附生化酶.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,一、,酶是生物催化剂,酶,(enzyme),是生物活细胞所产生的以蛋白质为主要成分的生物催化剂,催化活性不依赖完整的细胞存在,并非都是蛋白质，还有催化活性的,RNA,也是酶称为,R,酶（,Ribozyme,）,二、,酶催化作用的特点,酶和一般催化剂的共同点,用量少而催化效率高,不改变化学反应的平衡点,可降低反应的活化能,酶的特性,具有很高的催化效率,具有高度的专一性,酶的催化活性易受外界环境因素的影响,酶的催化活性在细胞内受到严格的调控,酶的催化活性与辅因子有关,三、,酶的化学本质及其组成,化学本质,蛋白质,少部分是,RNA,组成,:,由单纯蛋白质所构成的酶,由蛋白质和其他成分构成的酶,:,即酶蛋白,(apoenzyme)+,即辅助因子,(cofactor),。,辅助因子分辅酶和辅基,(coenzyme&prosthetic group),，,。,辅酶,(coenzyme):,与酶蛋白结合松弛的辅助因子,辅基（,prosthetic group):,可以通过透析或其他方法将辅酶除去；与酶蛋白结合较牢固的辅助因子,分类,单体酶,(monomeric enzyme),：只含有,一条多肽链,，分子量在,12,35kD,之间，如溶菌酶、胰蛋白酶等。,寡聚酶,(,oligomeric enzyme,),：由,几个甚至几十个亚基组成,，这些亚基可以相同的也可以不同。,多酶体系,(,multienzyme system,),：是由,几种酶,彼此嵌合形成的复合体。,第二节 酶的分类与命名,一、命名原则,二、酶的分类,一、命名原则,1.,命名,2,编号,:,用,4,个阿拉伯数字的编号表示，数字中用“,”,隔开，前面冠以,EC,（为,Enzyme Commission,）。,EC,类,.,亚类,.,亚亚类,.,排号，如,EC l.1.1.27,乳酸脱氢酶,二,.,酶的分类,1.,氧化还原酶类（,oxido-reductases):,催化氧化还原反应：,A,2H +B A+B,可分为 需氧脱氢酶、氧化酶和不需氧脱氢酶。,2.,转移酶类,(transferanses),：,催化功能基团的转移反应：,AB+C A+BC,3.,水解酶类,(hydrolases):,催化水解反应,:AB+HOH AOH+BH,4.,裂合酶类,(lyases),：,催化底物裂解反应，并产生双键，或其逆反应，将一个基团加到双键上：,A,B A+B,5.,异构酶类,(isomerases),：,催化各种同分异构体的相互转变：,A B,如异构酶和消旋酶催化的反应。,6.,合成酶,(,连接酶,),类,(ligases),：,这类酶催化一切必须与,ATP,分解相联，并由二种物质合成一种物质的反应：,A+B+ATP A,B+ADP+Pi(,或,AMP+PPi),第三节 酶的作用机理,一、酶的活性中心,二、酶的专一性及酶作用专一性学说,三、酶作用机理,一、酶的活性中心,什么是酶的活性中心,活性中心,指酶分子上直接参与反应的氨基酸残基的侧链基团，根据一定的空间构象组成的活性结构。,酶活性中心可分为两部分,一部分是直接与底物结合，称为,特异性部位,（,specificity site),又称为结合部位；另一部分直接参与催化的部分，称为,活性部位,（,active site),又称转变部位。前者决定酶的专一性，后者决定所催化反应的性质。,酶活性中心的特点,活性中心只占酶分子,很小,的一部分,活性中心具有,三维结构,这样才能使构成活性中心的氨基酸残基在空间结构上相互靠近,酶与底物结合的,专一性,取决于活性中心原子的精致排列,底物靠许多相当,弱的键,同酶结合,活性中心处于酶分子的一凹穴中，形成,疏水区,酶分子的结构特点,结合部位,(Binding site),决定酶的专一性,催化部位,(catalytic site),决定酶所催化反应的性质。,调控部位,(Regulatory site),酶分子中存在着一些可以与其他分子发生某种程度的结合的部位，从而引起酶分子空间构象的变化，对酶起激活或抑制作用。,酶活性中心的结合部位结构示意图,酶活性中心的必需基团,亲核性基团：丝氨酸的,羟基,，半胱氨酸的,巯基,和组氨酸的,咪唑基,。,酸碱性基团：天门冬氨酸和谷氨酸的,羧基,，赖氨酸的,氨基,，酪氨酸的,酚羟基,，组氨酸的,咪唑基,和半胱氨酸的,巯基,等。,二、酶的专一性及酶作用专一性学说,什么是酶的专一性,酶的高度专一性是指的具有高度的底物专一性和反应专一性；指酶只催化某一类甚至是某一种底物发生特定的反应。,专一性的类型,结构专一性：绝对专一性；,相对专一性,立体异构专一性：旋光异构专一性；,(L-;D-),几何异构专一性,;(,顺式；反式）,键专一性；基团专一性；,底物,专一性假说,:,锁钥学说,;,诱导契合学说,认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结构的，酶表面具有特定的形状。酶与底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样,锁钥学说：,诱导契合学说,该学说认为酶表面并没有一种与底物互补的固定形状，而只是由于底物的诱导才形成了互补形状。,三、酶作用机理,酶作用高效率的机制,中间产物学说,活化能降低,邻基效应和定向效应,与反应过渡状态结合作用,多功能催化作用,酶催化反应机制类型,酸碱催化,共价催化,金属离子催化作用,邻基效应和定向效应,在酶促反应中，底物分子结合到酶的活性中心，一方面底物在酶活性中心的有效浓度大大增加，有利于提高反应速度；,另一方面，由于活性中心的立体结构和相关基团的诱导和定向作用，使底物分子中参与反应的基团相互接近，并被严格定向定位，使酶促反应具有高效率和专一性特点。,酸碱催化,酸,-,碱催化可分为狭义的酸,-,碱催化和广义的酸,-,碱催化。酶参与的酸,-,碱催化反应一般都是广义的酸碱催化方式。,广义酸碱催化是指通过,质子酸,提供部分质子,或是通过,质子碱,接受部分质子的作用，达到降低反应活化能的过程,。,共价催化,催化剂通过与底物形成,反应活性很高的共价过渡产物,，使反应活化能降低，从而提高反应速度的过程，称为共价催化,。,酶中参与共价催化的基团主要包括,His,的咪唑基，,Cys,的硫基，,Asp,的羧基，,Ser,的羟基等。,某些辅酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也可以,金属离子的催化作用,电子传递中间体,许多氧化,-,还原酶中都含有铜或铁离子，它们作为酶的辅助因子起着传递电子的功能。,四、酶原与酶原激活,概念,酶原,(zymogen),：,有些酶在细胞内合成或刚分泌时，无催化活性，这种无催化活性的酶的前身物。,酶原激活,(activation of zymogen),酶原在一定条件下，经蛋白水解酶作用切去部分肽段、形成活性中心，转变为有活性的酶的过程,。,激活方式：,激活剂，自身激活，例：消化道酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶的激活,酶原激活的本质与意义,本质,：酶的活性中心形成酶原经过蛋白水解酶作用,切去一段或几段多肽,使其形成活性中心或活性中心暴露,.,意义,：合成酶的细胞本身不受蛋白酶的消化而破坏 例：消化道酶,使酶在规定的部位受激活并发挥生理作用例：凝血因子,第四节 酶促反应动力学,一、,中间络合物学说和米氏方程,二、影响酶促反应速度的因素,一、中间络合物学说和米氏方程,底物浓度对酶促反应速度的影响,底物浓度对酶促反应速度的影响如图所示。,1.,中间产物学说,认为,当酶催化某个反应时,酶和底物先结合形成一个中间复合物,然后中间复合物再分解,生成产物并释放出酶。一般以产物的生成速度代表整个酶催化反应速度，而产物的生成取决于,中间物的浓度,.,因此,整个酶促反应的速度取决于中间物的浓度,.,k1 k2,E +S ES P +E,k-1,E,、,S,、,ES,和,P分别代表酶、底、酶,-,底物复合物和产物,第一步,:E+S ES,中间复合物学说：,第二步,:ESE+P,VES,1913,年,Michaelis,和,Menten,推导了米氏方程,2,米氏方程的推导,基本前提：,反应方程式,:,在米氏方程推导中引入,3,个假设,:,（,1,）,P0,忽略 这步反应,（,2,）,SES,ESS,（,3,）,E+SES,平衡，要求,k,3,k,2,。,中间复合物学说,:E+S ESE+P,VES,恒态法推导：,1925,年,Briggs,和,Haldame,对米氏方程作了一次重要的修正，提出了恒态的概念。,所谓恒态是指反应进行一定时间后，,ES,的生成速度和,ES,的分解速度相等，,亦即,ES,的净生成速度为零，此时,ES,的浓度不再改变，达到恒态，也称稳态。,3.,米氏方程的推导过程,K,1,K,3,E+S ES E+P,K,2,ES,分解速度：,K,3,ES+K,2,ES,ES,生成：,K,1,(E-ES),(S-ES),E S,ES=,K,3,+K,2,K,1,+,S,S),质量作用定律,K,3,+K,2,设,=Km,（,米曼氏常数,）,K,1,E S,ES=,Km+,S,1.,酶反应速度为：,v=K3ES,2.,当底物饱和时，,Vmax=K3ES=,K3E,除,米曼氏方程式,Vmax S,v=,Km+S,Km-,米曼氏常数,(1),当,S,Km,V,max,S,v=,Km+S,v=V,max,(,2),当,S,Km,V,max,Km,为一常数，,V,max,S,v=,Km+S,v,和,S,成正比,(3),当,S=Km,时,V,max,S,v=,Km+S,1,v=,V,max,2,Km,（米氏常数）的定义,当,v=1/2 Vmax,时，底物的浓度。,单位为摩尔,/,升（,mol/L,）,4.Km,的意义,Km,是酶的一个基本的特征性常数，只与,酶的性质,有关，与酶的浓度无关，但与,pH,、温度等因素有关；不同酶有不同的,Km,。,如果一种酶可作用于几种底物，就有几个不同的,Km,，,Km,值小的底物,一般作为该酶的最适底物或天然底物。,如果,k,2,I,，,EI=ES,，转变为,E+P,，,V,不变,3.,当有竞争性抑制剂存在时，,E,与,S,的结合力下降，,Km,增大,1/v,有,I,无,I,1/S,1/V,Km+,（,1+I/Ki,）,1,-,Km,1,-,2,、非竞争性抑制,I,可逆地与,E,的非活性中心结合,增加底物浓度不能解除非竞争性抑制剂的抑制作用。,酶非竞争性抑制的动力学特点：,1.,当抑制剂存在时，,I,与,E,结合，,v,下降,2.,有,I,存在，可形成,ESI,，从而使,ES,转变为,P,的速度减慢，,V,下降,3.,有,I,存在，但不妨碍,ES,的形成，故,Km,不变,1/v,1/S,有,I,无,I,-1/Km,E+S ES ESI,E+I EI ESI,酶反竞争性抑制的动力学特点：,1.,当抑制剂存在时，,I,与,ES,结合，,v,下降,2.,有,I,存在，可形成,ESI,，从而使,ES,转变为,P,的速度减慢，,V,下降,3.,有,I,存在，,ES,的形成增加，故,Km,下降,3,、反竞争性抑制,1/v,有,I,无,I,1/V,（,1+I/Ki),1/S,第五节、酶的分离纯化及活力的测定,一、酶的分离提纯,二、酶活力测定与酶活力单位,（一）酶的分离提纯一般步骤,1,选材,2,破碎细胞,3,抽提,4,去核酸、去多糖,5,提纯,6,保存,一、酶的分离提纯,由于酶的特殊性，在提纯过程中要注意,:,1,全部操作在低温,0,4,。,2,在分离提纯过程中，不能剧烈搅拌。,3,在提纯溶剂中加一些保护剂，如少量,EDTA,、,少量,-,巯基乙醇。,4,在分离提纯过程中要不断,测定酶活力和蛋白质浓度,，,从而求得,比活力,，还要计算,总活力,。,（二）酶分离纯化的一般原则,比活力,酶活力,蛋白质浓度,总活力单位体积的酶活力,(U/ml),分离溶液总体积,(ml),步骤,酶活力,蛋白质浓度,比活力,总活力,(NH,4,),2,SO,4,沉淀,乙醇沉淀,二、酶活力测定与酶活力单位,1.,酶活性大小表示（单位）,（,1,）,.,酶活力,酶活力又叫,酶活性,(activity),是指酶催化一定化学反应的能力。,酶反应速度,可以用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的生成量表示。,酶活力单位,国际酶学委员会规定,一个酶活力单位,(unit,u),是指在,25,下,其它条件如,pH,及底物浓度均采用最适条件,在,1,分钟内转化,1mol,底物的酶量,(,或转化,1mol,底物的有关基团的酶量,).,但是，酶的活力单位常根据实际需要来规定。,1961,年国际酶单位（,IU,）,1972,年,Katal,（简称,Kat,）单位,习惯上沿用的单位如,:,乳酸,+NAD,+,丙酮酸,+NADH+H,+,乳酸脱氢酶,乳酸脱氢酶的活力可用,丙酮酸的增加量,表示，也可用,340nm,光吸收的增加量来表示。,（,2,）,.,酶的比活力,指每,mg,蛋白质所具有的活力单位数,即活力单位数,/mg,蛋白质。在酶的纯化过程中,每步纯化后都要测定酶的比活力,比活力高,表明酶的纯度高。,表示,:,U/mg,蛋白质,也可用每,g,或每,ml,酶含多少个活力单位来表示,在提纯中，总活性在减少，总蛋白也在减少，但比活性在提高。在酶的纯化工作中还要计算两个具有实际意义的项目,即纯化倍数和回收率,(,产量,%),：,纯化倍数,=,每次比活力,/,第一次比活力,回收率（产量,%,）,=(,每次的总活力,/,第一次总活力,)100,（,3,）,.,酶的转换数,（,turnover number,即,kcat,又称为酶的摩尔活性或者催化中心活性,用来表示酶的催化效率,(catalytic power),其定义为,:,每摩尔的酶,(,单体酶,),或每摩尔的酶活性中心,(,含有多个活性中心的酶,),在单位时间内转化底物的摩尔数。,（,4).,分子活性（,molecular activity,）,(5).,催化中心活性（,catalytic center activity,）,在最适底物浓度时，每分钟每分子酶转换底物的分子数。,每分钟每一个催化中心所转换底物的分子数。,2,测定酶活力时应注意几点,（,1,）应测反应初速度（,initial velocity or initial speed,）,（,2酶的反应速度一般用单位时间,内产物的增加量来表示。,（,3,）测酶活力时应使反应温度、,pH,、离子强度和底物浓度等因素保持恒定。,（,4,）测定酶反应速度时，应使,SE,。,产,物,浓,度,P,(t),3.,酶活力的测定方法,（,1,）分光光度法（,spectrophotometry,）,该法要求酶的底物和产物在紫外或可见光部分光吸收不同。,简便、迅速、准确。,一个样品可多次测定，有利于动力学研究。,可检测到,10,-9,mol/L,水平的变化。,优点：,例,:,人血清乳酸脱氢酶活力的测定,L-,乳酸,+NAD,+,丙酮酸,+NADH+H,+,乳酸脱氢酶,（,2,）荧光法（,fluorometry,）,该法要求酶反应的底物或产物有荧光变化。,主要的优点：灵敏度很高，可以检测,10,-12,mol/L,的样品。,酶蛋白分子中的,Tyr,、,Trp,、,Phe,残基以及一些辅酶、辅基，如,NADH NADPH,、,FMN,、,FAD,等都能发出荧光。,例：乙醇,+NAD,+,乙醛,+NADH+H,+,乙醇脱氢酶,重点和难点,酶的概念与分类,酶活性中心和酶促反应动力学,Km,的概念及意义,思考题,酶作为生物催化剂有哪些特点,试说明酶的活性受哪些因素调节。,酶的几种抑制剂的概念及特点,辅酶和辅基有何不同？在酶催化反应中起什么作用？,Km,的概念及意义,