白是无信号肽结构的非分泌蛋白.使用G e n e MA N I A网站对以拟南芥的R a n B P B为 中 心,预 测 与 其 相 关 的 互 作 蛋 白(图 d).R a n B P A、R a n B P B、R a n B P C、R a n、R a n、AT G 这几个蛋白之间可能存在互作.除 了MAG、I MP A、AT G 和I MP 之外,推测其余蛋白之间存在共表达.推测除了MAG、AT G 、F I O、UV R、C Y 其 余蛋白 存 在 共 享 蛋 白 质 结 构 域.R AN B P C和I MP A 之间可能存在共定位.期毕雪奇等:光核桃Am R a n B P 重组蛋白表达特性及其抗逆性初步研究图Am R a n B P 与其他不同物种R a n B P 氨基酸序列多重比对(a)和系统发育进化树(b)a 跨膜区分析;b理化性质分析;c 信号肽分析;d 预测互作蛋白分析图.图AmR a n B P 蛋白的生物信息学分析 原核表达载体的构建构建重组载体p E T a AmR a n B P,分别在Am R a n B P 上下游加上B a mH I和S a lI酶切位点,构建至p MD T中间载体(图 a).将Am R a n B P 从中间载体上切下来,构建到p E T a上,最后通过双酶切验证,出现两条带且大小均符合载 体 及 片 段 大 小(图 b),说 明p E T a AmR a n B P 重组质粒构建成功.黑龙江农业科学期a p L B Am R a n B P 双酶切验证;b p E T a()Am R a n B P 双酶切验证.图Am R a n B P 原核表达载体的构建 光核桃A m R a n B P 蛋白的小量诱导及条件优化 将 重 组 载 体p E T a AmR a n B P 转 入R o s e t t a g a m i(D E)感受态,小量诱导优化表达条件,预测分子量大小为 k D a,S D S P AG E检测为 k D a清晰特异条带.首先在 时,I P T G浓度为,和 mm o lL.结果表明在 mm o lL时表达量最大(图 a).然后 分 别 在,和 时,T P T G浓 度 为 mm o lL时,诱导,和 h.结果表明在 时,I P T G浓度为 mm o lL时,诱导 h表达量最大(图 c).a I P T G浓度梯度诱导,泳道为,和 mm o lL,诱导h的蛋白;b、c、d 分别为,和 下时间梯度诱导,泳道分别为,和 h,I P T G浓度为 mm o lL,M为蛋白M a r k e r.图重组蛋白Am R a n B P 小量诱导表达的S D S P A G E电泳分析 重组蛋白A m R a n B P 大量诱导及纯化将p E T a A m R a n B P 在 大肠杆菌R o s e t t a g a m i(D E)的菌株根据优化获得的诱导表达条件(,I P T G浓度为 mm o lL,诱导 h)大量培养并诱导的蛋白用N i NT A柱子进行纯化,用,和 mm o lL咪唑进行洗脱发现,含 mm o lL咪唑基本可将杂蛋白洗掉.在 mm o lL咪唑洗脱组液里含单一期毕雪奇等:光核桃Am R a n B P 重组蛋白表达特性及其抗逆性初步研究大量目的条带.和 mm o lL咪唑也可以得到纯度较高的重组蛋白(图).收集重组蛋白进行除盐透析及浓度测定,用于后续的抗体制作.多种逆境胁迫下A m R a n B P 在大肠杆菌中的表达与抗逆性分析为研究AmR a n B P 在多种非生物胁迫下大肠杆菌中的表达情况,比较了p E T a和p E T a AmR a n B P 转化子在大肠杆菌中的生长情况.由图可知,在对照培养基(图 a)中,p E T a空载体株系和p E T a AmR a n B P 转化子株系在前h生长速度没有差异,但在h后,两种株系均进入指数生长阶段.在甘露醇(图 d)胁迫下两种株系的生长速率没有明显差异.在高温()胁迫下两种菌株在最开始前h,就已经表现出差异,两 种 菌 株 在h后 呈 指 数 生 长.在N a C l(图 c)和C u S O(图 e)胁迫下,p E T a AmR a n B P 转 化 子 的 生 长 速 率 明 显 快 于p E T a空载体的生长速率,这种差异随着时间的增加而增大.M蛋白M a r k e r;泳道未诱导的总蛋白,加I P T G诱导的上清液,穿透液;泳道 ,和 m m o lL 咪唑洗脱的p E T a A m R a n B P 蛋白.图AmR a n B P 重组蛋白纯化a 对照;b 处理后的大肠杆菌细胞生长;c mm o lLN a C l处理后的大肠杆菌细胞生长;d m o lL甘露醇处理后的大肠杆菌细胞生长;e m o lLC u S O处理后的大肠杆菌细胞生长;ae中p E T a表示带有空载体的大肠杆菌,误差线为次重复的标准误差.图非生物胁迫下Am R a n B P 的表达对大肠杆菌生长的影响讨论R a n B P 是一种在许多真核生物中发现的R a n G T P结合蛋白,在使用纯化蛋白的体外检测中,它刺激R a n GA P 的活性大约提高 倍,从而调节G T P R a n和G D P R a n之间的波动 .R a n B P 是一种胞质R a n结合蛋白,在核运输中起着关键作用.目前R a n蛋白在植物研究较少,而植物R a n首先是从番茄中得到.现已从小麦、洋葱、大蒜、水稻、蚕豆、高羊茅、龙眼中成功分离出了R a n蛋白.本研究成功克隆出了光核桃Am R a n B P 基因.黑龙江农业科学期为研究AmR a n B P 重组蛋白的表达特性和功能,本研究构建了原核表达载体,实现原核表达与纯化AmR a n B P 蛋白,采用I P T G诱导和镍柱亲和层析纯化出重组蛋白AmR a n B P 并制备多克隆抗体.本研究的难点在于重组蛋白无表达,在试验过程中,先是构建了p Q E 原核表达载体,转入相应M 表达菌株发现重组蛋白无表达.又构建了p E T a,转入B L 表达菌株发现重组蛋白无表达.后又将质粒转入R o s e t t a g a m i(D E)p L y s S还是无表达.推测在蛋白前端可能存在信号肽或前导肽结构,信号肽为存在蛋白质N段的一种短肽,蛋白质需要对其进行切割,使之成为成熟肽 .所以在A m R a n B P 的N段去掉 个氨基酸,重新转入R o s e t t a g a m i(D E)p L y s S表达菌株中,最终在,mm o lLI P T G诱导 h发现重组蛋白含量最多.此外,R a n B P 被报道与植物抗逆有关,在拟南芥中,R a n 在受到 mm o lLN a C l处理 h后,丰度明显上升.而在野生西瓜中发现两个R a n蛋白受干旱胁迫调控.N b R a n B P 在增强烟草对非生物和生物胁迫的耐受性过程中发挥着一定作用.拟南芥中,抑制A t R a n B P c的表达改变主根的生长和发育,以及这些根对生长素的超敏性.单细胞真菌藻类R a n受强光影响表达量会有所下降.不同光源可通过光敏色素信号介导的通路亦 可以调控 拟 南 芥R a n蛋 白 的 表达.在本研究中,模拟多种胁迫条件下对照菌株p E T a和表达质粒p E T a AmR a n B P 的转化菌株在大肠杆菌中的表达,发现Am R a n B P 基因受多种胁迫诱导均有响应且表达上调,各种胁迫条件下转A m R a n B P 的菌株抗逆性均优于空载体,并且在高温、N a C l与C u S O胁迫下优势显著,说明A m R a n B P 可能提高了大肠杆菌对于多种非生物胁迫的抗性.其他学者R a n蛋白的研究也得出过类似结论,例如低温与水杨酸胁迫可显著影响三明野生蕉中R a n蛋白的表达;在龙眼中发现异位表达龙眼R a n可提高植株抗寒能力;草菇R a n基因在冷胁迫下表达量会上升.以上这些研究说明R a n蛋白在植物体内可能对温度较为敏感,可能在植物对温度胁迫响应中发挥作用.关于AmR a n B P 蛋白在温度、盐碱、重金属等胁迫下的作用,还有待于课题组进一步利用转基因拟南芥进行验证.结论本研究以光核桃叶片c D N A作为模板成功扩增了A m R a n B P 基因.对A m R a n B P 蛋白进行生物信息学分析,发现A m R a n B P 与碧桃和苹果等具有较高的同源性,没有明显的跨膜区,为酸性的非生物膜上的功能蛋白,且是无信号肽结构的非分泌性蛋白.成功构建重组载体p E T a A m R a n B P,对重组蛋白诱导条件进行优化发现A m R a n B P 在 下加入 m m o lL I P T G诱导 h表达量最大,并发现重组蛋白在上清液中大量表达.为研究A m R a n B P 在多种非生物胁迫下大肠杆菌中的表达情况,比较了p E T a和p E T a Am R a n B P 转化子在大肠杆菌中的生长情况,发现在高温、N a C l与C u S O胁迫下p E T a AmR a n B P 转化子优势显著,说明Am R a n B P 可能提高了大肠杆菌对于多种非生物胁迫的抗性.本研究初步表明AmR a n B P 蛋白响应盐、高温和重金属胁迫,推测该基因有可能在光核桃逆境防御反应中发挥作用,为深入探究AmR a n B P 的生物学功能提供了思路.参考文献:L IY,Z H O UJ,M I NS,e ta l D i s t i n c tR a n B P n u c l e a re x p o r ta n dc a r g od i s s o c i a t i o nm e c h a n i s m sb e t w e e nf u n g ia n da n i m a l sJ E l i f e,:e B I S CHO F F F R,P ON S T I N G L H C a t a l y s i so fg u a n i n en u c l e o t i d ee x c h a n g eo nR a nb yt h em i t o t i cr e g u l a t o rR C C J N a t u r e,():B I S C HO F FFR,P ON S T I N G LH M i t o t i c r e g u l a t o rp r o t e i nR C C i sc o m p l e x e dw i t han u c l e a rr a s r e l a t e dp o l y p e p t i d eJ P r o c e e d i n g so f t h eN a t i o n a lA c a d e m yo f S c i e n c e s o f t h eU n i t e dS t a t e so fAm e r i c a,():张媛,李欣,刘春丽,等 R a n结合蛋白R a n B P 的生物学功能及研究进展J内蒙古大学学报(自然科学版),():HAYA S H IN,Y O K O YAMA N,S E K IT,e ta l R a n B P,aR a s l i k en u c l e a rG p r o t e i nb i n d i n gt o R a n/T C,i n h i b i t sR C C v i aR a n/T C J M o l e c u l a ra n dG e n e r a lG e n e t i c s,:P E I P E IX,A I P I N GZ,HA I Y I N GC,e t a l T h es m a l lGp r o t e i nA t R AN r e g u l a t e s v e g e t a t i v e g r o w t ha n d s t r e s s t o l e r a n c e i nA r a b i d o p s i s t h a l i a n aJ P L o SO n e,:e 马宁玉米冷响应基因Z m R a n B P 的克隆及功能分析D吉林:吉林大学,乾程,王亚,隋炯明,等甘薯R a n基因的克隆和表达分析J农学学报,():P AU L A,KUMA R S R e s p o n s e st o w i n t e rd o r m a n c y,期毕雪奇等:光核桃Am R a n B P 重组蛋白表达特性及其抗逆性初步研究t e m p e r a t u r e,a n dp l a n th o r m o n e s s h a r eg e n en e t w o r k sJF u n c t i o n a l&I n t e g r a t i v eG e n o m i c s,():阚金涛,王敬阳,刘传犇,等磷酸活化光核桃核壳对C r(V I)的吸附机理探究J水处理技术,():,X ULP,HUYB,J I NGZ,e t a l P h y s i o l o g i c a l a n dp r o t e o m i cr e s p o n s e s t od r o u g h t i nl e a v e so fA m y g d a l u sm i r a(K o e h n e)Y e tL uJ F r o n t i e r s i nP l a n tS c i e n c e,:董国正西藏光核桃的调查J中国林副特产,():孙位军光核桃仁油的化学成分和促进毛发生长作用机制研究D成都:成都中医药大学,韩雪梅蚕豆种质资源淀粉含量分析及W a x y基因遗传多样性研究D青海:青海大学,Q I AN D A C,B I HON G D,YAN G Y,e ta l A S F V p p p r o t e i nh a sd o m i n a n tB Tc e l lc o m b i n e de p i t o p e sJA n i m a lH u s b a n d r ya n dF e e dS c i e n c e,():GAN G N,S HUHUAZ,T I N G W,e ta l C D s u p p o r t sp a c l i t a x e lr e s i s t a n c e v i ai n t e r a c t i n g w i t h R a n B P JO n c o g e n e,():AUD I A S,B R E S C I A C,D A T T I L O V,e ta l R AN B P(R AN b i n d i n gp r o t e i n):t h e m i s s i n gg e n e t i cp i e c ei nc a n c e rp a t h o p h y s i o l o g ya n do t h e rc o m p l e xd i s e a s e sJC a n c e r s,:L OUN S B UR YKM,MA C A R AIG R a n b i n d i n gp r o t e i n(R a n B P)f o r m s a t e r n a r y c o m p l e xw i t hR a na n dk a r y o p h e r i nb e t aa n dr e d u c e sR a nG T P a s e a c t i v a t i n gp r o t e i n(R a n G A P)i n h i b i t i o nb yk a r y o p h e r i nb e t aJ T h eJ o u r n a lo fB i o l o g i c a lC h e m i s t r y,():A C H R A,G RU I S S EM W As m a l ln u c l e a rG T P b i n d i n gp r o t e i nf r o m t o m a t os u p p r e s s e saS c h i z o s a c c h a r o m y c e sp o m b ec e l l c y c l em u t a n tJ P r o c e e d i n g so ft h eN a t i o n a lA c a d e m yo fS c i e n c e so ft h e U n i t e dS t a t e so fAm e r i c a,():v o n HE I J N E G S i g n a ls e q u e n c e s:t h el i m i t so fv a r i a t i o nJ J o u r n a l o fM o l e c u l a rB i o l o g y,():P A E T Z E L M,D A L B E Y R E,S T R YNA D KA N C T h es t r u c t u r e a n dm e c h a n i s mo f b a c t e r i a l t y p e I s i g n a l p e p t i d a s e s:an o v e la n t i b i o t i ct a r g e tJ P h a r m a c o l o g y&T h e r a p e u t i c s,():J I AN GY Q,YAN GB,HA R R I SNS,e ta l C o m p a r a t i v ep r o t e o m i ca n a l y s i so fN a C ls t r e s s r e s p o n s i v ep r o t e i n si nA r a b i d o p s i sr o o t sJ J o u r n a lo fE x p e r i m e n t a lB o t a n y,():Y O S H I MURA K,MA S UD A A,KUWAN O M,e ta l P r o g r a mm e dp r o t e o m er e s p o n s ef o rd r o u g h ta v o i d a n c e/t o l e r a n c e i n t h er o o to faC()x e r o p h y t e(w i l dw a t e r m e l o n)u n d e rw a t e rd e f i c i t sJ P l a n t&C e l lP h y s i o l o g y,():M I Z UN O Y,OHT S U M,S H I B A TA Y,e ta l N i c o t i a n ab e n t h a m i a n aR a n B P i si n v o l v e di nt h ei n d u c t i o n o fd i s e a s er e s i s t a n c e v i ar e g u l a t i o n o fn u c l e a r c y t o p l a s m i ct r a n s p o r to fs m a l lG T P a s e R a nJ F r o n t i e r si n P l a n tS c i e n c e,:S O O HWAN K,D AV I D A,A L AN L,e ta l A n t i s e n s