-人工染色体载体.pptx

2024/11/17 周日12024/11/17 周日2利用染色体的复制元件来驱动外源利用染色体的复制元件来驱动外源利用染色体的复制元件来驱动外源利用染色体的复制元件来驱动外源DNADNA片段复片段复片段复片段复制的载体称为制的载体称为制的载体称为制的载体称为人工染色体载体人工染色体载体。人工染色体载体人工染色体载体:模拟染色体的复制方式，因此都能装载大片模拟染色体的复制方式，因此都能装载大片模拟染色体的复制方式，因此都能装载大片模拟染色体的复制方式，因此都能装载大片段的段的段的段的DNADNA片段。片段。片段。片段。2024/11/17 周日3vvv目前常用的人造染色体载体包括：目前常用的人造染色体载体包括：目前常用的人造染色体载体包括：目前常用的人造染色体载体包括：细菌人工染色体载体（细菌人工染色体载体（细菌人工染色体载体（细菌人工染色体载体（BACBAC）酵母人工染色体载体（酵母人工染色体载体（酵母人工染色体载体（酵母人工染色体载体（YACYAC）黏粒载体（黏粒载体（黏粒载体（黏粒载体（cosmid）P1P1人工染色体载体（人工染色体载体（人工染色体载体（人工染色体载体（PACPAC）2024/11/17 周日4pHC79pHC796400 bp6400 bpTcTcr rl l l l fragmentfragmentcoscosorioriApApr rPstIPstIBamHIBamHISalISalIvv19781978年年年年J.Collins和和B.Hohn等人等人发明发明发明发明构建构建构建构建1.8 kb1.8 kb的的的的l l l l-DNADNA片段片段片段片段 +pBR322+pBR322片段装载范围为片段装载范围为片段装载范围为片段装载范围为31-31-45 kb45 kb。第一节第一节 黏粒黏粒（cosmidcosmid）载体载体2024/11/17 周日5第一节第一节 黏粒黏粒（cosmidcosmid）载体载体黏粒克隆载体黏粒克隆载体黏粒克隆载体黏粒克隆载体（柯斯质粒载体柯斯质粒载体柯斯质粒载体柯斯质粒载体）实际上是质粒的衍实际上是质粒的衍实际上是质粒的衍实际上是质粒的衍生物，是由英文生物，是由英文生物，是由英文生物，是由英文“cos site-carrying cos site-carrying plasmid”plasmid”缩写而成缩写而成缩写而成缩写而成的，其原意是指的，其原意是指的，其原意是指的，其原意是指带带带带coscos位点的质粒。位点的质粒。位点的质粒。位点的质粒。pHC79pHC796400 bp6400 bpTcTcr rl l l l fragmentfragmentcoscosorioriApApr rPstIPstIBamHIBamHISalISalI2024/11/17 周日6考斯质粒考斯质粒（cosmidcosmid）=质粒质粒质粒质粒+cos+cos序列。序列。序列。序列。pHC79pHC796400 bp6400 bpTcTcr rl l l l fragmentfragmentcoscosorioriApApr rPstIPstIBamHIBamHISalISalIuu它是用正常的质粒同它是用正常的质粒同它是用正常的质粒同它是用正常的质粒同 噬菌体的噬菌体的噬菌体的噬菌体的coscos位点构成。位点构成。位点构成。位点构成。uu coscos序列是序列是序列是序列是l l l l噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNA DNA 中将中将中将中将DNADNA包装到噬包装到噬包装到噬包装到噬菌体颗粒中所需的菌体颗粒中所需的菌体颗粒中所需的菌体颗粒中所需的DNADNA序列。序列。序列。序列。2024/11/17 周日7黏粒黏粒黏粒黏粒它的大小一般它的大小一般它的大小一般它的大小一般 5-7kb 5-7kb 左左左左右，用来克隆大片段右，用来克隆大片段右，用来克隆大片段右，用来克隆大片段 DNADNA。克隆的最大克隆的最大克隆的最大克隆的最大 DNA DNA 片段可达片段可达片段可达片段可达45kb45kb。质粒复制起点（质粒复制起点（质粒复制起点（质粒复制起点（colE1colE1）象象象象质粒一样转化和增殖。质粒一样转化和增殖。质粒一样转化和增殖。质粒一样转化和增殖。抗性标记抗性标记抗性标记抗性标记AmpAmpr r。coscos位点。有的粘粒载体含位点。有的粘粒载体含位点。有的粘粒载体含位点。有的粘粒载体含有有有有2 2个个个个coscos位点。位点。位点。位点。pHC79pHC796400 bp6400 bpTcTcr rl l l l fragmentfragmentcoscosorioriApApr rPstIPstIBamHIBamHISalISalI一、黏粒的结构特征和用途一、黏粒的结构特征和用途2024/11/17 周日8一、黏粒的结构特征和用途一、黏粒的结构特征和用途vv能像能像能像能像l l l l-DNADNA那样进行体外包装，并高效转染受那样进行体外包装，并高效转染受那样进行体外包装，并高效转染受那样进行体外包装，并高效转染受体细胞；体细胞；体细胞；体细胞；vv能像质粒那样在受体细胞中自主复制；能像质粒那样在受体细胞中自主复制；能像质粒那样在受体细胞中自主复制；能像质粒那样在受体细胞中自主复制；vv重组操作简便，筛选容易；重组操作简便，筛选容易；重组操作简便，筛选容易；重组操作简便，筛选容易；vv装载量大装载量大装载量大装载量大（45 kb45 kb）且克隆片段具有一定的大小且克隆片段具有一定的大小且克隆片段具有一定的大小且克隆片段具有一定的大小范围；范围；范围；范围；vv不能体内包装，不裂解受体细胞。不能体内包装，不裂解受体细胞。不能体内包装，不裂解受体细胞。不能体内包装，不裂解受体细胞。二、二、构建构建cosmid克隆载体的策略克隆载体的策略根据根据根据根据 噬菌体克隆载体和质粒克隆载体两者的噬菌体克隆载体和质粒克隆载体两者的噬菌体克隆载体和质粒克隆载体两者的噬菌体克隆载体和质粒克隆载体两者的这些性质，取长去短，设计由这些性质，取长去短，设计由这些性质，取长去短，设计由这些性质，取长去短，设计由质粒质粒质粒质粒和含有和含有和含有和含有coscos位点位点位点位点的这种的这种的这种的这种DNADNA片段组装成一类新的克隆载体，即片段组装成一类新的克隆载体，即片段组装成一类新的克隆载体，即片段组装成一类新的克隆载体，即cosmidcosmid克隆载体克隆载体克隆载体克隆载体。由由由由DNADNA片段和片段和片段和片段和pBR322pBR322质粒质粒质粒质粒DNADNA联合组成的。联合组成的。联合组成的。联合组成的。c co os smmi id d载载载载体体体体 -pHC792024/11/17 周日11pBR322质粒质粒(p43)用用用用 噬菌体基因组的噬菌体基因组的噬菌体基因组的噬菌体基因组的crorcror的的的的BglBgl限制片限制片限制片限制片段，取代段，取代段，取代段，取代pBR322pBR322质粒质粒质粒质粒DNADNA的位于的位于的位于的位于1 4591 4591 1 666bp666bp之间的之间的之间的之间的Sau3ASau3A片段，产生出具有片段，产生出具有片段，产生出具有片段，产生出具有BglBgl单单单单切割位点切割位点切割位点切割位点的重组体分子。的重组体分子。的重组体分子。的重组体分子。然后通过然后通过然后通过然后通过这个位点这个位点这个位点这个位点，将带有，将带有，将带有，将带有coscos序列序列序列序列、长度、长度、长度、长度为为为为1.78kb1.78kb的的的的DNADNA之之之之BglBgl片段片段片段片段插入进去，于是得插入进去，于是得插入进去，于是得插入进去，于是得到了到了到了到了pHC79pHC79柯斯质粒柯斯质粒柯斯质粒柯斯质粒.DNADNA片段除了片段除了片段除了片段除了coscos位点之外，在其两侧还位点之外，在其两侧还位点之外，在其两侧还位点之外，在其两侧还具有与噬菌体包装有关具有与噬菌体包装有关具有与噬菌体包装有关具有与噬菌体包装有关的的的的DNADNA短序列；短序列；短序列；短序列；质粒质粒质粒质粒DNADNA部部部部分则是一个完整的分则是一个完整的分则是一个完整的分则是一个完整的复制子。复制子。复制子。复制子。克隆能力为克隆能力为克隆能力为克隆能力为313145kb45kb，而且能够被包，而且能够被包，而且能够被包，而且能够被包装成为具有感染性能装成为具有感染性能装成为具有感染性能装成为具有感染性能的噬菌体颗粒的噬菌体颗粒。的噬菌体颗粒。的噬菌体颗粒。三、三、cosmid克隆载体的特征克隆载体的特征构建的构建的构建的构建的cosmidcosmid克隆载体是一种环形双链克隆载体是一种环形双链克隆载体是一种环形双链克隆载体是一种环形双链DNADNA分子，分子，分子，分子，般在般在般在般在5-7kb5-7kb。cosmidcosmid克隆载体具有质粒的性质。克隆载体具有质粒的性质。克隆载体具有质粒的性质。克隆载体具有质粒的性质。包括以下包括以下包括以下包括以下4 4个方面个方面个方面个方面cosmidcosmid克隆载体具有质粒的复制子，在大肠克隆载体具有质粒的复制子，在大肠克隆载体具有质粒的复制子，在大肠克隆载体具有质粒的复制子，在大肠杆菌细胞内按质粒复制的方式进行复制，具有转杆菌细胞内按质粒复制的方式进行复制，具有转杆菌细胞内按质粒复制的方式进行复制，具有转杆菌细胞内按质粒复制的方式进行复制，具有转化大肠杆菌的功能，并且在氨苄青霉素作用下，化大肠杆菌的功能，并且在氨苄青霉素作用下，化大肠杆菌的功能，并且在氨苄青霉素作用下，化大肠杆菌的功能，并且在氨苄青霉素作用下，同样也会获得扩增。同样也会获得扩增。同样也会获得扩增。同样也会获得扩增。cosmidcosmid克隆载体通常也具抗菌素抗性基因，克隆载体通常也具抗菌素抗性基因，克隆载体通常也具抗菌素抗性基因，克隆载体通常也具抗菌素抗性基因，作为重组体分子表型选择标记。其中有一些还带作为重组体分子表型选择标记。其中有一些还带作为重组体分子表型选择标记。其中有一些还带作为重组体分子表型选择标记。其中有一些还带上基因插入失活的克隆位点。上基因插入失活的克隆位点。上基因插入失活的克隆位点。上基因插入失活的克隆位点。具有具有具有具有 噬菌体的特性。在此克隆载体上含有一噬菌体的特性。在此克隆载体上含有一噬菌体的特性。在此克隆载体上含有一噬菌体的特性。在此克隆载体上含有一个个个个coscos位点。位点。位点。位点。cosmidcosmid克隆载体在克隆了合适长度的外源克隆载体在克隆了合适长度的外源克隆载体在克隆了合适长度的外源克隆载体在克隆了合适长度的外源DNADNA，并在体外包装成噬菌体颗粒之后，可以，并在体外包装成噬菌体颗粒之后，可以，并在体外包装成噬菌体颗粒之后，可以，并在体外包装成噬菌体颗粒之后，可以高效地转导对高效地转导对高效地转导对高效地转导对 噬菌体敏感的大肠杆菌寄主细胞。噬菌体敏感的大肠杆菌寄主细胞。噬菌体敏感的大肠杆菌寄主细胞。噬菌体敏感的大肠杆菌寄主细胞。进入寄主细胞之后的进入寄主细胞之后的进入寄主细胞之后的进入寄主细胞之后的cosmidcosmid克隆载体克隆载体克隆载体克隆载体DNADNA分子，便按照分子，便按照分子，便按照分子，便按照 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNADNA同样的方式环化起同样的方式环化起同样的方式环化起同样的方式环化起来。来。来。来。但由于但由于但由于但由于cosmidcosmid克隆载体并不含有克隆载体并不含有克隆载体并不含有克隆载体并不含有 噬菌体的全噬菌体的全噬菌体的全噬菌体的全部必要基因，因此它不能通过溶菌周期，无部必要基因，因此它不能通过溶菌周期，无部必要基因，因此它不能通过溶菌周期，无部必要基因，因此它不能通过溶菌周期，无法形成子代噬菌体颗粒。法形成子代噬菌体颗粒。法形成子代噬菌体颗粒。法形成子代噬菌体颗粒。外源片段克隆在黏粒载体中是以大肠杆菌菌外源片段克隆在黏粒载体中是以大肠杆菌菌外源片段克隆在黏粒载体中是以大肠杆菌菌外源片段克隆在黏粒载体中是以大肠杆菌菌落的形式表现出来的，而不是噬菌斑。落的形式表现出来的，而不是噬菌斑。落的形式表现出来的，而不是噬菌斑。落的形式表现出来的，而不是噬菌斑。构建的构建的构建的构建的cosmidcosmid克隆载体较小，因此能承载比较克隆载体较小，因此能承载比较克隆载体较小，因此能承载比较克隆载体较小，因此能承载比较大的外源大的外源大的外源大的外源DNADNA片段。片段。片段。片段。如果如果如果如果cosmidcosmid克隆载体的大小为克隆载体的大小为克隆载体的大小为克隆载体的大小为6.5 kb6.5 kb，按入噬，按入噬，按入噬，按入噬菌体容许菌体容许菌体容许菌体容许包装包装包装包装的的的的量量量量计算，能承载的外源计算，能承载的外源计算，能承载的外源计算，能承载的外源DNADNA片段片段片段片段最大可达最大可达最大可达最大可达44.5 kb(44.5 kb(即即即即51 kb51 kb6.5 kb)6.5 kb)，最小的也有，最小的也有，最小的也有，最小的也有29.9kb(29.9kb(即即即即36.4kb36.4kb6.5kb6.5kb)，所以用这样的，所以用这样的，所以用这样的，所以用这样的cosmidcosmid克克克克隆载体能克隆隆载体能克隆隆载体能克隆隆载体能克隆40kb40kb左右的外源左右的外源左右的外源左右的外源DNADNA片段。片段。片段。片段。四、四、cosmid克隆载体的工作原理克隆载体的工作原理cosmidcosmid克隆载体具有质粒克隆载体的性克隆载体具有质粒克隆载体的性克隆载体具有质粒克隆载体的性克隆载体具有质粒克隆载体的性质，可以按一般质粒克隆载体进行操作，转质，可以按一般质粒克隆载体进行操作，转质，可以按一般质粒克隆载体进行操作，转质，可以按一般质粒克隆载体进行操作，转化受体细胞，可在受体细胞内进行自行复制。化受体细胞，可在受体细胞内进行自行复制。化受体细胞，可在受体细胞内进行自行复制。化受体细胞，可在受体细胞内进行自行复制。实际上，使用实际上，使用实际上，使用实际上，使用cosmidcosmid克隆载体主要利用它克隆载体主要利用它克隆载体主要利用它克隆载体主要利用它的的的的 噬菌体克隆载体性质噬菌体克隆载体性质噬菌体克隆载体性质噬菌体克隆载体性质。因为因为因为因为cosmidcosmid克隆载体含有克隆载体含有克隆载体含有克隆载体含有coscos位点，可位点，可位点，可位点，可承载大的承载大的承载大的承载大的DNADNA片段，进行体外包装后能高片段，进行体外包装后能高片段，进行体外包装后能高片段，进行体外包装后能高效率转导受体细胞效率转导受体细胞效率转导受体细胞效率转导受体细胞 。使用使用使用使用cosmidcosmid克隆载体的程序与使用克隆载体的程序与使用克隆载体的程序与使用克隆载体的程序与使用 噬菌噬菌噬菌噬菌体克隆载体的程序有所不同体克隆载体的程序有所不同体克隆载体的程序有所不同体克隆载体的程序有所不同 。作为作为作为作为 噬菌体克隆载体，线形重组噬菌体克隆载体，线形重组噬菌体克隆载体，线形重组噬菌体克隆载体，线形重组DNADNA分分分分子两端必须各有一个子两端必须各有一个子两端必须各有一个子两端必须各有一个coscos末端。而末端。而末端。而末端。而cosmidcosmid克隆载克隆载克隆载克隆载体只有一个体只有一个体只有一个体只有一个coscos位点，因此必须先对位点，因此必须先对位点，因此必须先对位点，因此必须先对cosmidcosmid克隆克隆克隆克隆载体进行适当处理，构成具有两个载体进行适当处理，构成具有两个载体进行适当处理，构成具有两个载体进行适当处理，构成具有两个coscos位点的二位点的二位点的二位点的二联体线形联体线形联体线形联体线形DNADNA分子。分子。分子。分子。当外源当外源当外源当外源DNADNA片段组入二联体线形片段组入二联体线形片段组入二联体线形片段组入二联体线形DNADNA分子，分子，分子，分子，并且两个并且两个并且两个并且两个coscos位点之间的位点之间的位点之间的位点之间的DNADNA核苷酸序列达到足核苷酸序列达到足核苷酸序列达到足核苷酸序列达到足够长时，两个够长时，两个够长时，两个够长时，两个coscos位点可被位点可被位点可被位点可被A A蛋白切割，产生具蛋白切割，产生具蛋白切割产生具蛋白切割，产生具有两个有两个有两个有两个coscos末端的重组末端的重组末端的重组末端的重组DNADNA分子，就能进行有分子，就能进行有分子，就能进行有分子，就能进行有效的体外包装。效的体外包装。效的体外包装。效的体外包装。使用使用cosmid克隆载体的基本程序是：克隆载体的基本程序是：先用一种限制性核酸内切酶切割先用一种限制性核酸内切酶切割先用一种限制性核酸内切酶切割先用一种限制性核酸内切酶切割cosmidcosmid克隆载体克隆载体克隆载体克隆载体 具有两个具有两个具有两个具有两个coscos位点的二联体线形位点的二联体线形位点的二联体线形位点的二联体线形DNADNA分子分子分子分子 DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶 切割二联体线形切割二联体线形切割二联体线形切割二联体线形DNADNA分子和部分切割待克隆的外源分子和部分切割待克隆的外源分子和部分切割待克隆的外源分子和部分切割待克隆的外源DNADNA片段片段片段片段 成为可用于体外包装的样品成为可用于体外包装的样品成为可用于体外包装的样品成为可用于体外包装的样品 DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶不管是不管是不管是不管是(a)(a)程序还是程序还是程序还是程序还是(b)(b)程序，最后获得的重程序，最后获得的重程序，最后获得的重程序，最后获得的重组线形组线形组线形组线形DNADNA分子必须保留质粒的复制起始位点分子必须保留质粒的复制起始位点分子必须保留质粒的复制起始位点分子必须保留质粒的复制起始位点(ori)(ori)和选择标记基因，保证重组的线形和选择标记基因，保证重组的线形和选择标记基因，保证重组的线形和选择标记基因，保证重组的线形DNADNA分分分分子导入受体细胞后，子导入受体细胞后，子导入受体细胞后，子导入受体细胞后，coscos末端自行连接环化，按末端自行连接环化，按末端自行连接环化，按末端自行连接环化，按质粒的性质进行自主复制，并且有效地表达选质粒的性质进行自主复制，并且有效地表达选质粒的性质进行自主复制，并且有效地表达选质粒的性质进行自主复制，并且有效地表达选择标记基因的产物，供筛选阳性克隆子。择标记基因的产物，供筛选阳性克隆子。择标记基因的产物，供筛选阳性克隆子。择标记基因的产物，供筛选阳性克隆子。2024/11/17 周日27五、五、cosmid克隆载体（自学克隆载体（自学P72）vv常用的粘性粒有常用的粘性粒有常用的粘性粒有常用的粘性粒有PHC79PHC79、PJB8PJB8、MUA-3MUA-3和和和和KOSIKOSI等，它们大多具等，它们大多具等，它们大多具等，它们大多具有一种或多种限制性有一种或多种限制性有一种或多种限制性有一种或多种限制性内切酶的单一酶切位点。内切酶的单一酶切位点。内切酶的单一酶切位点内切酶的单一酶切位点。采用这种大容量采用这种大容量采用这种大容量采用这种大容量载体不仅可减少构建基因组载体不仅可减少构建基因组载体不仅可减少构建基因组载体不仅可减少构建基因组DNADNA文库的重文库的重文库的重文库的重组克隆数目，减少工作量，提高筛选时的组克隆数目，减少工作量，提高筛选时的组克隆数目，减少工作量，提高筛选时的组克隆数目，减少工作量，提高筛选时的阳性检出率，而且极其适合高等真核基因阳性检出率，而且极其适合高等真核基因阳性检出率，而且极其适合高等真核基因阳性检出率，而且极其适合高等真核基因的克隆工作。的克隆工作。的克隆工作。的克隆工作。2024/11/17 周日28六、六、构建构建cosmid文库应注意哪些问题文库应注意哪些问题vv载体分子的自身连接，从而导致效率降低载体分子的自身连接，从而导致效率降低载体分子的自身连接，从而导致效率降低载体分子的自身连接，从而导致效率降低或者失败。或者失败。或者失败。或者失败。载体自身只相当于可以插入片段的载体自身只相当于可以插入片段的载体自身只相当于可以插入片段的载体自身只相当于可以插入片段的1/101/10左右，左右，左右，左右，因此往往会出现因此往往会出现因此往往会出现因此往往会出现载体同载体自身连接载体同载体自身连接载体同载体自身连接载体同载体自身连接，结果，结果，结果，结果在一个重组分子内可有几个柯斯质粒载体连在一个重组分子内可有几个柯斯质粒载体连在一个重组分子内可有几个柯斯质粒载体连在一个重组分子内可有几个柯斯质粒载体连在一起。但用在一起。但用在一起。但用在一起。但用碱性磷酸酶处理，可阻止载体碱性磷酸酶处理，可阻止载体碱性磷酸酶处理，可阻止载体碱性磷酸酶处理，可阻止载体分子自身连接；分子自身连接；分子自身连接；分子自身连接；2024/11/17 周日29 大小不等的外源片段相互连接后插入同一个载体分子大小不等的外源片段相互连接后插入同一个载体分子大小不等的外源片段相互连接后插入同一个载体分子大小不等的外源片段相互连接后插入同一个载体分子。结果使在基因组内本来不是相邻的片段错乱地连接成一结果使在基因组内本来不是相邻的片段错乱地连接成一结果使在基因组内本来不是相邻的片段错乱地连接成一结果使在基因组内本来不是相邻的片段错乱地连接成一个片段，会影响实验结果的分析，后来专门选出个片段，会影响实验结果的分析，后来专门选出个片段，会影响实验结果的分析，后来专门选出个片段，会影响实验结果的分析，后来专门选出303045kb45kb的外源的外源的外源的外源DNADNA插入载体插入载体插入载体插入载体DNADNA，此时，此时，此时，此时，每个载体只可能每个载体只可能每个载体只可能每个载体只可能插入一个外源片段插入一个外源片段插入一个外源片段插入一个外源片段，因为如果二个片段，则将超过包装，因为如果二个片段，则将超过包装，因为如果二个片段，则将超过包装，因为如果二个片段，则将超过包装成噬菌体颗粒的限度；成噬菌体颗粒的限度；成噬菌体颗粒的限度；成噬菌体颗粒的限度；2024/11/17 周日30 细菌的菌落体积远大于噬菌斑，因此如用柯细菌的菌落体积远大于噬菌斑，因此如用柯细菌的菌落体积远大于噬菌斑，因此如用柯细菌的菌落体积远大于噬菌斑，因此如用柯斯质粒制备基因文库，则斯质粒制备基因文库，则斯质粒制备基因文库，则斯质粒制备基因文库，则筛选所需的含某一筛选所需的含某一筛选所需的含某一筛选所需的含某一DNADNA片段的菌落很费时间。片段的菌落很费时间。片段的菌落很费时间。片段的菌落很费时间。现虽建立了高密度菌落筛选法但由于柯斯现虽建立了高密度菌落筛选法，但由于柯斯现虽建立了高密度菌落筛选法，但由于柯斯现虽建立了高密度菌落筛选法，但由于柯斯质粒制成的基因文库常常不太稳定，质粒制成的基因文库常常不太稳定，质粒制成的基因文库常常不太稳定，质粒制成的基因文库常常不太稳定，插入的大插入的大插入的大插入的大片段外源片段外源片段外源片段外源DNADNA有可能通过同宿主基因组交换而有可能通过同宿主基因组交换而有可能通过同宿主基因组交换而有可能通过同宿主基因组交换而致丢失等，所以最常使用的还是噬菌体载体。致丢失等，所以最常使用的还是噬菌体载体。致丢失等，所以最常使用的还是噬菌体载体。致丢失等，所以最常使用的还是噬菌体载体2024/11/17 周日312024/11/17 周日32pYAC4pYAC4CEN4CEN4EcoRIEcoRIURA3URA3TELTELBamHIBamHITELTELorioriApApr rTRP1TRP1ARS1ARS1酵母人工染色体酵母人工染色体酵母人工染色体酵母人工染色体(yeast(yeast artificial chromosomeartificial chromosome，YAC)YAC)是一类酵母穿梭载体。是一类酵母穿梭载体。是一类酵母穿梭载体。是一类酵母穿梭载体。YACYAC具有具有具有具有自主复制序自主复制序自主复制序自主复制序列列列列、克隆位点克隆位点克隆位点克隆位点以及可在细菌以及可在细菌以及可在细菌以及可在细菌和酵母菌中和酵母菌中和酵母菌中和酵母菌中选择的标记基因选择的标记基因选择的标记基因选择的标记基因。此外，此外，此外，此外，YACYAC还具有酵母菌染还具有酵母菌染还具有酵母菌染还具有酵母菌染色体的一些特点。可以接受色体的一些特点。可以接受色体的一些特点。可以接受色体的一些特点。可以接受100-1000kb100-1000kb的外源的外源的外源的外源DNADNA片段。片段。片段。片段。第二节第二节 酵母人工染色体载体酵母人工染色体载体2024/11/17 周日33pYAC4pYAC4CEN4CEN4EcoRIEcoRIURA3URA3TELTELBamHIBamHITELTELorioriApApr rTRP1TRP1ARS1ARS1这种人工染色体克隆载这种人工染色体克隆载这种人工染色体克隆载这种人工染色体克隆载体实际上是一种体实际上是一种体实际上是一种体实际上是一种“穿梭穿梭穿梭穿梭”克克克克隆载体，含有质粒克隆载体隆载体，含有质粒克隆载体隆载体，含有质粒克隆载体隆载体，含有质粒克隆载体所必备的所必备的所必备的所必备的第一受体第一受体第一受体第一受体(大肠杆大肠杆大肠杆大肠杆菌菌菌菌)源源源源质粒复制起始位点质粒复制起始位点质粒复制起始位点质粒复制起始位点(ori)(ori)，还含有，还含有，还含有，还含有第二受体第二受体第二受体第二受体(如如如如酵母菌酵母菌酵母菌酵母菌)染色体染色体染色体染色体DNADNA着丝点、着丝点、着丝点、着丝点、端粒和复制起始位点端粒和复制起始位点端粒和复制起始位点端粒和复制起始位点的序列，的序列，的序列，的序列，以及合适的以及合适的以及合适的以及合适的选择标记选择标记选择标记选择标记基因。基因。基因。基因。第二节第二节 酵母人工染色体载体酵母人工染色体载体2024/11/17 周日34pYACpYAC4 4CEN4CEN4EcoRIEcoRIURA3URA3TELTELBamHIBamHITELTELorioriApApr rTRP1TRP1ARS1ARS1一、一、YAC载体的复制元件和标志基因载体的复制元件和标志基因YACYAC载体应含有下列元件：载体应含有下列元件：载体应含有下列元件：载体应含有下列元件：酵母染色体的端粒序列酵母染色体的端粒序列酵母染色体的端粒序列酵母染色体的端粒序列 酵母染色体的复制子酵母染色体的复制子酵母染色体的复制子酵母染色体的复制子酵母染色体的着丝粒序列酵母染色体的着丝粒序列酵母染色体的着丝粒序列酵母染色体的着丝粒序列 酵母系统的选择标记酵母系统的选择标记酵母系统的选择标记酵母系统的选择标记大肠杆菌的复制子标记大肠杆菌的复制子标记大肠杆菌的复制子标记大肠杆菌的复制子标记YACYAC载体的装载量为载体的装载量为载体的装载量为载体的装载量为250-400 kb250-400 kb|这样的克隆载体在第一受体细胞内可以按这样的克隆载体在第一受体细胞内可以按这样的克隆载体在第一受体细胞内可以按这样的克隆载体在第一受体细胞内可以按质粒复制形式进行高拷贝复制。质粒复制形式进行高拷贝复制。质粒复制形式进行高拷贝复制。质粒复制形式进行高拷贝复制。|这种克隆载体在体外与目的这种克隆载体在体外与目的这种克隆载体在体外与目的这种克隆载体在体外与目的DNADNA片段重组片段重组片段重组片段重组后，转化第二受体细胞，可在转化的细胞内后，转化第二受体细胞，可在转化的细胞内后，转化第二受体细胞，可在转化的细胞内后，转化第二受体细胞，可在转化的细胞内按染色体按染色体按染色体按染色体DNADNA复制的形式进行复制和传递。复制的形式进行复制和传递。复制的形式进行复制和传递。复制的形式进行复制和传递。筛选第一受体的克隆子，一般采用抗菌素筛选第一受体的克隆子，一般采用抗菌素筛选第一受体的克隆子，一般采用抗菌素筛选第一受体的克隆子，一般采用抗菌素抗性选择标记；抗性选择标记；抗性选择标记；抗性选择标记；筛选第二受体的克隆子，常用与受体互补筛选第二受体的克隆子，常用与受体互补筛选第二受体的克隆子，常用与受体互补筛选第二受体的克隆子，常用与受体互补的营养缺陷型的营养缺陷型的营养缺陷型的营养缺陷型。人工染色体克隆载体的人工染色体克隆载体的人工染色体克隆载体的人工染色体克隆载体的特点特点特点特点：能容纳长达能容纳长达能容纳长达能容纳长达1000 kb1000 kb甚至甚至甚至甚至3000 kb3000 kb的外源的外源的外源的外源DNADNA片段。片段。片段。片段。人工人工酵母酵母染色体克隆载体的构建染色体克隆载体的构建YAC(YAC(酵母人工染色体酵母人工染色体酵母人工染色体酵母人工染色体)克隆载体是最早构建克隆载体是最早构建克隆载体是最早构建克隆载体是最早构建成功的人工染色体克隆载体。成功的人工染色体克隆载体。成功的人工染色体克隆载体。成功的人工染色体克隆载体。将酵母染色体将酵母染色体将酵母染色体将酵母染色体DNADNA的端粒的端粒的端粒的端粒(TEL)(TEL)、DNADNA复制复制复制复制起点起点起点起点 (ARS)(ARS)和着丝粒和着丝粒和着丝粒和着丝粒(CEN)(CEN)以及必要的选择标记以及必要的选择标记以及必要的选择标记以及必要的选择标记(HISA4(HISA4和和和和TRPl)TRPl)基因序列克隆到大肠杆菌质粒基因序列克隆到大肠杆菌质粒基因序列克隆到大肠杆菌质粒基因序列克隆到大肠杆菌质粒pBR322pBR322中，构建成中，构建成中，构建成中，构建成YCAYCA克隆载体。克隆载体。克隆载体。克隆载体。2024/11/17 周日38pYAC4pYAC4CEN4CEN4EcoRIEcoRIURA3URA3TELTELBamHIBamHITELTELorioriApApr rTRP1TRP1ARS1ARS1二、二、YAC载体的工作原理载体的工作原理EcoRIEcoRIEcoRIEcoRIEcoRIEcoRIEcoRIEcoRIEcoRIBamHIBamHIBamHI连连连连连连接接接接接接转化酵母菌转化酵母菌转化酵母菌转化酵母菌转化酵母菌转化酵母菌重组酵母染色体重组酵母染色体重组酵母染色体重组酵母染色体重组酵母染色体重组酵母染色体此克隆载体的此克隆载体的此克隆载体的此克隆载体的sup4(sup4(抑制基因：抑制赭色抑制基因：抑制赭色抑制基因：抑制赭色抑制基因：抑制赭色表型表型表型表型 )基因上，组装了供插入外源基因上，组装了供插入外源基因上，组装了供插入外源基因上，组装了供插入外源DNADNA片段片段片段片段的克隆位。的克隆位。的克隆位。的克隆位。常用的常用的YAC克隆载体有克隆载体有3种：种：pYAC3pYAC3、pYAC4pYAC4和和和和pYAC5pYAC5。差别：差别：差别：差别：在在在在sup4sup4基因上的克隆位点不同，分别是基因上的克隆位点不同，分别是基因上的克隆位点不同，分别是基因上的克隆位点不同，分别是SnaBISnaBI、EcoRIEcoRI和和和和NotINotI。（红色，赤红色）（红色，赤红色）（红色，赤红色）（红色，赤红色）2024/11/17 周日40vv主要结构：主要结构：主要结构：主要结构：两个可在酵母菌中利用的选择基两个可在酵母菌中利用的选择基两个可在酵母菌中利用的选择基两个可在酵母菌中利用的选择基因，因，因，因，URA3URA3和和和和TRP1(TRP1(色氨酸合成基色氨酸合成基色氨酸合成基色氨酸合成基因因因因)；酵母菌着丝粒序列酵母菌着丝粒序列酵母菌着丝粒序列酵母菌着丝粒序列 (centromere4,CEN4)(centromere4,CEN4)；一个自主复制序列一个自主复制序列一个自主复制序列一个自主复制序列(ARS1)(ARS1)；两个来自嗜热四膜虫两个来自嗜热四膜虫两个来自嗜热四膜虫两个来自嗜热四膜虫 (Tetrahymenna thermophilp)(Tetrahymenna thermophilp)的末的末的末的末端重复序列端重复序列端重复序列端重复序列(TEL)(TEL)，以保持重组，以保持重组，以保持重组，以保持重组YACYAC为线状结构；为线状结构；为线状结构；为线状结构；YAC载体载体-pYAC42024/11/17 周日41在两个末端序列中间，有在两个末端序列中间，有在两个末端序列中间，有在两个末端序列中间，有一段填充序列一段填充序列一段填充序列一段填充序列(HIS3)(HIS3)，以，以，以，以便便便便pYAC4pYAC4在细菌细胞中稳在细菌细胞中稳在细菌细胞中稳在细菌细胞中稳定扩增；定扩增；定扩增；定扩增；AmpAmp抗性及细菌质粒复制抗性及细菌质粒复制抗性及细菌质粒复制抗性及细菌质粒复制原点；原点；原点；原点；一个一个一个一个EcoEcoRR克隆位点，该克隆位点，该克隆位点，该克隆位点，该位点位于酵母菌位点位于酵母菌位点位于酵母菌位点位于酵母菌Sup4 Sup4 tRNAtRNA基因内。基因内。基因内。基因内。克隆载体克隆载体克隆载体克隆载体pYAC4pYAC4首先用首先用首先用首先用EcoRIEcoRI和和和和BamHIBamHI双酶切割，获得均具双酶切割，获得均具双酶切割，获得均具双酶切割，获得均具BamHIBamHI和和和和EcoRIEcoRI切割末端的两个切割末端的两个切割末端的两个切割末端的两个DNADNA片段片段片段片段(双臂双臂双臂双臂)，随后把两端具，随后把两端具，随后把两端具，随后把两端具EcoRIEcoRI切割末端的外源切割末端的外源切割末端的外源切割末端的外源DNADNA与此与此与此与此双臂连接，构成酵母人工染色体。用电激仪把此双臂连接，构成酵母人工染色体。用电激仪把此双臂连接，构成酵母人工染色体。用电激仪把此双臂连接，构成酵母人工染色体。用电激仪把此人工染色体转化酵母受体细胞。人工染色体转化酵母受体细胞。人工染色体转化酵母受体细胞。人工染色体转化酵母受体细胞。在成功构建在成功构建在成功构建在成功构建pYAC4pYAC4克隆载体的基础上，进一克隆载体的基础上，进一克隆载体的基础上，进一克隆载体的基础上，进一步构建了人类人工染色体步构建了人类人工染色体步构建了人类人工染色体步构建了人类人工染色体(HAC)(HAC)克隆载体和哺乳克隆载体和哺乳克隆载体和哺乳克隆载体和哺乳动物人工染色体动物人工染色体动物人工染色体动物人工染色体(MAC)(MAC)克隆载体。克隆载体。克隆载体。克隆载体。pYAC4使用程序：使用程序：2024/11/17 周日44vvSup4Sup4基因编码赭色抑制基因编码赭色抑制基因编码赭色抑制基因编码赭色抑制Trp-Trp-tRNAtRNA，抑制赭色，抑制赭色，抑制赭色，抑制赭色表型表型表型表型(成为白色成为白色成为白色成为白色)。vv不含外源不含外源不含外源不含外源DNADNA片段的片段的片段的片段的pYAC4pYAC4载体转化酵母菌，载体转化酵母菌，载体转化酵母菌，载体转化酵母菌，转化子的菌落呈白色。转化子的菌落呈白色。转化子的菌落呈白色。转化子的菌落呈白色。vv带有插入的外源带有插入的外源带有插入的外源带有插入的外源DNADNA片段的片段的片段的片段的pYAC4pYAC4重组载体，重组载体，重组载体，重组载体，其其其其Sup4Sup4已经失活，结果转化酵母菌后所产生已经失活，结果转化酵母菌后所产生已经失活，结果转化酵母菌后所产生已经失活，结果转化酵母菌后所产生的转化子形成赭色菌落。的转化子形成赭色菌落。的转化子形成赭色菌落。的转化