基于超微结构的海带雌雄配子体差异研究.pdf

第 卷 第 期 年 月电 子 显 微 学 报 ，文章编号：（）基于超微结构的海带雌雄配子体差异研究王翔宇，辛美丽，刘晓慧，吴海一（山东省海洋科学研究院，山东 青岛）摘 要 目的：海带具有微小配子体世代和大型孢子体世代，可利用营养生长的配子体克隆长期保存海带种质，但配子体克隆肉眼较难分辨雌雄，本研究以 海带品系（）、海带品系（）、早厚成海带品系（）、长海带（）和真海带（）的雌雄配子体为研究对象，分析它们的超微结构差异，为种质雌雄鉴定提供细胞学研究参考。方法：海带配子体克隆保存在低温弱光条件，取 种海带共 份配子体克隆，打碎后，固定包埋，在电子显微镜下观察细胞的超微结构。结果：种海带雌雄配子体的区别在于雌配子体的质体在细胞内各个部位均有分布，雄配子体的质体靠近细胞壁分布，而且雄配子细胞有较小的质体与细胞体积比值，研究结果可作为长期保存的海带种质性别鉴定的指标。关键词 海带；配子体；超微结构；细胞器差异中图分类号：；文献标识码：收稿日期：；修订日期：基金项目：山东省农业良种工程项目（，）作者简介：王翔宇（），男（汉族），山东青岛人，副研究员：通讯作者：吴海一（），男（汉族），山东莒南人，研究员：海带是一种大型褐藻，原产于朝鲜北部沿海，日本本州北部、北海道以及俄罗斯南部沿海。中国原本没有自然分布的海带，世纪 年代以来，以引进的日本海带群体为基础，建立了海带的规模化育苗和养殖技术，并创制了一系列优良种质。海带是异形世代交替的海藻，具有微小的雌雄配子体世代和大型的孢子体世代，而单细胞分离后的配子体能够在低温弱光条件下进行营养生长，利用此特点可实现海带种质资源的长期保存，目前国内外主要采用这种方式保存海带种质资源，国内有的海带种质已保存三十多年。海带成熟的藻体释放游孢子发育成单个雌性或雄性配子体，雌性配子体细胞短而圆大，色泽较深，雄性配子体则相对细小而长，色泽较浅，以光学显微观察细胞形态判断海带种质雌雄时，多采用上述标准。随着配子体不断进行营养生长，这种判断方法就有较大的缺点，主要体现在长期保存营养生长的多细胞种质的单个细胞形状多不相同，长度和宽度都有所变化，这就造成多细胞的种质雌雄大小难以比较。同时，长期保存的种质细胞色泽深浅也会产生变化，这与保存条件，例如光照和培养基有一定关系。因此，单从克隆细胞形态判断种质性别会产生较大错误率。针对如何精准进行海带雌雄种质鉴定的问题，有的研究人员利用分子检测技术进行海带属的配子体性别鉴定，如利用性别决定区域的特定序列标记判断掌状海带配子体性别，利用染色体分子标记定位技术鉴定海带雌性配子体，利用雌雄配子体特异分子标记进行鉴定。同时，研究发现自然发育的海带雌雄配子体在细胞器的结构方面也有所不同，但在长期保存的海带种质中是否也存在细胞器的不同还未有报道，本研究采用 个不同海带种质材料的雌雄配子体进行超薄切片制样，在透射电子显微镜下观察，对比分析细胞器的超微结构差异，研究结果可为长期保存的海带种质性别鉴定提供参考。材料和方法 种质收集保存方法 将带有成熟孢子囊的海带叶片用消毒纱布沾取消毒海水清洗，用筛绢包裹后放入 的灭菌海水中放散游孢子。当海水中游孢子密度为 个，放入载玻片。光源是荧光灯，在光照时间 ，光照强度 ，水温 的条件下培育 天后，形成单个雌雄配子体。在光学显微镜（）下分检出单个配子体继续克隆培养，光照强度 ，光照时间 ，水温 。分离的种质保存在山东省海洋科学研究院藻 电子显微学报 第 卷类种质库。保存条件：水温 ，光照 ，光照时间是 ，每 个月更换 的培养液，培养液为海水中添加氮磷营养盐。其中氮源是（，国药集团化学试剂有限公司），浓度是 ，磷源是（，国药集团化学试剂有限公司），浓度是 。本实验选用的海带种质分别是 品系（）、海带品系（）、早厚成海带品系（）、长海带（）和真海带（）。超薄切片制样与观察 取少量褐色海带配子体克隆丝状体用匀浆机（，金坛市医疗仪器厂）粉碎，然后置于 离心管中，用离心机（，），离心 去掉上清液，得到长度较短的配子体片段浓缩液。在光学显微镜（）下镜检，取细胞颜色为均匀褐色的健康配子体片段，用 戊二醛和锇酸（体积分数）进行先后固定，置于梯度乙醇中脱水，树脂（）渗透包埋，应用超薄切片机（）切片，厚度为 ，用醋酸双氧铀和柠檬酸铅先后染色，置于透射电子显微镜（）下观察和拍照。质体与细胞比例 每个海带种的雌雄配子体用 软件统计多个细胞的质体和细胞的面积，用 软件进行数据统计。统计细胞数量见表。表 观察海带种质细胞数量 种名 海带品系 海带品系 早厚成海带品系 长海带 真海带 性别雌雄雌雄雌雄雌雄雌雄数量 结果与分析 雌雄配子体细胞器超微结构差异 本研究着重比较了在配子体细胞当中较为显著的 个细胞器，即质体、质体小球和细胞壁。由图版 可见，种海带的雌配子体的质体在细胞中均有分布，而雄配子的质体沿细胞壁内侧分布。其中，品系的雄配子体（图版）质体条带比雌配子体（图版）紧密，品系和早厚成品系的雌配子体（图版 和图版）质体条带比雄配子体（图版 和图版）紧密，长海带的配子体质体条带都比较紧密（图版，），而真海带配子体质体条带都比较分散（图版，）。配子体的质体都有大小不均的质体小球，除了 品系的雌配子体（图版）质体小球较小之外，其他种的雌雄配子体之间无显著区别。由图版 可见，配子体细胞壁分为两层，但它们的分层和内外层电子密度各不相同（表）。表 海带种质主要细胞器特征 细胞器 种名 海带品系 海带品系 早厚成海带品系 长海带 真海带 雌雄雌雄雌雄雌雄雌雄质体细胞中均有分布沿细胞壁内侧分布，条带分布较紧密细胞中均有分布，条带分布较紧密沿细胞壁内侧分布细胞中均有分布，条带分布较紧密沿细胞壁内侧分布细胞中均有分布，条带分布较紧密沿细胞壁内侧分布，条带分布较紧密细胞中均有分布，条带分布较分散沿细胞壁内侧分布，条带分布较分散质体小球大小不均大小不均大小不均，较小大小不均，较大大小不均大小不均大小不均大小不均大小不均大小不均细胞壁 有电子密度不同的两层，外层电子密度明显比内层高有电子密度不同的两层，外层电子密度明显比内层高有电子密度区分不明显的两层有电子密度区分不明显的两层分层不明显分层不明显有电子密度不同的两层，外层电子密度明显比内层高有电子密度不同的两层，外层电子密度明显比内层高有电子密度区分不明显的两层有电子密度不同的两层，外层电子密度明显比内层高 第 期王翔宇等：基于超微结构的海带雌雄配子体差异研究 图版 海带品系配子体细胞超微结构。，：；，：质体占细胞比例 种海带配子体的分析表明（图），各种海带质体占细胞的比例都不一样，雌性种质细胞的质体占细胞面积的比例明显高于雄性细胞。雌配子体中，真海带占比最高，数值是 ；海带品系占比最低，数值是 。雄配子体中，长海带占比最高，数值是 ，但低于 海带品系的雌配 子 体 数 值；海 带 品 系 占 比 最 低，数 值是 。结论与讨论 材料的选择 长期保存的海带配子体的生长方式是营养生长，即成为多细胞的复杂分枝体或簇状体，随着保存时间的延长，部分配子体克隆簇状体的末端会出现一些不正常细胞。可在光学显微镜下选择簇状体内部色泽均匀的细胞克隆，以利于超微结构观察。电子显微学报 第 卷图版 海带品系配子体细胞超微结构。，：；，：细胞器区别 据已有报道，雄性配子体和雌性配子体有两个主要区别：一是雄配子体的质体小球比雌配子体大一倍以上；二是质体组成带数区别，雄配子体一般为 个带，雌配子体较多。本研究发现大部分种的海带配子体质体小球大小不一，而且雌雄配子体间无明显大小区别，只有 海带品系的雄配子体较大。雌雄配子体的质体条带也没有固定数量。本研究结果与已有报道不同的原因可能是品系不同。生长正常的海带配子体呈褐色，雌配子体一般比雄配子体的色泽深，本研究中也发现雌配子体中质体占细胞体积比例比雄配子体高，而且在细胞内各部位都有分布，这可以解释为什么雌配子体细胞褐色较深，质体占细胞体积比例数值的不同也可以解释为什么长期保存的种质细胞色泽深浅不一致。本研究比较的细胞器官较少，原因在于长期保存的雌雄配子体细胞克隆呈簇状，即使打碎也会互相遮挡，加上切片角度等原因，较难观察到全部的 第 期王翔宇等：基于超微结构的海带雌雄配子体差异研究 图版 早厚成海带品系配子体细胞超微结构。，：；，：细胞器，而本研究结果发现质体和细胞壁是存在最明显的细胞器官，有利于利用超微结构进行雌雄鉴别。如果要更全面比较雌雄配子体的细胞器区别，可以借鉴高等植物在雌雄种质细胞发育过程研究方法，深入了解细胞核和线粒体等细胞器的区别，以期为营养生长的雌雄种质鉴定提供更多 的参考。海带雌配子体的质体在细胞内各个部位均有分布，雄配子体质体沿着细胞壁分布，雄配子体质体与细胞体积比值相较于雌配子体明显小。这两个细胞超微结构的不同点可作为雌雄配子体分辨的参考。电子显微学报 第 卷图版 长海带配子体细胞超微结构。：；：；，：第 期王翔宇等：基于超微结构的海带雌雄配子体差异研究 图版 真海带配子体细胞超微结构。，：；，：雌配子体细胞；雄配子体细胞；雌配子体质体；雄配子体质体。细胞壁；质体；质体小球 ，：；，：；电子显微学报 第 卷图 质体与细胞比例。参考文献：段德麟，缪国荣，王秀良，等 海带养殖生物学北京：科学出版社，：李言，刘延岭，崔翠菊，等 海带种质资源遗传多样性的 分析 生物技术通讯，（）：缪国荣 海带配子体的室内保存方法 海洋渔业，（）：王翔宇，吕芳，詹冬梅，等 养殖海藻种质资源保存研究进展 水产科学，（）：曾呈奎，吴超元 海带养殖学 北京：科学出版社，：，（）：，（）：周志刚，刘艳省，毕燕会，等能辨别海带雌、雄配子体的特异分子标记中国：，张立楠，崔翠菊 一种海带雄配子体特异分子标记及其应用 中国：，王素娟中国经济海藻超微结构研究 浙江：浙江科学技术出版社，：方宗熙，欧毓麟，崔竞进，等 海带配子体无性生殖系培育成功 科学通报，：王翔宇，于晓清，丁刚，等 低温弱光保存的海带（）雌配子体细胞结构变化 集美大学学报（自然科学版），（）：姚南瑜 藻类生理学 大连：大连工学院出版社，：国凤利，胡适宜 杜鹃雌雄配子体的超微结构及受精过程中精细胞质的传递 植物学通报，：马学平，宋玉霞，马洪爱，等 肉苁蓉雌雄配子体发育的研究 电子显微学报，（）：白逢伟，刘宗进，李永祺 丙溴磷对孤雌生殖海带细胞超微结构的影响 环境科学学报，（）：第 期王翔宇等：基于超微结构的海带雌雄配子体差异研究 ，（，）：，：，：，；