高中生物《细胞分化、衰老和凋亡》素材4-苏教版必修1.doc

第2节 细胞分化、衰老和凋亡细胞凋亡（apoptosis）细胞凋亡是指细胞在一定的生理或病理条件下，受内在遗传机制的控制自动结束生命的过程。而细胞程序性死亡（programmed cell death,PCD）是指生物在发育过程中对一定生理刺激的反应性死亡，它需要一定基因表达。凋亡是对细胞死亡过程中一系列固定模式的形态变化的描述，而PCD则是侧重功能上的概念。两者有差异，但常混为一谈。细胞凋亡(ap。Ptosis)或程序化细胞死亡(programmed cell death，PCD)，是多细胞有机体为调控机体发育，维护内环境稳定Pb基因控制的细胞主动死亡过程。目前，细胞自发退化死亡现象有种种命名。较为常用的是程序化细胞死亡(Programmed cell death，PCD)，最初用于胚胎发育方面。胚胎分化过程中特定部位的细胞自发退化死亡是由于该部位的细胞内基因按一定程序表达的结果，又称基因指令性细胞死亡、生理性细胞死、自然发生细胞死亡、细胞舍生、凋亡或细胞凋亡等。（援引细胞凋亡基础与临床人民军医出版社）该名词在20世纪70年代被首次提出，指的是在生理或某些病理条件下由基因控制的一种单个细胞温和死亡形式。多细胞生物在发生、发展过程中，为了保持正常的生理机能，一部分的细胞发生自发性细胞死亡，这种细胞死亡是被细胞内一系列相关的分子所调控，并伴随有典型的形态学改变，这种现象被称为细胞凋亡。作为一种积极排除生物体内的过剩细胞和有害细胞的机制在个体形态形成、形态改变等发生过程中，成体的恒常性的维持以及生物体的防御等方面发挥作用。此外在许多病理状态下也存在着细胞凋亡。有的学者认为，细胞程序死亡受基因的控制E.M.Hedgecock等人(1983)曾对隐杆秀丽线虫在胚胎发生中的细胞死亡现象做过详细观察。这种动物在发生中基本上按一种形式进行细胞分裂，在所产生的细胞中，有的即在一定时间死亡。例如，在两性动物胚胎发生中所产生的671个细胞，就有118个在孵化前死亡。死亡的细胞被临近的细胞所吞噬分解。当有两个基因(ced1和ced2)发生突变时，便失去了吞噬能力。但在这些突变体中，细胞仍按正常的时间死亡。这说明，细胞的死亡是因细胞“自杀”而发生程序死亡的结果。Ellis等人(1982)还发现了与红细胞死亡有关的另一个基因(ced3)。 ced3突变即可阻止细胞开始死亡而且这些细胞还发生了分化进一步支持了程序死亡的观点。细胞凋亡是生物界广泛存在的一种基本生命现象，如同细胞生长、发育、增殖一样，起着十分重要的作用。目前认为，诱导凋亡的细胞外刺激必须通过细胞内一系列信号传递，造成选择性的在核小体之间断裂是其重要标志之一。细胞凋亡是以细胞核浓缩、染色体DNA被以核小体为单位切成梯状片段（ladder）、细胞缩小，最终形成细胞凋亡小体等形态变化为特征。不引起周围细胞的溶解。细胞凋亡是在细胞群中散发，阶段性进行，并且依存于的供给和、蛋白质的合成，是主动排除机制。不仅在个体发育时和卵细胞退缩等生理状态下可观察到，而且在自身免疫性疾病、神经变质性疾病、缺血性疾病等很多疾病及病理状态下也可观察到。细胞凋亡的细胞内信息传导途径可大致分为二个阶段，即诱导阶段和实行阶段。细胞凋亡的诱导阶段诱导细胞凋亡的因素有内源性的和外源性的因素。内源性的因素包括细胞凋亡诱发机制（如as配体、肿瘤坏死因子等）的激活和抑制机制（生长因子、激素、受体因子等增殖性因子）的失活。外源性的因素包括放射线、热休克等物理性因素，药物、毒物等化学性因素以及病毒、04细菌等生物学因素。近年来还发现活性氧以及一氧化氮在神经系统疾病、心血管疾病、免疫性疾病及老化等方面的作用都不同程度地与细胞凋亡有关。近来研究表明，细胞凋亡发生的关键环节不在细胞核，而在细胞质。在凋亡细胞被诱导产生特征性形态改变和DNA降解之前，线粒体膜功能发生改变，内膜跨膜电位消失和线粒体内蛋白酶活化物的释放，激发各种凋亡相关的代谢变化。细胞凋亡的生物学功能（1）清除无用的或多余的细胞，人脑在发育过程中有95%的细胞死亡。（2）除去不再起作用的细胞。如蝌蚪变态时的尾部细胞死亡；哺乳动物子宫内膜上皮细胞在月经期死亡。（3）除去发育不正常的细胞。如脊椎动物视觉系统的发育，没有形成正确神经元连接的神经元被清除掉。（4）除去一些有害细胞，胸腺细胞在离开胸腺之前被诱导死亡。细胞凋亡的过程细胞凋亡的过程大致可分为四个阶段： （ 1 ）凋亡信号转导 当细胞内外的凋亡诱导因素与被作用的细胞受体结合后，细胞产生复杂的生化反应，并形成与凋亡有关的第二信使： cAMP 、 Ca2+ 、神经酰胺等信号分子形成死亡信号。 （ 2 ）凋亡基因激活 调控的凋亡基因在接受死亡信号后，开始按预定程序启动，并合成执行凋亡所需的各种酶和相关物质。 （ 3 ）凋亡的执行（共同通路） 凋亡的主要执行者有两类酶：核酸内切酶（ endogenous nuclease Dnase ）彻底破坏细胞的生物命令系统； Caspases 3 细胞的结构全面解体。 （ 4 ）凋亡细胞的清除 凋亡后细胞可以被邻近巨噬细胞分解。凋亡时细胞的主要变化 凋亡作为一种生理性、主动的细胞死亡，它的死亡过程和形态变化与细胞坏死有显著的差别。 （ 1 ）形态学改变 实体细胞凋亡时，其表面微绒毛消失，与周围细胞脱接触。 凋亡细胞胞浆开始脱水产生空泡，并与胞膜融合，出现胞膜空泡化（ blebbing ）。 因水份丧失出现细胞固缩（ condensation ）、核固缩和发芽。 在细胞凋亡末期，碎裂的核物质由一薄层胞浆包被，形成所谓的凋亡小体（ apoptotic body ）。 在凋亡的整个过程中，没有细胞的内容物的外漏，因此也不伴有局部的炎症反应。 （ 2 ）生化改变 DNA 的片段化 由于核酸内切酶激活，基因组的 DNA 在核小体连接区发生非随机性降解，产生寡核小体片段，其大小相当于核小体（ 160 200bp ）的倍数。在琼脂糖凝胶电泳中可见特征性的“梯”状（ ladder pattern ）条带。 钙超载 在 80 年代人们发现用糖皮质激素诱导胸腺细胞凋亡时发现凋亡的细胞内游离 Ca2+ 浓度显著上升。用 Ca2+ 载体 A23187 ，人为提高 B 淋巴细胞内 Ca2+ 的水平，可诱导 B 淋巴细胞的凋亡。而用钙络合剂降低细胞内水平，能阻止凋亡发生。后发现凋亡细胞存在钙超载现象。 Ca2+ 在细胞凋亡中充当凋亡信号传递的角色。 内源性核酸内切酶激活 在凋亡时，细胞核内的核酸内切酶常常被激活，从无活性状态变成有活性，多数核酸内切酶是一种二价金属离子依赖性酶， Ca2+ /Mg2+ 可增加酶的活性，而 Zn2+ 能抑制它的活性。当然在某些细胞内也存在非二价金属离子依赖性核酸内切酶。 Zn2+ 也不能抑制其活性。 除了上述外，还有可出现细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻（由细胞膜内侧转向膜外侧）、 caspase 激活、蛋白激酶 C （ PKC ）活化等。细胞凋亡又称细胞编程性死亡PCD。细胞凋亡是一个主动的由基因决定的自动结束生命的过程，又称为细胞编程性死亡。有人以秀丽隐杆线虫为材料，观察发现该线虫个体发育中，共产生1090个体细胞，其中131个细胞在发育过程中必定死亡。蝌蚪变态时，尾部细胞退化也是一种编程性死亡。研究表明，尾部退化是受甲状腺素控制的，当蝌蚪发育到一定时期，甲状腺素分泌就会增加，发出编程性死亡信号，随后细胞开始凋亡，形成凋亡小体，这些凋亡小体被周围的巨噬细胞吞噬清除。2. 细胞凋亡的生物学意义近年来大量的研究工作揭示细胞凋亡和细胞增殖与分化同样具有重要的意义。机体内的细胞随着生命过程的进行会不断的衰老、磨损、畸变、过剩，这些无用、衰老的细胞不仅是机体的负担，还可能变为有害细胞，对机体造成威胁，通过凋亡可以将它们清除。因而细胞凋亡是调节生物体正常发育和生命活动的一种不可缺少的机制，该调节一旦失败，可能导致机体疾病、畸形甚至死亡。3.细胞凋亡与坏死 的区别性质 主要特征 凋亡小体 炎症反应细胞凋亡 生理性死亡 膜反折包裹胞内物 形成凋亡小体被吞噬 有 无细胞坏死 病理性死亡 膜发生渗漏胞内溶物释放到胞外 无 有二、细胞凋亡的形态学特征1. 凋亡起始该时期特征主要为：骨架杂乱，细胞间接触消失，细胞间粘附力下降；细胞质和核浓缩，显微镜下观察可发现细胞膜发泡，染色质凝集，沿着核膜形成新月形帽状结构；内质网腔膨胀，核糖体从内质网上脱落，伴随着这些变化凋亡小体逐渐形成。2.凋亡小体形成随着细胞膜内折，染色质断裂成片断，染色质片断及线粒体等细胞器反折的细胞膜包围并逐渐分开，形成单个的凋亡小体。3.凋亡小体消失凋亡小体被邻近的细胞或巨噬细胞识别吞食及消化。该过程一般较快，从凋亡开始到凋亡小体形成不过几分钟的时间，整个凋亡过程大约持续几个小时。三、细胞凋亡的分子机制1、caspase家族与凋亡caspase是近年发现的一组存在于胞质溶胶中的结构上相关的半胱氨酸蛋白酶，它们可特异地断开天冬氨酸残基后的肽键。切割的结果是使某些蛋白活化或失活，由此细胞凋亡。2、天然的caspase抑制剂细胞凋亡失机体用来清除病毒、防止其进一步感染的一种机制，而病毒也发展出一种对抗机制抑制caspase的活性，来逃避或阻止凋亡的发生。痘病毒蛋白CrmA和杆病毒蛋白p35就是这样的天然的caspase抑制剂。3、Bcl2家族Bcl2是一种原癌基因，是ced9在哺乳类中的同源物。Bcl2能延长细胞的寿命，但不促进细胞增殖，能抑制细胞凋亡。4、P53与细胞凋亡p53是肿瘤抑制基因，其产物主要存在于细胞核内。p53基因在人类肿瘤有关基因的突变率最高，人类肿瘤的50以上是由p53基因的缺失造成的。将p53基因重新导入已转化的细胞中，可能产生细胞凋亡或细胞生长阻遏两种结果。细胞凋亡的检测方法一、形态学观察方法1、HE染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。2、丫啶橙（AO)染色，荧光显微镜观察：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。3、台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。4、透射电镜观察：可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。二、DNA凝胶电泳（一）、检测原理细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞内小分子量DNA片断增加，高分子DNA减少，胞质内出现DNA片断。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180200bpDNA片断，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。（二）结果判断正常活细胞DNA 电泳出现阶梯状（LADDER)条带；坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带。三、酶联免疫吸附法（ELISA)核小体测定凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成，可由ELISA法检测。（一）检测步骤1、将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中含有核小体；2、在微定量板上吸附组蛋白体3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合4、加酶的底物，测光吸收制。（二）用途该法敏感性高，可检测5*100/ml个凋亡细胞。可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测。该法不需要特殊仪器，适合基层工作，但是不能精确测定凋亡细胞发生的绝多对量。四、流式细胞仪定量分析（一）检测原理细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性也增加，但是其程度介于正常细胞与坏死细胞之间。利用这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，利用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞核凋亡细胞。（二）应用价值流式细胞仪检测具有以下特点：1)、检测的细胞数量大，因此其反映群体细胞的凋亡状态比较准确2)、可以做许多相关性分析3)、结合被检测细胞的DNA含量的分析，可确定凋亡的细胞所处的细胞周期检测形态学及细胞膜完整性的Hoechs-PI双染色法细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性液增加，但其程度介于正常细胞和坏死细胞之间，利用这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，利用流式细胞仪检测细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞。利用Hoechs-PI染色法，正常细胞对染料有抗拒性，荧光染色很浅，凋亡细胞主要摄取Hoecha染料，呈现强蓝色荧光，而坏死细胞主要摄取碘化丙啶（PI)而呈强的红色荧光。DNA片断原位标记法凋亡细胞DNA片断原位末端检测技术是指在细胞（或组织）结构保持不变的情况下，用荧光素、地高辛或生物素标记的脱氧尿三磷酸（deoxyuridinetriphate，DUTP)和末端脱氧核苷酸转移酶（TdT)相反应与凋亡细胞裂解后3的羟基（OH）端结合，经显色反应后检测DNA裂解点的技术。DNA片段原位标记法有二种：1、原位缺口转移（in situ nick-translation,ISNT)技术，它是利用DNA多聚酶I将标记的核苷酸连接到断裂DNA的3OH端2、原位缺口末端标记技术（in situ end labelling technique,ISEL)，即TUNEL法。细胞凋亡中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3-OH形成，很少能够被染色。TUNEL实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。检测细胞膜成分变化的Annexin V 联合PI法1、原理：在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS)迁移至细胞膜外测。磷脂结合蛋白V（Annexin V）是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白，它于PS具有高度的结合力。因此，Annexin V可以作为探针检测暴露在细胞外测的磷脂酰丝氨酸。故利用对PS有高度亲和力的Annexin V，将Annexin V标记上荧光素（如异硫氰酸荧光素FITC），同时结合使用PI拒染法（因坏死细胞PS亦暴露于细胞膜外测，且对PI高染）进行凋亡细胞双染法后用流式细胞仪即可检测凋亡细胞。2、结果判断：正常活细胞Annexin V 、PI均低染；凋亡细胞Annexin V高染、PI低染；坏死细胞Annexin V/PI均高染。3、应用价值：细胞发生凋亡时，膜上的PS外露早于DNA断裂发生，因此Annexin V联合PI染色法检测早期细胞凋亡较TUNEL法更为灵敏。又Annexin V联合PI染色不需固定细胞，可避免PI染色因固定造成的细胞碎片过多及TUNEL法因固定出现的DNA片段丢失。因此，Annexin V联合PI法更加省时，结果更为可靠，是目前最为理想的检测细胞凋亡的方法。- 7 -用心 爱心 专心