电泳分离技术.pptx

第十四章第十四章 电泳分离技术电泳分离技术 一、一、电泳技术概述电泳技术概述l l1937193719371937年，瑞典科学家年，瑞典科学家年，瑞典科学家年，瑞典科学家TiseliusTiseliusTiseliusTiselius设计了世界上第一台电设计了世界上第一台电设计了世界上第一台电设计了世界上第一台电泳仪，建立了移界电泳法，并于泳仪，建立了移界电泳法，并于泳仪，建立了移界电泳法，并于泳仪，建立了移界电泳法，并于1948194819481948年荣获诺贝尔奖。年荣获诺贝尔奖。年荣获诺贝尔奖。年荣获诺贝尔奖。l2020世纪世纪5050年代，许多科学家着手改进电泳仪，寻找合适的年代，许多科学家着手改进电泳仪，寻找合适的电泳支持介质，先后找到滤纸、醋酸纤维素薄膜、淀粉及电泳支持介质，先后找到滤纸、醋酸纤维素薄膜、淀粉及琼脂作为支持物。琼脂作为支持物。l6060年代，年代，DavisDavis等科学家利用聚丙烯酰胺凝胶作为电泳支等科学家利用聚丙烯酰胺凝胶作为电泳支持物，在此基础上发展了持物，在此基础上发展了SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、双向电泳和印迹转移电泳等技术。这些技术具聚焦电泳、双向电泳和印迹转移电泳等技术。这些技术具有设备简单，操作方便，分辨率高等优点。有设备简单，操作方便，分辨率高等优点。电泳技术概述电泳技术概述 70707070年以来，电泳技术围绕年以来，电泳技术围绕年以来，电泳技术围绕年以来，电泳技术围绕制胶、电泳、染色制胶、电泳、染色制胶、电泳、染色制胶、电泳、染色三个技术三个技术三个技术三个技术环节，不断改进，以实现下列目标：环节，不断改进，以实现下列目标：环节，不断改进，以实现下列目标：环节，不断改进，以实现下列目标：1 1 1 1、提高分辨率及灵敏度。、提高分辨率及灵敏度。、提高分辨率及灵敏度。、提高分辨率及灵敏度。2 2 2 2、简化操作，缩短电泳时间。、简化操作，缩短电泳时间。、简化操作，缩短电泳时间。、简化操作，缩短电泳时间。3 3 3 3、扩大应用范围。、扩大应用范围。、扩大应用范围。、扩大应用范围。l目前，电泳技术已成为生物化学与分子生物学以及与其密目前，电泳技术已成为生物化学与分子生物学以及与其密切相关的医学、农、林、牧、渔、制药及某些工业分析中切相关的医学、农、林、牧、渔、制药及某些工业分析中必不可少的手段。必不可少的手段。电泳电泳是指带电粒子在电场的作用下，向着与其是指带电粒子在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象。电性相反的电极移动的现象。电泳技术电泳技术指利用电泳现象对混合物进行分离分指利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术。析的技术。二、电泳技术的基本原理二、电泳技术的基本原理蛋白质分子在不同蛋白质分子在不同pH下的解离状态下的解离状态 NH3+NH3+NH2P P P COOH COO-COO-pHpI pHpI pH pI pHpI 分子带负电荷，在电场中向正极移动分子带负电荷，在电场中向正极移动;pHDNA直线直线DNA DNA 双链环状双链环状DNA DNA 2 2、聚丙烯酰胺凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)早在早在1959年由年由Raymends和和 WeintraubL建立。建立。1964年，年，此法进一步从理论和实验技术上得到改进并推此法进一步从理论和实验技术上得到改进并推广应用。由于具有较高的分辨率和灵活性，目广应用。由于具有较高的分辨率和灵活性，目前已被广泛应用于蛋白质等生物大分子的分离前已被广泛应用于蛋白质等生物大分子的分离和分析。和分析。聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）原理）原理PAGE是根据被分离物质所带电荷的是根据被分离物质所带电荷的多少及其分子大小、形状不同，在电多少及其分子大小、形状不同，在电场作用下产生不同的移动速度而分离。场作用下产生不同的移动速度而分离。它具有它具有电泳电泳和和分子筛分子筛双重作用双重作用.聚丙烯酰胺凝胶构成聚丙烯酰胺凝胶构成n n聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶是由是由是由是由单体丙烯酰胺单体丙烯酰胺(AcrAcrAcrAcr)和和和和交联剂交联剂N,N-NN-N,N-N,N-甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺(BisBisBisBis)在在在在加速剂加速剂 N N N N,N N N N,N N N N,N N N N-四甲基乙二胺四甲基乙二胺四甲基乙二胺四甲基乙二胺(TEMEDTEMEDTEMEDTEMED)和和和和催化剂催化剂过硫酸铵过硫酸铵过硫酸铵过硫酸铵(APAPAPAP)或核黄素或核黄素或核黄素或核黄素(C C C C17171717H H H H2O62O62O62O6N N N N4 4 4 4)的作用下的作用下的作用下的作用下聚合交联成三维聚合交联成三维网状结构的凝胶网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为，以此凝胶为支持物的电泳称为，以此凝胶为支持物的电泳称为，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGEPAGEPAGEPAGE)。凝胶的聚合反应：Ammonium persulfate(free radical initiator)过硫酸铵 Acrylamide(monomer)Bis(acrylamide)(bridge)TEMED(catalyst):四乙基乙二胺自由基的生成者凝胶的基本單位:丙烯酰胺交联使聚合产生分枝:甲叉丙烯酰胺帮助传递自由基的催化剂Acrylamide 有毒性！-(O S-SO)442-2 SO4CH2=CH-CO-NH21211 2核黄素-TEMED系统与过硫酸铵过硫酸铵-TEMED系统系统 联丙烯酰胺单体聚合过程：聚合反应交联剂造成分枝端点自由基 可再延续freeradicalBisBis聚合反应交錯连結丙烯酰胺丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺 聚丙烯酰胺凝胶具聚丙烯酰胺凝胶具有一定的网状结构。有一定的网状结构。如果形成的孔径大小如果形成的孔径大小接近于所分离样品分接近于所分离样品分子的平均半径子的平均半径，样品，样品分子在通过凝胶孔洞分子在通过凝胶孔洞时，所受到的时，所受到的阻力就阻力就会和样品分子的大小会和样品分子的大小及形状有关。及形状有关。聚丙烯酰胺凝胶的优点聚丙烯酰胺凝胶的优点u在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；u化学性能稳定，与被分离物不发生化学反应；化学性能稳定，与被分离物不发生化学反应；u对对pHpH和温度变化较稳定；和温度变化较稳定；u几乎无电渗作用；几乎无电渗作用；u样品不易扩散，其灵敏度可达样品不易扩散，其灵敏度可达1010-6-6g g；u凝胶孔径可通过选择单体及交联剂的浓度调节；凝胶孔径可通过选择单体及交联剂的浓度调节；u分辨率高；分辨率高；PAGEPAGE应用范围广，可用于蛋白质、酶、核酸等生物分子的应用范围广，可用于蛋白质、酶、核酸等生物分子的分离、定性、定量及少量的制备，还可测定相对分子质量、分离、定性、定量及少量的制备还可测定相对分子质量、等电点等。等电点等。一些概念一些概念凝胶浓度和交联度凝胶浓度和交联度不连续胶与连续胶不连续胶与连续胶变性胶及非变性胶变性胶及非变性胶SDS(Sodium dodecyl sulfate)十二烷基磺酸钠凝胶的浓度和交联度凝胶的浓度和交联度凝胶浓度：凝胶浓度：T（Acr和Bis总浓度）=(a+b)/m.100%交联百分比：交联百分比：C（交联剂的百分比）=b/(a+b).100%a:Acr浓度；b:Bis浓度；m:缓冲液体积凝胶的浓度和交联度凝胶的浓度和交联度浓度和交联剂浓度决定胶的物理状态及分子筛的孔径的大小一般浓缩胶：一般浓缩胶：2-5%，a:b=20分离胶：分离胶：710%，a:b=40标准胶浓度：标准胶浓度：7%u在浓度为在浓度为7.5%7.5%的凝胶中，大多数生物体的凝胶中，大多数生物体内的蛋白质能得到满意的分离效果。因内的蛋白质能得到满意的分离效果。因此，把浓度为此，把浓度为7.5%7.5%凝胶称为标准胶凝胶称为标准胶。u对于一个未知样品，常用对于一个未知样品，常用7.5%7.5%的标准胶的标准胶或或4%-10%4%-10%的凝胶梯度来测试，而后选出的凝胶梯度来测试，而后选出适宜的凝胶浓度。适宜的凝胶浓度。连续胶与不连续胶连续胶与不连续胶:连续胶：连续胶：胶条胶条(胶板胶板)的浓度、的浓度、pH值、组成值、组成成份不变成份不变不连续胶不连续胶:胶条胶条(胶板胶板)的浓度、的浓度、pH值、组成值、组成成份变化成份变化连续胶的制胶过程与点样过程玻璃板(前,后)样本梳间隔条间隔条浓缩胶分离胶不连续胶的制胶过程与点样过程玻璃板(前,后)样本梳间隔条间隔条 电泳凝胶系統的組成：1电泳系統pH胶体浓度缓冲液上层(负极)缓冲液 2样品溶液 3浓缩胶 6.9 4分离胶 胶体 5下层(正极)缓冲液 Tris-HClTris-HClTris-glycine Tris-glycine Tris-glycine 8.3 8.3 8.3 8.3 5%7.520%-不连续胶有聚焦样品不连续胶有聚焦样品的作用的作用聚丙烯酰胺凝胶电泳原理聚丙烯酰胺凝胶电泳原理n n三种物理效应三种物理效应 样品浓缩效应样品浓缩效应 分子筛效应分子筛效应 电荷效应电荷效应三种物理效率使样品分离效果好，分辨率高三种物理效率使样品分离效果好，分辨率高三种物理效率使样品分离效果好，分辨率高三种物理效率使样品分离效果好，分辨率高（1 1）样品浓缩效应：）样品浓缩效应：由凝胶系统的不连续性产生。由凝胶系统的不连续性产生。由凝胶系统的不连续性产生。由凝胶系统的不连续性产生。凝胶孔径不连续性凝胶孔径不连续性凝胶孔径不连续性凝胶孔径不连续性 缓冲液离子成份的不连续性缓冲液离子成份的不连续性缓冲液离子成份的不连续性缓冲液离子成份的不连续性 p p p pH H H H的不连续性的不连续性的不连续性的不连续性 样品浓缩效应样品浓缩效应 凝胶孔径的不连续性凝胶孔径的不连续性 样品胶及浓缩胶为大孔胶；样品胶及浓缩胶为大孔胶；分离胶为小孔胶。分离胶为小孔胶。l在电场作用下，样品颗粒在大孔胶中泳动的阻力在电场作用下，样品颗粒在大孔胶中泳动的阻力小，移动速度快；当进入小孔胶时，受到的阻力小，移动速度快；当进入小孔胶时，受到的阻力大，移动速度减慢。大，移动速度减慢。l因而在两层凝胶交界处，样品迁移受阻而压缩成因而在两层凝胶交界处，样品迁移受阻而压缩成很窄的区带。很窄的区带。浓缩胶对蛋白质分子的集焦作用：分离胶浓缩胶样本8.96.9离子缺乏空间ABC+8.3 分子筛效应分子筛效应 大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。蛋白质进入蛋白质进入pH8.9pH8.9的同一孔径的分离胶后，分子小且为球的同一孔径的分离胶后，分子小且为球状的蛋白质分子所受阻力小，移动快，走在前面；反之，状的蛋白质分子所受阻力小，移动快，走在前面；反之，则阻力大，移动慢，走在后面，从而通过凝胶的分子筛则阻力大，移动慢，走在后面，从而通过凝胶的分子筛作用将各种蛋白质分成各自的区带。作用将各种蛋白质分成各自的区带。这种分子筛效应不同于柱层析中的分子筛效应，后者是大这种分子筛效应不同于柱层析中的分子筛效应，后者是大分子先从凝胶颗粒间的缝隙流出，小分子后流出。分子先从凝胶颗粒间的缝隙流出，小分子后流出。n图中圆球分别代图中圆球分别代表大、中、小表大、中、小3 3种种不同分子量的蛋白不同分子量的蛋白质。大、中、小分质。大、中、小分子分别滞留在与分子分别滞留在与分子大小相当的凝胶子大小相当的凝胶孔径中，不再前进，孔径中，不再前进，因而分离成因而分离成3 3个区个区带。带。电荷效应电荷效应 在在pH8.9pH8.9的分离胶中，各种带净电荷不同的蛋白的分离胶中，各种带净电荷不同的蛋白质有不同的迁移率。净电荷多，则迁移快；反质有不同的迁移率。净电荷多，则迁移快；反之，则慢。之，则慢。因此，各种蛋白质按电荷多少、相对分子质量因此，各种蛋白质按电荷多少、相对分子质量及形状，以一定顺序排成一个个区带，因而称及形状，以一定顺序排成一个个区带，因而称为区带电泳。为区带电泳。变性胶与非变性胶：变性胶与非变性胶：l变性胶：变性胶：胶电泳在蛋白质变性的状态下进胶电泳在蛋白质变性的状态下进行，主要指行，主要指SDS变性条件下进行；变性条件下进行；l非变性胶：非变性胶：电泳在蛋白质保持天然状态下电泳在蛋白质保持天然状态下进行，不加变性剂。进行，不加变性剂。3、SDS-PAGE电泳电泳SDSSDS即十二烷基硫酸钠即十二烷基硫酸钠(Sodium Dodecyl Sulfate(Sodium Dodecyl Sulfate，简，简称称SDS)SDS)是阴离子表面活性剂，它能以一定的比例和蛋白是阴离子表面活性剂，它能以一定的比例和蛋白质结合，形成一种质结合，形成一种SDS-SDS-蛋白质复合物。蛋白质复合物。此复合物可用具有此复合物可用具有SDSSDS的聚丙烯酰胺凝胶的聚丙烯酰胺凝胶(包括连续的和包括连续的和不连续的系统不连续的系统)电泳进行分离，通常把这种电泳称为电泳进行分离，通常把这种电泳称为SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称简称SDS-PAGE)SDS-PAGE)。它的主要用。它的主要用途是分离蛋白质和测定其分子量。途是分离蛋白质和测定其分子量。.SDS-PAGE.SDS-PAGE原理原理 u聚丙烯酰胺凝胶电泳能有效地把不同类型的蛋白质分开的聚丙烯酰胺凝胶电泳能有效地把不同类型的蛋白质分开的主要依据，是样品中各种物质的电荷和分子量的差异性。主要依据，是样品中各种物质的电荷和分子量的差异性。u而而SDSSDSPAGEPAGE的主要依据，则是各种物质分子量的差异性。的主要依据，则是各种物质分子量的差异性。因为当因为当SDSSDS与蛋白质结合后，蛋白质分子即带有大量的负电与蛋白质结合后，蛋白质分子即带有大量的负电荷，并远远超过了其原来的电荷，从而使天然蛋白质分子荷，并远远超过了其原来的电荷，从而使天然蛋白质分子问的电荷差别就降低乃至消除了。问的电荷差别就降低乃至消除了。与此同时蛋白质在与此同时蛋白质在SDSSDS作用下结构变得松散，形状趋向一致，作用下结构变得松散，形状趋向一致，所以各种所以各种SDSSDS一蛋白质复合物在电泳时产生的泳动率差异，一蛋白质复合物在电泳时产生的泳动率差异，就反映了分子量的差异就反映了分子量的差异。SDS-PAGESDS-PAGE与与PAGEPAGE有什么区别？有什么区别？SDS（十二烷基磺酸钠）（十二烷基磺酸钠）+蛋白蛋白线性复合物线性复合物使复合物所带负电荷远超过天然使复合物所带负电荷远超过天然蛋白本身电荷，蛋白本身电荷，消除了电荷效应消除了电荷效应，而而分子量占主导分子量占主导。H-CC-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-O-S-O-Na+HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHOONon-polarHydrophobic tailHydrophilic headSDS（C12H25NaO4S）Sodium Dodecyl SulfateSodium Dodecyl Sulfate十二烷基磺酸钠十二烷基磺酸钠 SDSSDS是一种是一种阴离子去污剂阴离子去污剂，它在水溶液中以单体和分子团的，它在水溶液中以单体和分子团的混合形式存在。这种阴离子去污剂混合形式存在。这种阴离子去污剂能破坏蛋白质分子之间以能破坏蛋白质分子之间以及与其他物质分子之间的非共价键，使蛋白质分子内的二硫及与其他物质分子之间的非共价键，使蛋白质分子内的二硫键被还原剂打开并不易再氧化，键被还原剂打开并不易再氧化，这就保证了蛋白质分子与这就保证了蛋白质分子与SDSSDS充分结合从而形成带负电荷的蛋白质充分结合从而形成带负电荷的蛋白质-SDS-SDS复合物。复合物。SDSProteinSDS and Proteins 蛋白质分子与蛋白质分子与SDSSDS充分结合后，所带上的充分结合后，所带上的SDSSDS负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量量，因而也就，因而也就掩盖或消除掩盖或消除了不同种类蛋白质分了不同种类蛋白质分子之间子之间原有的电荷差异原有的电荷差异。这样的蛋白质这样的蛋白质-SDS-SDS复合物在复合物在SDSSDS聚丙烯聚丙烯酰胺凝胶系统中的电泳迁移率便不再受蛋酰胺凝胶系统中的电泳迁移率便不再受蛋白质原有电荷和形状等因素的影响，而主白质原有电荷和形状等因素的影响，而主要取决于要取决于蛋白质分子量大小。蛋白质分子量大小。SDS-PAGEXYZ+SDSNative-PAGESDS-PAGE分子量 及 净电荷密度均影响泳动率只有 分子量 影响泳动率XYZ-+-SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGESDS-PAGE）缓冲液缓冲液样品缓冲液样品缓冲液凝胶缓冲液凝胶缓冲液电泳缓冲液电泳缓冲液1xSDS:1xSDS:50 mmol/L Tris-Hcl(PH6.8)50 mmol/L Tris-Hcl(PH6.8)100 mmol/L DTT100 mmol/L DTT2%SDS 0.1%2%SDS 0.1%溴酚蓝10%甘油Tris Tris 碱 用盐酸一次调PH成功0.1%SDS0.1%SDS1xTris 1xTris 甘氨酸:25 mmol/L Tris25 mmol/L Tris250 mmol/L 250 mmol/L 甘氨酸 (PH8.3)(PH8.3)0.1%SDS0.1%SDS主要试剂及相关问题：主要试剂及相关问题：1、Acr 和和 Bis 比例比例 29：1 ，此时分辨率最佳，此时分辨率最佳，凝胶成透明；避光室温，凝胶成透明；避光室温保存，隔几个月重配。保存，隔几个月重配。2、SDS 电泳级电泳级 10%母液，室温储备。母液，室温储备。3、分离胶、浓缩胶的、分离胶、浓缩胶的Tris 缓冲液缓冲液 PH 6.8 PH 8.8 神经毒！神经毒！刺激呼吸系统！刺激呼吸系统！主要试剂及相关问题：主要试剂及相关问题：4、TEMED(四甲基乙二胺四甲基乙二胺)通过催化过硫酸铵形成自由基，加速通过催化过硫酸铵形成自由基，加速Acr-Bis 聚合。聚合。低低PH聚合反应受到抑制。聚合反应受到抑制。5、过硫酸铵、过硫酸铵 提供引发聚合反应的自由基。提供引发聚合反应的自由基。10%4保存保存.6、Tris-Gly Buffer 吸入致命、挥发性强极其易燃，周围不得有明火！吸入致命、挥发性强极其易燃，周围不得有明火！每周新配！每周新配！安全！安全！凝胶浓度及其分离范围凝胶浓度及其分离范围丙烯酰胺浓度线性分离范围/kDa1512107.55.010-4312-6020-8036-9457-212SDS-PAGE SDS-PAGE 电泳装置电泳装置电泳装置电泳装置实验步骤实验步骤安装玻璃板安装玻璃板灌注分离胶灌注分离胶加水膜加水膜约约30min 后，胶凝聚后用水清洗几遍！并吸干残存的液体后，胶凝聚后用水清洗几遍！并吸干残存的液体灌注浓缩胶灌注浓缩胶灌满！灌满！根据需要插入不同的梳子根据需要插入不同的梳子30min左右加电泳缓冲液，再拔梳子！左右加电泳缓冲液，再拔梳子！拔梳子后形成点样孔拔梳子后形成点样孔孔周围有膜，用针拨开孔周围有膜，用针拨开点样，电泳点样，电泳-+蛋白质电泳中蛋白质电泳中SDS凝胶检测常采用的染色方法有凝胶检测常采用的染色方法有:考马斯亮蓝、硝酸银染色、荧光染色法。考马斯亮蓝、硝酸银染色、荧光染色法。染色液配制：染色液配制：0.1%考马斯亮蓝考马斯亮蓝R250 (先用甲醇充分溶解先用甲醇充分溶解)50%甲醇甲醇 10%冰乙酸冰乙酸 40%蒸馏水蒸馏水 滤纸过滤滤纸过滤脱色液配制：脱色液配制：10%甲醇甲醇 10%冰乙酸冰乙酸 80%蒸馏水蒸馏水5倍体积染色倍体积染色4小时以上，小时以上，脱色摇床，中间更换几次脱色液脱色摇床，中间更换几次脱色液硝酸银染色硝酸银染色银染的机制银染的机制:来来源于源于摄影银染技术摄影银染技术,是将蛋白分子是将蛋白分子结合的银离子还原作成金属银。结合的银离子还原作成金属银。优点优点:检测灵敏度高检测灵敏度高,较普通考马斯亮蓝染色灵敏度较普通考马斯亮蓝染色灵敏度要高要高50-100倍倍,可在蛋白质中找到含量较低的蛋白可在蛋白质中找到含量较低的蛋白,而而且所需的上样量较少且所需的上样量较少(每点仅需每点仅需0.1)。缺点缺点:可重复性差可重复性差 耗费人力耗费人力 质谱测定有一定的干扰质谱测定有一定的干扰 在某一在某一PHPH下，蛋白质分子在电场中不再下，蛋白质分子在电场中不再移动，即静电荷为零，则此移动，即静电荷为零，则此PHPH值即为该蛋白值即为该蛋白质的质的等电点。等电点。4 4、等电聚焦、等电聚焦聚丙烯酰胺等电聚焦电泳聚丙烯酰胺等电聚焦电泳(Isoelectric Focusing-(Isoelectric Focusing-PAGEPAGE，简称，简称IEF-PAGE)IEF-PAGE)：利用各种蛋白质：利用各种蛋白质pIpI不同，以不同，以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持物，并在其中加入两性聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持物，并在其中加入两性电解质载体电解质载体(carrier ampholytes)(carrier ampholytes)，两性电解质载，两性电解质载体在电场作用下，按各自体在电场作用下，按各自pIpI形成从阳极到阴极逐渐形成从阳极到阴极逐渐增加的平滑和连续的增加的平滑和连续的pHpH梯度。在电场作用下，蛋白梯度。在电场作用下，蛋白质在此质在此pHpH梯度凝胶中泳动，当迁移至梯度凝胶中泳动，当迁移至pHpH值等于值等于pIpI处处时，就不再泳动，而被浓缩成狭窄的区带。时，就不再泳动，而被浓缩成狭窄的区带。PI2 PI3 PI1+-+-+-PH增加+_蛋白质 123蛋白质在电场中，等点聚焦示意图蛋白质在电场中，等点聚焦示意图电泳系统中加进两性电解质载体，当通已直流电泳系统中加进两性电解质载体，当通已直流电时，两性电解质载体即形成一个电时，两性电解质载体即形成一个由阳极到阴由阳极到阴极连续增高的极连续增高的pH梯度梯度。Pr进入时，不同的进入时，不同的Pr移移动到与其等电点相当的动到与其等电点相当的pH位置上，从而使不同位置上，从而使不同等电点的等电点的Pr得以分离。得以分离。优点优点：分辨率高，区带清晰、窄，加样部位自：分辨率高，区带清晰、窄，加样部位自由，重现性好，可测定由，重现性好，可测定Pr或多肽的等电点。或多肽的等电点。缺点缺点：需无盐溶液，不适用于在等电点不溶解：需无盐溶液，不适用于在等电点不溶解或发生变性的或发生变性的Pr。第二向第二向根据蛋白质的分根据蛋白质的分子量大小不同子量大小不同在垂直方向在垂直方向或水平方向进行十二烷基或水平方向进行十二烷基磺酸钠磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶电泳（电泳（SDS-PAGE)SDS-PAGE)5、双向电泳、双向电泳第一向第一向根据蛋白质的等根据蛋白质的等电点不同电点不同在在PHPH梯度胶中等梯度胶中等点聚焦（点聚焦（isoelectric isoelectric focusing,IEF)focusing,IEF)蛋白质双向电泳中蛋白质双向电泳中SDS凝胶检测常采用的染色方法凝胶检测常采用的染色方法有有考马斯亮蓝、硝酸银染色、荧光染色法、免疫染考马斯亮蓝、硝酸银染色、荧光染色法、免疫染色法以及蛋白质印迹法。色法以及蛋白质印迹法。染染 色色6、变性梯度凝胶电泳、变性梯度凝胶电泳变性梯度凝胶电泳（变性梯度凝胶电泳（denaturing gel gradient electrophoresis，DGGE）温度梯度凝胶电泳（温度梯度凝胶电泳（Temperature gradient gel electrophoresis，TGGE）恒定变性胶电泳（恒定变性胶电泳（Constant deratarared gel electrophoresis，CDGE）分离原理：分离原理：DGGE、CGGE及及TGGE三种方法是基于相同的原理三种方法是基于相同的原理而设计的突变检测方法，它仍均是根据而设计的突变检测方法它仍均是根据DNA的解链的解链特性而设计特性而设计。对于同一定序列组成或的对于同一定序列组成或的DNA片段来说，它具有恒片段来说，它具有恒定的解链温度（定的解链温度（Tm），但若其序列发生改变时，），但若其序列发生改变时，Tm值亦发生改变，在含有变性因素（变性剂，高温）的值亦发生改变，在含有变性因素（变性剂，高温）的凝胶中进行电泳，当其比链解开形成分叉时，电泳迁凝胶中进行电泳，当其比链解开形成分叉时，电泳迁移的速度就会改变。移的速度就会改变。Tm值主要取决于值主要取决于DNA的碱基组成，序列中出现单碱的碱基组成，序列中出现单碱基替换时，基替换时，Tm亦发生改变，电泳迁移率亦改变，此亦发生改变电泳迁移率亦改变，此即即DGGE、CDGE及及TGGE鉴定突变的技术基础。鉴定突变的技术基础。四、电泳技术问题及对策四、电泳技术问题及对策1.低离子溶液中低离子溶液中,不同电荷的蛋白质分子间不同电荷的蛋白质分子间会发生会发生相互静电作用相互静电作用.增加溶液离子强度增加溶液离子强度可减少这种作用可减少这种作用,但会提高电泳时的电流但会提高电泳时的电流,使产热更多使产热更多,温度升高又促进蛋白质的扩温度升高又促进蛋白质的扩散散,使区带变宽使区带变宽,分辨率下降分辨率下降.因此电泳缓冲因此电泳缓冲液的液的离子强度离子强度必须控制适当必须控制适当.0.02-0.2M 的离子强度的离子强度离子强度低离子强度低,速度快速度快,发热低发热低,有电渗有电渗离子强度高离子强度高,速度慢速度慢,发热大发热大电泳技术问题及对策2.蛋白质分子所带净电荷主要取决于电泳缓蛋白质分子所带净电荷主要取决于电泳缓冲液的冲液的pH值值,应仔细调整和控制电泳缓冲应仔细调整和控制电泳缓冲液的液的pH值值,使各组分分子的净电荷数差异使各组分分子的净电荷数差异加大加大.但极端但极端pH下蛋白质会变性失活下蛋白质会变性失活,因此因此一般控制在一般控制在pH4.59.5之间之间;电泳技术问题及对策3.缓冲液的种类缓冲液的种类,浓度和其他电解质浓浓度和其他电解质浓度影响蛋白质所带电荷的极性和数量度影响蛋白质所带电荷的极性和数量同时还影响蛋白质分子间的相互作同时还影响蛋白质分子间的相互作用用,因此必须根据分离溶质的不同选因此必须根据分离溶质的不同选择择合适的缓冲系统合适的缓冲系统;电泳技术问题及对策4.表面活性剂表面活性剂(SDS等等)强烈破坏蛋白质强烈破坏蛋白质分子间的非共价作用分子间的非共价作用,使蛋白质分子使蛋白质分子为表面溶剂分子所包围为表面溶剂分子所包围,阻止了蛋白阻止了蛋白质之间的相互作用质之间的相互作用,同时也消除了不同时也消除了不同蛋白质固有的电荷差异同蛋白质固有的电荷差异;电泳技术问题及对策5.控制电泳介质的有效黏度控制电泳介质的有效黏度,包括选择适包括选择适当的凝胶孔径和添加能增加介质黏度当的凝胶孔径和添加能增加介质黏度的物质的物质;电泳技术问题及对策6.电泳过程发热量的控制电泳过程发热量的控制:发热的难题发热的难题:蛋白质变性蛋白质变性;蛋白质区带扩散蛋白质区带扩散,分辨率下降分辨率下降 对策对策:减少发热减少发热:降低电流降低电流,提高电压提高电压;提高传热提高传热表面积表面积;提高材质的传热系数提高材质的传热系数;提高冷却系提高冷却系统的温差统的温差.减少扩散减少扩散:增加缓冲系统或介质的黏度可增加缓冲系统或介质的黏度可以减少扩散以减少扩散;在微重力作用下进行电泳在微重力作用下进行电泳 五、电泳技术在生物技术研究上的应用五、电泳技术在生物技术研究上的应用主要是用于蛋白质和核酸类物质的分析和主要是用于蛋白质和核酸类物质的分析和分离分离;使用最广泛有效的是平板电泳使用最广泛有效的是平板电泳;包括琼脂糖包括琼脂糖,聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶,及及SDS-聚丙烯酰胺凝胶等聚丙烯酰胺凝胶等具有灵敏度高具有灵敏度高,重复性好重复性好,测定范围宽测定范围宽,适用适用性强性强,操作容易操作容易,结果直观结果直观,设备简单等优点设备简单等优点六、生物技术产品分离纯化上电泳技术的六、生物技术产品分离纯化上电泳技术的应用应用目前大规模的分离纯化电泳技术还处于发目前大规模的分离纯化电泳技术还处于发展阶段展阶段,一一.平板电泳平板电泳:水平平板电泳水平平板电泳;垂直平板电泳垂直平板电泳二二连续凝胶电泳连续凝胶电泳:三三.等电聚焦电泳等电聚焦电泳:四四.连续流动电泳连续流动电泳五五.无载体连续流动电泳无载体连续流动电泳思考题 a)决定蛋白质分子的净电荷为正电或负电，受那些因素影响？b)那些因素会影响蛋白质分子，在电场中的泳动速率？c)凝胶溶液的成分有那些？各有什么作用？那一种有毒性？d)浓缩胶如何使样品蛋白质焦聚成一薄层？e)是否所有蛋白质分子均由负极向正极泳动？在什么情况下会有例外？f)电泳进行时会发热，有无必要通冷水冷却之？在何种情况下有此必要？g)样品中若有大量的盐分，对电泳会有什么影响？h)SDS-PAGE与non-denaturing PAGE在原理与应用上，有何异同？