生物活性肽对产肠毒素大肠杆菌诱导的小鼠肠道损伤的缓解作用.pdf

动物营养学报，（）：生物活性肽对产肠毒素大肠杆菌诱导的小鼠肠道损伤的缓解作用王兆雨，吴晓宇，裴小琪，魏宏逵，（华中农业大学动物科技学院，武汉；生猪健康养殖部省共建协同创新中心，武汉）摘 要：本试验旨在研究生物活性肽（）对产肠毒素大肠杆菌（）诱导的小鼠肠道损伤的缓解作用。选用 周龄体重为（）的 小鼠 只，随机分为 组，分别为对照组、组、试验组和试验组，每组 只。试验期共 ，在第 天，空白对照组和阴性对照组小鼠每天灌胃 的磷酸盐缓冲液（），试验组和试验组小鼠每天分别灌胃 和 的（溶于 中）；在第 天，空白对照组小鼠灌胃 的，阴性对照组、试验组和试验组小鼠灌胃 的 菌悬液（重悬于 中），连续观察 后进行屠宰。结果表明：）与空白对照组相比，阴性对照组小鼠的存活率显著降低（），腹泻指数显著升高（）；空肠肿瘤坏死因子（）的 相对表达量显著升高（），白细胞介素（）、白细胞介素（）含量显著升高（）；空肠闭合蛋白（）、闭锁小带蛋白（）、闭锁小带蛋白 （）、转录因子核受体（）的 相对表达量显著降低（）；血清谷胱甘肽过氧化物酶（）活性显著降低（），丙二醛（）含量显著升高（）。）与阴性对照组相比，试验组和试验组小鼠的存活率显著升高（），腹泻指数显著降低（）；试验组和试验组的空肠 的 相对表达量显著降低（），、含量显著降低（）；试验组的空肠 和 的 相对表达量显著升高（）；试验组和试验组的血清 含量显著降低（），试验组的血清 活性显著升高（）。综上所述，能够缓解 感染导致的小鼠肠道炎症及屏障功能损伤，该作用可能与 上调了 表达，抑制小肠上皮细胞凋亡、坏死性凋亡及焦亡有关。关键词：产肠毒素大肠杆菌；生物活性肽；肠道炎症；程序性死亡中图分类号：文献标识码：文章编号：（）收稿日期：基金项目：中央高校基本科研业务专项资金资助项目（）；湖北省重点研发计划（）作者简介：王兆雨（），女，河北邢台人，硕士研究生，动物营养与饲料科学专业。：通信作者：魏宏逵，副教授，硕士生导师，：肠道作为消化、营养吸收和矿物质交换的主要场所，拥有庞大的微生物群落和高度进化的黏膜免疫系统。仔猪早期断奶是集约化养猪生产中常用的生产技术，可以大大提高生产效率。但是，由于仔猪早期胃肠道发育不完善，被动免疫力差，易受到外部病原微生物感染，从而发生多种肠道类疾病。腹泻作为最多发的猪肠道疾病，同时也是造成初生仔猪死亡的常见病。产肠毒素大肠杆菌（，）是动物生产过程中造成动物腹泻主要的病原菌之一。研究表明，感染后会破坏肠道屏障功能，引起仔猪腹泻和肠道炎症，甚至导致仔猪死动 物 营 养 学 报 卷亡。针对仔猪 感染一般会采用抗生素治疗，但长期、超量使用抗生素不仅会引起致病菌产生耐药性，而且可能导致抗生素残留超标和环境污染。生物活性肽（，）是对动物有益或具有生理调节作用的特异性小肽片段，它们一般由 个氨基酸残基构成。研究表明，具有抗氧化、抗炎、抗高血压和抗菌活性。与饲喂对照饲粮（含有喷雾干燥血浆或干燥乳清的饲粮）的断奶仔猪相比，饲喂含有 含肽肝素渣水解物（肝素生产副产物）的饲粮可以显著提高断奶仔猪的生长性能。在饲粮中添加的异亮氨酸谷氨酰胺色氨酸（）三肽或异亮氨酸精氨酸色氨酸（）三肽，可以缓解小鼠 感染引起的肠道损伤和炎症。可以改善动物肠道功能，并增加对致病微生物的抵抗能力，从而减少预防和治疗用抗生素在动物生产中的使用。本实验室前期从鱼皮明胶酶解产物中鉴定得到一种，发现其可通过转录因子核受体（，）来调节细胞程序性死亡，从而抑制肠道炎症和氧化应激。因此，本试验通过建立 感染小鼠肠道炎症模型，研究 对小鼠肠道炎性细胞因子、紧密连接蛋白表达和血清抗氧化指标以及肠上皮细胞程序性死亡的影响，探究 对肠道的保护作用及其机制，为解决生产中因 感染引起的仔猪腹泻问题寻找新的解决方式。材料与方法 试验动物 试验选用健康无特定病原体（）级 周龄雌性 小鼠 只，体重（），购自三峡大学实验动物中心。小鼠基础饲粮由武汉春玉红实验动物饲料有限公司提供。试验小鼠饲养于温湿度适宜的鼠笼中，提供充足的饮水和饲粮。试验材料 试验选用的菌株为 （），购买于中国兽药监察所。主要试验材料如下：（上海吉尔生化有限公司）、伊红美蓝培养基（广东环凯生物科技有限公司）、多聚甲醛（国药集团化学试剂有限公司）、试剂（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）、反转录试剂盒（武汉爱博泰克生物科技有限公司）、（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）、白细胞介素（，）试剂盒（南京建成生物工程研究所）、白 细 胞 介 素 （，）试剂盒（南京建成生物工程研究所）、丙二醛（，）试剂盒（南京建成生物工程研究所）、谷胱甘肽过氧化物酶（，）试剂盒（南京建成生物工程研究所）、，二脒基苯基吲哚（）封片剂（，上海碧云天生物技术有限公司）、（，美国 公司）、受体相互作用蛋白（）（，武汉爱博泰克生物 科 技 有 限 公 司）和 半 胱 氨 酸 蛋 白 酶 （）（，武汉爱博泰克生物科技有限公司）。试验设计 选择体重相近的 周龄雌性 小鼠 只，随机分为 组，即空白对照组、阴性对照组、试验组、试验组，每组 只。试验期共 ，小鼠到达试验场地后适应 ；在第 天，空白对照组和阴性对照组小鼠每天灌胃 的磷酸盐缓冲液（），试验组和试验组小鼠每天灌胃 和 的（溶于 中）；在第 天，空白对照组小鼠灌胃 的，阴性对照组、试验组和试验组小鼠灌胃 的 菌 悬 液（重 悬 于 中），连续观察 后进行屠宰。所有试验流程通过了华中农业大学动物伦理委员会审批。指标测定 小鼠存活率测定方法 每小时观察小鼠死亡情况，记录 内每组小鼠的死亡数量，计算死亡率，计算公式为：死亡率（）每组死亡小鼠数量每组小鼠总数量。腹泻指数的观测和计算方法 记录第 天灌胃后 内小鼠的总排便数、稀便次数；根据稀便污染滤纸直径，稀便级分为 级，级：；级：；级：；级：。计算稀便率、平均稀便级和腹泻指数，计算公式如下：稀便率（）（每只动物每日稀便量每日总便量）该组动物数量；平均稀便级所有稀便级数 稀便次数；期王兆雨等：生物活性肽对产肠毒素大肠杆菌诱导的小鼠肠道损伤的缓解作用腹泻指数稀便率平均稀便级。血清氧化应激指标测定血清 含量和 活性按照试剂盒说明书进行测定。空肠 和 含量测定 空肠 和 含量按照试剂盒说明书进行测定。空肠氧化应激指标、炎性因子及肠道屏障相关因子表达测定 使用 法提取肠道组织总，采用反转录试剂盒将总 反转录为。实时荧光定量（）引物序列见表。采用 试剂进行，过程如下：，个循环。最后，用 肌动蛋白（）作为内参进行样品间的校正，使用 法计算目的基因肿瘤坏死因子 （）、闭锁小带蛋白（）、闭锁小带蛋白（）、闭合蛋白（）、过氧化氢酶（）和超氧化物歧化酶（）的 相对表达量，每个样品重复 次。表 引物序列 基因引物序列 （）肌动蛋白：肿瘤坏死因子：白细胞介素：白细胞介素：闭锁小带蛋白：闭锁小带蛋白：闭合蛋白：过氧化氢酶：超氧化物歧化酶：免疫荧光检测 采用 多聚甲醛固定空肠组织，切片后再脱蜡，加入乙二胺四乙酸（，）修复抗原。透化组织，再用牛血清白蛋白（）封闭处理，然后依次用一抗和二抗孵育，最后加入 染核。将染好的切片用 共 聚 焦 显 微 镜 进 行 观 察，拍照。数据统计分析 试验数据经过 初步处理后，采用 软件的 程序进行单因素方差分析，采用 氏法进行多重比较，并用 做图。数据以平均值标准误表示，代表显著差异。结果与分析 对 诱 导 小 鼠 存 活 率 和 腹 泻指数的影响 由图 可知，在灌胃后 ，与空白对照组相比，阴性对照组的小鼠存活率显著降低（），腹泻指数显著升高（）。与阴性对照组相比，试验组和试验组的小鼠存活率显著动 物 营 养 学 报 卷升高（），腹泻指数显著降低（）。以上结果表明，可缓解 诱导的小鼠腹泻，提高小鼠存活率。表示差异显著（）。数据柱标相同小写字母表示差异不显著（），不同小写字母表示差异显著（）。下图同。（）（），（）图 对 诱导小鼠存活率和腹泻指数的影响 对 诱导小鼠空肠形态结构的影响 由图 可知，与空白对照组相比，阴性对照组的小鼠空肠组织出现炎性浸润、绒毛间隙变宽、绒毛断裂和绒毛水肿。通过对空肠病变范围、病变深度和炎症进行总体的切片评分发现，与空白对照组相比，阴性对照组小鼠的切片评分显著升高（）；与阴性对照组相比，试验组和试验组小鼠的切片评分显著降低（）。以上结果表明，缓解了 诱导的小鼠空肠形态损伤。图 对 诱导小鼠空肠形态学的影响 （）对 诱导小鼠肠道炎性细胞因子表达和含量的影响 由图 可知，与空白对照组相比，阴性对照组的小鼠空肠 的 相对表达量显著升高（），、含 量 显 著 升 高（）。与阴性对照组相比，试验组和试验组 期王兆雨等：生物活性肽对产肠毒素大肠杆菌诱导的小鼠肠道损伤的缓解作用的小鼠空肠 的 相对表达量显著降低（），、含量显著降低（）。图 对 诱导小鼠肠道炎性因子表达的影响 对小鼠肠道紧密连接蛋白表达的影响 由图 可知，与空白对照组相比，阴性对照组的小鼠空肠、的 相对表达量显著降低（）。与阴性对照组相比，试验组的小鼠空肠 的 相对表达量显著增加（），试验组和试验组的小鼠空肠 和 的 相对表达量无显著差异（）。以 上 结 果 表 明，可 提 高 感染后小鼠空肠 的 相对表达量，维护肠道屏障。图 对 诱导小鼠肠道紧密连接蛋白表达的影响 对 诱导小鼠血清和空肠氧化应激指标的影响 由图 可知，与空白对照组相比，阴性对照组的小鼠血清 活性显著降低（），含量显著升高（）。与阴性对照组相比，试验组和试验组的小鼠血清 含量显著降低（），试验组的小鼠血清 活性显著升高（）。与空白对照组相比，阴性对照组的小鼠空肠 和 的 相对表达量显著降低（）。与阴性对照组相比，试验组和试验组的小鼠空肠 和 的 相对表达量有所升高（）。对 诱导小鼠空肠上皮细胞程序性死亡及 相对表达量的影响 由图 可知，与空白对照组相比，阴性对照组的小鼠空肠 的 相对表达量显著降低（）。与阴性对照组相比，试验组的小鼠空肠 的 相对表达量显著升高（）。此外，与空白对照组相比，阴性对照组小鼠空肠固有层及隐窝处与凋亡相关的、与坏死性凋亡相关的 和与焦亡相关的 表达水平增加（图中暗红色区域），表明 可引起小鼠空肠上皮细胞发生程序性死亡。值得注意的是，处 理 后 小 鼠 空 肠 固 有 层 及 隐 窝 处、和 表达水平下降，说明 可以缓解 感染引起的空肠细胞凋亡、坏死性凋亡和焦亡。讨 论 是导致仔猪腹泻的主要病原菌，猪在感动 物 营 养 学 报 卷染 后会出现采食量下降、腹泻、精神萎靡等症状，严重者甚至出现死亡，因此给养殖业带来了巨大的经济损失。最近的研究发现，具有抗菌、抗炎和抗氧化的作用，因此 有希望在一定程度上替代抗生素。本研究发现，可抑制 感染引起的小鼠氧化应激、肠道炎症以及肠道细胞程序性死亡，从而维持肠道屏障功能。图 对 诱导小鼠血清和空肠氧化应激指标的影响 图 对 诱导小鼠空肠上皮细胞程序性死亡及 相对表达量的影响 许多研究报道 感染可诱导肠道炎症反应，表 现 为 肠 道、白 细 胞 介 素 （）、含量升高。定植于肠道后产生的耐热肠毒素和不耐热肠毒素会导致细胞水盐代谢紊乱，并引起肠道炎症与腹泻。细胞壁中含有的脂多糖（）可直接诱导炎症反应，并可通过激活丝裂原活化蛋白激酶（）信号 通 路 来 进 一 步 促 进 炎 性 细 胞 因 子 的 产生。本试验发现，可降低 诱导小鼠的空肠、含量，并降低空肠 的 相对表达量，说明 可有效缓解 感染引起的肠道炎症。期王兆雨等：生物活性肽对产肠毒素大肠杆菌诱导的小鼠肠道损伤的缓解作用 细胞的坏死性凋亡及焦亡是炎性的细胞死亡方式，此外过度的凋亡也会导致炎性反应。在发育过程中，细胞凋亡是一种稳态机制，也是发生免疫反应或细胞受损时的一种防御策略。在大多数情况下，细胞凋亡是一种默认的细胞死亡方式，而当关键的凋亡介质被药物抑制，或当细胞发生应激以及被某些病毒感染后，凋亡就会转变为坏死性凋亡。本试验发现，减少了细胞凋亡、坏死性凋亡及焦 亡 的 发 生，且 空 肠 组 织 的 相对表达量上调了 倍。已有研究表明，在葡聚糖硫酸钠（）诱导的结肠炎模型中，可通过上调 的表达，阻断固有层巨噬细胞炎性小体核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白（）组装，从而抑制细胞焦亡，降低炎性细胞因子释放，进而缓解肠道炎症。对于 抑制细菌感染引起的肠黏膜细胞过度凋亡和坏死性凋亡的发生，本研究为首次报道。由于 在调控细胞凋亡中的重要作用，本研究的证据暗示，对上述细胞凋亡的调控可能也与 有关。肠道的氧化应激与炎性反应的产生和发展密切相关。、都是反映氧化应激程度的重要标志物。和 是人体抗氧化系统的主要成员，可以有效分解过氧化物；因此，和 活性可以反映机体清除氧自由基的能力。可以利用还原形态的谷胱甘肽（）将过氧化氢（）转化为水，维持细胞稳定性，保护细胞结构。是一种脂质代谢产物，可以直接反映体内脂质过氧化的强度和速率，也可以间接反映自由基对组织损伤的程度。本研究发现，可降低血清 含量，并提高血清 活性，说明 可以缓解 感染引起的氧化应激。紧密连接蛋白作为构成肠道屏障的重要结构，是抵御外来抗原、微生物和其他异物的主要参与者。感染可导致肠道紧密连接蛋白的表达下调。为了验证 是否通过降低炎症反应和氧化应激来缓解 感染引起的肠道损伤，我 们 检 测 了 肠 道 紧 密 连 接 蛋 白 的 表 达。处理上调了 感染后空肠 的表达，表明 维护了肠道紧密连接蛋白的功能。上述结果表明，可通过抑制肠道炎性细胞因子释放、提高肠道抗氧化能力以及抑制肠上皮细胞程序性死亡来缓解肠道炎症和损伤。当肠道黏膜的通透性达到一定程度，大分子物质（例如细菌和毒素）可透过肠上皮进入固有层，并进一步易位到血液、肝脏、淋巴等，从而引发肠源性感染，甚至导致多器官功能衰竭；因此，内脏器官中的细菌载量可以反映机体的健康状况。本研究发现，经 处理后的小鼠空肠组织切片评分显著降低，说明 可在一定程度上缓解小鼠 感染引起的空肠损伤，对黏膜形态起到保护作用。缓解 感染引起的肠道损伤的机制可能是通过促进 表达来抑制炎性细胞因子释放、缓解氧化应激，抑制肠上皮细胞程序性死亡。本试验结果表明，能够有效缓解小鼠 感染引起的空肠损伤。许多研究表明，小鼠在感染 后会出现明显的体重下降情况，在本试验中也出现了此类情况但不明显，这可能是因为在给小鼠灌服 后较短时间内就进行了屠宰。结 论 可缓解小鼠 感染引起的腹泻，并且与阴性对照组相比，试验组和试验组小鼠的存活率显著提高。此外，可以缓解小鼠 感染引起的空肠形态结构受损，增加空肠紧密连接蛋白表达，缓解氧化应激和肠道炎症；该作用可能与 上调 表达，抑制肠上皮细胞发生凋亡、坏死性凋亡和焦亡有关。参考文献：，（）：黄登桂，周加义，高春起，等产肠毒素大肠杆菌对仔猪肠道黏膜屏障功能的影响及其损伤修复研究进展动物营养学报，（）：，（）：（），（）：动 物 营 养 学 报 卷 ，（）：，：，（）：，：，（）：，：，（）：，（）：，：，：，：，：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（），（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（），（）：，（）：，：，：，：，（）：，（）：，（）：期王兆雨等：生物活性肽对产肠毒素大肠杆菌诱导的小鼠肠道损伤的缓解作用 ，（）：，：（责任编辑 武海龙），（，；，）：（）（）（），（），（），；，（），：），（），（）；（）（），（）（）（）；，（），（）（）（）；（）（），（）（），（），（）；（），（）；（）；（），（），（）：；