黄连内生真菌抑乙酰胆碱酯酶活性菌株的筛选及鉴定.pdf

这恰是形成道地药材不可或缺的历史文化内涵综上本研究建立的 指纹图谱化学模式识别的质量评价方法直观清晰、特征明显、操作可行明确了秦巴及外产地间药材的质量差异性为头顶一颗珠的道地品质和开发利用提供了质量评价依据参考文献詹亚华 中国神农架中药资源 武汉:湖北科学技术出版社李若樨张晓存石召华 头顶一颗珠的质量研究 中药材():周学森胡崇峻 神农架珍稀药草漫谈 中国民族民间医药杂志():杨德胜 土家族药学 西宁:青海人民出版社王平 湖北苗药 北京:中医古籍出版社欧阳俊摇邹海艳李慢中等 延龄草的化学成分和药理作用研究进展 时珍国医国药():左月明刘电航张忠立等 延龄草根及根茎的化学成分研究()中药材():杨印军 延龄草的化学成分研究 北京:北京协和医学院陈立兵朱少铭兰俊等 头顶一颗珠组方治疗发作期痰浊型偏头痛临床观察 世界中西医结合杂志():邱勇李人鹏刘粟等 头顶一颗珠醇提物对新生大鼠缺血/缺氧性脑损伤的保护作用 中国药理学通报():刘江陈兴福邹元锋 基于中药指纹图谱多维信息的化学模式识别研究进展 中国中药杂志():刘小康王康宇贡济宇等 基于指纹图谱的麦冬质量差异性分析 中药材():陈锋张颖李嘉 基于聚类分析和主成分分析的广西小叶金花草高效液相色谱指纹图谱研究 中南药学():陈婷钱博文唐樑等 基于指纹图谱结合化学模式识别评价益胃汤标准汤剂及配方颗粒的差异 现代中药研究与实践():陈洁陈文茜郭文鼎等 指纹图谱结合主成分分析对不同产地头顶一颗珠质量的评价 中国中医药信息杂志():涂星斯琴陈家艺等 鄂产头顶一颗珠的 指纹图谱及主成分分析 中华中医药杂志():刘东方赵丽娜李银峰等 中药指纹图谱技术的研究进展及应用 中草药():中国科学院中国植物志编辑委员会中国植物志(第 卷)北京:科学出版社林灵黄海量程阳阳等 延龄草属植物的化学成分以及临床配伍研究 中国药物评价():国家中医药管理局中华本草 编委会 中华本草(第 册)上海:上海科学技术出版社南京中医药大学 中药大辞典(第二版)上海:上海科技出版社张嫚李志勇廖朝林等 民族药头顶一颗珠的文献考证与鉴定 时珍国医国药():杨印军孙欣光杨杰等 延龄草与吉林延龄草根茎及须根中 种皂苷成分的含量测定 中国中药杂志():左月明陈林林张忠立 不同产地延龄草根茎药材 指纹图谱和 种甾体皂苷成分的含量测定及多元统计分析 中南药学():肖伟张新庄曹亮等 基于功效成分群的中成药全过程质量控制体系探索 南京中医药大学学报():周文斌林力李志勇等 土家药天珠散防治血管性痴呆的有效成分与作用机制研究 中国中药杂志():孙君社 现代优质道地药材种植管理模式及实践 北京:中国农业科学技术出版社作者简介:陈敏江男()学历:硕士 职称:主治医师黄连内生真菌抑乙酰胆碱酯酶活性菌株的筛选及鉴定陈敏江刘 丽潘婉婉吴 剑(台州市第一人民医院神经外科科室浙江台州)摘要:目的 从黄连()植株内分离筛选具有较高乙酰胆碱酯酶抑制活性的内生真菌并对筛选出的强抑制活性菌株进行菌种分类及鉴定为阿尔茨海默病新药的研发提供潜在的菌种资源方法 采用改良 法对黄连植株内分离获得的内生真菌菌株进行乙酰胆碱酯酶抑制活性测定对筛选的活性较强菌株根据菌株的形态学特征结合分子生物学方法进行菌种鉴定结果 在黄连根、茎和叶部共分离获得 株内生真菌有 株对乙酰胆碱酯酶有抑制活性 活性菌株中 抑制活性较强经初步鉴定该菌株为枝孢菌属的 结论 从黄连根部筛选分离出乙酰胆碱酯酶抑制活性菌株其中菌株()具有较强乙酰胆碱酯酶抑制活性可为开发新的乙酰胆碱酯酶抑制剂()奠定基础关键词:黄连枝孢菌属阿尔茨海默病乙酰胆碱酯酶中图分类号:文献标识码:文章编号:()():阿尔茨海默病()又名老年痴呆是一种中老年性中枢神经系统退行性病变也是一种不能被有效治愈或控制病情发展的疾病目前已发展成为威胁老年人生命健康的主要疾病之一 为了寻找治疗阿尔茨海默病的有效药物及方法众多国内外研究者对阿尔茨海默病的发病机制开展研究最早提出的研究假说是“胆碱能损伤学说”认为阿尔茨海默病病理生理过程涉及神经元和突触变性其主要表现为胆碱能的损伤 基于该假说开发的乙酰胆碱酯酶抑制剂()在阿尔茨海默病治疗上取得较好的疗效 主要通过抑制 活性减少乙酰胆碱分解阻碍神经信号传递从而起到缓解阿尔茨海默病的病情发展 迄今已被 批准用于阿尔茨海默病治疗的 有、虽然现有 对缓解 病情发展具有一定的疗效但长期使用临床也表现出副作用大、半衰期短、靶点单一、抗药性增强等缺点因此寻求毒副作用小、疗效好、适宜患者长期服用等优点的天然源 成为阿尔茨海默病治疗药物开发领域的一个热点药用植物是天然源 的主要来源临床常用药石杉碱甲和加兰他敏就是从植物中发现的单体化合物但由于植物存在生长周期长、环境要求高、次级代谢产物提取率低等问题亟需新的途径来寻找药源 年 等从红豆杉()中分离到内生真菌安德氏紫杉霉发现该菌经发酵能产生抗癌物质紫杉醇表明了通过药用植物共生微生物寻求有效代谢产物的可行性 黄连是中药主要药材之一是阿尔茨海默病治疗中药复方的主要用药已有研究表明毛茛科黄连中分离的原小檗碱、盐酸小檗碱、黄连碱等生物碱具有较好 活性 本实验以黄连为材料分离其共生真菌筛选具有 活性的菌株旨在为进一步获取发酵产物中的天然 活性成分为治疗阿尔茨海默病的新药研发奠定基础 材料和方法 材料来源 供试材料黄连()购买自重庆石柱县 培养基 分离和纯化培养基均为 培养基 培养基配制方法:称取马铃薯 去皮切成小块加水煮沸 双层纱布过滤得过滤液每 过滤液加入 葡萄糖和 琼脂分装于 锥形瓶中 高压灭菌 待用 内生真菌分离和纯化 将黄连用自然水冲洗干净后置于无菌滤纸上风干风干后经 酒精消毒 消毒 后无菌水冲洗 次最后一次冲洗液作为对照于 上涂板检测消毒是否彻底 将消毒后的黄连根部、茎、叶片切成 小块置于含 氯霉素的 培养基上每个皿放置 块倒置于 恒温培养箱中培养 每天观察并采用菌丝尖段端挑取法挑取菌丝接种于新的培养基上培养待菌株产孢后单孢分离纯化后转接于 试管斜面 冰箱保存将分离纯化后的目标菌株接种至 培养基平板上放置于 恒温培养箱内培养 期间持续观察菌落形态、颜色、菌丝质地等并做好记录菌丝及孢子等显微结构采用插片法观察 参照真菌鉴定手册做初步鉴定 分子鉴定 菌株菌种分子鉴定通过 序列进行比对鉴定采用通用引物()和 ()进 行 扩增 反应体系:模板 上下游引物/()各 聚合酶 无菌水补足至总体积 反应条件为 个循环 扩增后所得产物进行纯化后海峡药学 年 第 卷 第 期送至上海生物工程有限公司进行测序测序结果提交 上进行序列同源性比对应用 软件构建系统进化树确定菌株分类 菌株发酵培养将分离获得菌株接种至 培养基上待培养 左右挑取菌落边缘 左右大小菌饼 块接种于 锥形瓶(含 马铃薯葡萄糖培养液)中然后置于恒温振荡培养箱中 条件下振荡培养 发酵液经无菌纱布过滤后得上清液 乙酰胆碱酯酶抑制活性测定 采用改进的 方法测定菌株发酵液对乙酰胆碱酯酶的抑制活性总反应体积为 内含 的 菌株发酵液 的 的 反应 迅速加入 的终止液 终止反应于 处测定 值每个样品重复 次由于发酵液多有颜色每次实验用 代替 做一个本底扣除对照组以 代替发酵液记为 对照 抑制率的计算公式:抑制率()(样品 本底)/(对照 空白)菌株发酵液以 无菌滤膜过滤除菌后使用 结果与分析 内生真菌的分离 从黄连根、茎和叶等部位中分离的内生真菌共计 株其中根部分离的内生真菌 株占总共分离出内生真菌的 包括、等 个属茎部 株占总菌株数的包括、等 个属叶部 株包括、两个属(见图、表)分离的菌株中 和 为优势种群分别占总菌株数的 和 本研究结果表明黄连内生真菌在各组织的分布有一定偏好性且不同组织部位数量及优势种群分布有一定差异 与牟燕等报道植物内生菌在植物组织内的分布特性结果较为一致图 黄连不同部位分离的内生真菌 菌株乙酰胆碱酯酶抑制活性测定对从黄连上分离到的 株真菌进行改良的 法进行体外抑制乙酰胆碱酯酶活性测定 结果表明测定的 株内生真菌中有 株菌的发酵产物对乙酰胆碱酯酶有抑制活性阳性率达到 左右(见表)菌株 和 对乙酰胆碱酯酶的抑制率在 以上其中从黄连根部分离的菌株 抑制活性最高抑制率达到 表 黄连内生真菌分离菌株的种属组成 表 黄连内生真菌发酵液对乙酰胆碱酯酶的抑制活性测定()()菌株 的菌种鉴定 形态学鉴定:菌株 在 培养基上培养形态菌丝生长较慢菌落平展培养基上呈较规则圆形菌落边缘整齐呈白色菌丝较短绒状呈黄绿色无色素分泌菌落背面黑色偶有裂缝 分生孢子梗橄榄色至褐色直立或弯曲顶端分枝或不分枝分生孢子链生柠檬形、卵圆形、广椭圆形多数单胞有的具 个隔膜(见图)图 菌株 培养形态()及显微镜下形态特征()()分子生物学鉴定:将菌株 的 区 与 上序列进行同源性比对 按照 法构建菌株 的系统发育树(见图)同源性 比对结果表明菌株(登录号为)与 (登 陆 号 分 别 为:、)等同源性为 聚在同一枝上而 (登陆号:)、(登 陆 号)等归于另一个分枝 结合菌株 培养特征及形态学特征可初步鉴定该菌株为枝孢菌属的 图 菌株 的系统发育树 讨论黄连是传统的药用植物也是治疗阿尔茨海默病的主要中药之一富含的生物碱具有较显著的乙酰胆碱酯酶抑制活性 植物共生真菌与药用植物长期共存生长的过程中可能进化出特有的遗传特性和代谢方式产生相似的或新的次级代谢产物这些代谢产物结构新颖是新型活性天然产物的主要来源 已有研究报道从贯叶连翘()、蛇足石杉()等药用植物中分离的内生真菌能产生抑制乙酰胆碱酯酶抑制活性的代谢产物本研究测试的 株黄连内生真菌中有 株具有乙酰胆碱酯酶抑制活性 其中 发 酵 液 抑 制 活 性 最 高 达 到 表明该菌株发酵产物中含有较高的乙酰胆碱酯酶抑制活性成分 为今后进一步从黄连内生真菌中分离活性次级代谢产物奠定基础枝孢菌属分布较广广泛存在于空气、土壤及各类有机质中据报道枝孢菌属是多种植物的病原菌如引起花生的叶斑病、石竹的叶斑病、草莓的花枯病等在生产上造成一定的经济损失 但多数研究也表明枝孢菌属其次级代谢产物具有抑菌、抗肿瘤、抗氧化活性等活性在医学、农学上有着巨大的潜在应用价值 本研究从黄连中筛选出内生真菌属枝孢菌属的极细枝孢菌 具有较强的乙酰胆碱酯酶抑制活性可为天然源乙酰胆碱酯酶抑制剂的进一步研究开发提供参考依据参考文献 ():():():():():蒋小飞黄连须根中原小檗碱型生物碱的分离与乙酰胆碱酯酶抑制活性研究 贵州师范学院学报():魏景超 真菌鉴定手册 上海:上海科学技术出版社:牟燕刘世芳尹翠云等 南板蓝根内生真菌分离鉴定及其生物活性研究 中成药():袁志林章初龙林福呈 植物与内生真菌互作的生理与分子机制研究进展 生态学报():宋萍洪伟吴承祯等 雷公藤内生真菌的分离及抗肿瘤活性研究 北华大学学报():郭钦杨中铎孙建慧 种药用植物内生真菌的分离纯化及生物活性研究 甘肃科学学报():齐博文莫婷张鑫等 蛇足石杉内生真菌的分离鉴定及其代谢产物乙酰胆碱酯酶抑制活性及抗炎活性研究 中国中药杂志():():():():马文婷吴友根胡征波等 诺丽内生真菌的分离鉴定及其次生代谢产物的抗氧化活性 热带生物学报():杨方玉张波涂敏等 七叶树内生真菌的分离及活性研究 陕西理工学院学报():海峡药学 年 第 卷 第 期