鼠李糖脂发酵泡沫时空规律解析_张总平.pdf

第 卷第期 年月淮阴师范学院学报（自然科学版）（）鼠李糖脂发酵泡沫时空规律解析张总平，王嫣然，贺爱永，邱忠洋，徐宁（淮安新势畜牧服务有限公司，江苏 淮安 ；淮阴师范学院 化学化工学院，江苏 淮安 ）摘要：鼠李糖脂发酵过程中的泡沫控制是其商业化生产的关键技术 对鼠李糖脂发酵过程中的反应器内泡沫生成规律进行了考察，实验结果表明：发酵过程中泡沫量总体呈现为前期快速增加，达最大速率后逐渐减小，最后趋于稳定；发酵中前期单个气泡的体积大，是导致该时期泡沫量较大的重要原因 此外，细胞、蛋白等其他物质对鼠李糖脂发酵泡沫具有较显著的叠加效应，可使发酵液的起泡能力提升约 倍泡沫液膜中的鼠李糖脂可使液膜具有更高的强度，泡沫稳定性时长可达 ，起到了稳定气泡的作用关键词：鼠李糖脂；泡沫；泡沫控制；稳定性中图分类号：；文献标识码：文章编号：（）收稿日期：基金项目：江苏省科技厅科技计划指导性项目（）；江苏省区域现代农业与环境保护协同创新中心项目（）通信作者：徐宁，讲师，博士，研究方向为发酵工程引言表面活性剂（，简称）是一类能显著改变表面界面性质的重要精细化学品自 世纪 年代开始，化工合成生产的表面活性剂逐渐被广泛用于石油、工业、曰用化学品、食品、医药工业等领域，被誉为“工业味精”当前，随着人们生态环保意识逐渐增强，表面活性剂的“绿色化与功能化”成为行业发展的主题生物表面活性剂化学结构更复杂，功能基团更多，表面活性功能更丰富，且产品本身无毒无害、具有较好的生物相容性、可生物降解性，是典型的环保型“绿色产品”在已发现的生物表面活性剂中，鼠李糖脂以其结构多样、性能优异的特点获得了更多的关注，是目前研究较为深入，功能性较强的一种糖脂类生物表面活性剂目前，通过生产菌筛选与改良、代谢调控与优化发酵、高效生物反应器的开发等不同层面的研究，鼠李糖脂的产量已稳步提升然而，此类研究仍然停留在工艺研究的层面，究其原因主要是由于鼠李糖脂优越的界面性能，在通气和搅拌作用下易产生大量泡沫并快速积累，最终溢出发酵罐造成物料损失、传质受阻、染菌风险等一系列问题，严重影响了鼠李糖脂的发酵过程和生产效率 因此，研究和解决鼠李糖脂发酵过程中的泡沫控制问题，对推动鼠李糖脂以及生物表面活性剂的商业化生产具有重要意义本文通过对发酵中泡沫溢出速率的全程测定，考察鼠李糖脂发酵原位泡沫的时空规律；采用泡沫经典理论从起泡性和稳定性两个方面对其进行分析，探究影响泡沫控制的关键因素，为鼠李糖脂发酵过程的泡沫控制提供参考和依据材料和方法 菌株实验室保存的铜绿假单胞菌（.）培养基及发酵条件 液体培养基（）：酵母提取物，蛋白胨，氯化钠 固体培养基：在液体培养基中加入 琼脂粉配制 固体培养基DOI:10.16119/ki.issn1671-6876.2023.01.011鼠李糖脂发酵培养基（）：菜籽油 ，酵母提取物，鼠李糖脂发酵将保存于 的菌液解冻后，使用接种环划线接种，倒置于 恒温培养箱中培养培养 进行活化从活化平板上挑取单菌落接种到含有 培养基的试管中，于、条件下培养 将经过 试管活化后的菌液按 接种量接种到含有 培养基的 摇瓶中，于、条件下培养至 为 发酵培养基 灭菌 ，冷却；使用 的盐酸将 调至 ；将摇瓶培养的种子液接种至发酵罐内，接种量为；发酵过程中通气量为 发酵前 保持搅拌速度为 ；在发酵 会产生大量的泡沫，取样并记录泡沫体积，此时调整发酵罐搅拌速率为 至发酵结束（约 ）发酵参数测定生物量：取一定体积的发酵液置于已经烘干恒重的离心管中，离心收集菌体，生理盐水洗涤次，离心后菌体于 恒温烘箱中烘干至恒重，室温冷却称重得到生物量发酵液油脂：取 发酵液置于离心管中，加入 正己烷，剧烈震荡 充分萃取油脂，然后于 离心 使液体分层，使用移液器缓慢吸取上层正己烷置于已经烘干恒重的离心管中，置于 烘干至恒重，室温冷却称重得到油脂含量鼠李糖脂：鼠李糖脂浓度的测定方法采用蒽酮硫酸法 原位发酵液起泡能力在发酵过程中泡沫会通过发酵管尾气管排出发酵罐，此时在尾气管出口处用 量筒收集溢出的泡沫，收集泡沬时将泡沫沿壁滑下，记录 内泡沫积累的体积，作为发酵液起泡能力的参数泡沫第次溢出发酵罐并采集泡沫体积之后，每隔 采集一次泡沫数据由于泡沫连续溢出发酵罐，如果不加以控制会将发酵液全部排出因此，在测定某时间点的泡沫量后，采取添加消泡剂的方式对泡沫进行控制实验设置两个反应器同时进行发酵实验，其中号反应器考察原位发酵液的起泡能力，号反应器考察异位发酵液的起泡能力 异位发酵液起泡能力发酵液起泡能力考察：与原位泡沫起泡能力考察同样的时间点，获取发酵液，采用鼓泡法评价异位泡沫的起泡能力 泡沬柱为带体积刻度的直径 的玻璃圆筒，圆筒底部为 砂芯（孔径 ）具体操作步骤为：待测溶液在 的通气量下起泡 ，停止通气记录此时泡沫的体积，用以表征发酵液的异位起泡能力无菌体发酵液起泡能力考察：将上一步发酵液收集，离心 ，收集上层溶液至离心管中，按照第一步鼓泡法测定无菌体发酵液的起泡能力菌液起泡能力考察：将上一步分离得到的菌体用 生理盐水清洗次，离心 收集菌体，加入第一步等体积的无菌水，充分震荡均匀后按照第一步鼓泡法测定菌液的起泡能力 泡沫稳定性原位泡沫稳定性：测得 内泡沫积累的体积后将泡沫静置，并立即计时，待泡沫体积减少至时记录所需的时间异位泡沫稳定性：停止通气记录此时泡沫的体积，将泡沫静置并立即计时，待泡沫体积减少至时记录所需的时间 泡沫成分测定泡沫含水量：采用体积法测定 将收集到的泡沫静置至完全液化，称取液体的体积，即为泡沫中的第期王嫣然，等：鼠李糖脂发酵泡沫时空规律解析含水量（忽略菌体等少量固体的体积）泡沫成分测定：将从发酵罐中收集到的泡沫静置至完全液化，按照 发酵参数测定的方法测定生物量、鼠李糖脂含量、油脂含量结果与讨论 鼠李糖脂发酵泡沫时空规律发酵起始阶段，只有少量气泡泡漂浮于发酵液表面，气泡形成后会在短时间内破灭，没有积累形成泡沫 在发酵开始约后，泡沫的生成速率越来越快，开始慢慢积累并聚集在发酵液表面，从而导致反应器中泡沫的体积不断增加，泡沫的高度不断上升然后再经历约后，泡沫将占据发酵液上层整个空间，并 随 着 气 流 开 始 从 尾 气 出 口 溢 出 发 酵 罐 此 时，实 验 测 定 发 酵 液 中 鼠 李 糖 脂 的 浓 度 约 为 ，其结果与已有研究报道（）相一致泡沫从发酵 开始溢出反应器，实验测得一定时间内溢出泡沫的体积，来衡量此时发酵液的起泡性能，根据泡沫量的变化趋势，将整个发酵过程分为个阶段，如表所示 发酵过程中的泡沫量总体呈现前期快速增加，然后逐渐减小至稳定值的趋势在 之间，发酵液泡沫量从 快速增加至 ，增长速率达到 ；在接下来的 内，泡沫量会缓慢增加，平均增长速率为 ，低于 在第 左右，溢出泡沫的速度达到约 ，这是整个发酵过程中泡沫溢出的最大速度；在此之后，溢出泡沫的速度逐渐减小到稳定值（约 ），从 开始溢流泡沫体积始终稳定在 之间，不再有大幅度变化表发酵过程泡沫量时空规律阶段发酵时间泡沫量 特征规律 泡沫量快速增加，增长速率达到 泡沫量缓慢增加，平均增长速率为 ，左右溢出泡沫的速度达到峰值 泡沫量缓慢减少至稳定值 泡沫量基本稳定已有研究文献提出鼠李糖脂发酵泡沫量在发酵过程中是持续增加的 然而，通过对发酵泡沫溢出规律的考察，本研究发现在发酵过程中发酵罐中实际的原位泡沫量与异位测试结果有较大不同，其根本原因在于发酵过程中的体系复杂，影响泡沫量的因素较多 因此，本研究对发酵过程中泡沫的生成规律及其关键因素进行了分析 单个气泡的体积对发酵泡沫量的影响利用鼓泡法测定配置的鼠李糖脂溶液的起泡能力，可以发现随着鼠李糖浓度的增加泡沫量将逐渐增加，在鼠李糖脂浓度下泡沫量已经接近最大值，此后鼠李糖脂浓度的增加对泡沫量的影响不显著（图）然而在发酵过程中发酵泡沫量并不是发酵液中鼠李糖脂的浓度升高而增加，而是在前期快速达到峰值后会逐渐降低，这与鼠李糖脂溶液测试起泡能力的结果不同 通过分析发酵中的泡沫量数据可以发现，在发酵液中鼠李糖脂浓度增加到 时，溶液中的泡沫量已经可以达到 ，这一数值已接近于发酵末期泡沫的稳定数值（）；同时，根据图的结果可知，在此之后鼠李糖脂浓度达到 之后，鼠李糖脂这一单一因素的升高对泡沫量的增长贡献度较小，那么发酵过程中高于 的泡沫量必然是由其他因素影响通过将发酵过程中的泡沫与泡沫柱中鼠李糖脂溶液的泡沫进行观察对比后发现，影响鼠李糖脂泡沫量的一个重要因素是单个气泡的体积，即单个气泡的大小或直径（默认气泡为圆形）如图所示，在发酵早期反应器中生成的气泡直径较大，较大体积的气泡会更快速的充满整个反应器，同时导致单位时淮阴师范学院学报（自然科学版）第 卷图鼠李糖脂浓度与泡沫生成量关系间内溢出的泡沫量较大；与之相反，在发酵后期发酵液产生的气泡直径明显减小，其大小与鼓泡法产生的鼠李糖脂溶液泡沫的气泡大小较为接近图鼠李糖脂泡沫形态综上，在相同的条件下，单个气泡的体积越大则积累成的泡沫的体积就越大，生成泡沫的量就越大因此，在发酵过程中虽然鼠李糖脂的浓度的提升不能进一步提高泡沫量，但是在发酵前中期至中后期这段时间内，由于单个气泡的体积较大，导致发酵过程中较长时间段内（），反应器内泡沫量超过了泡沫柱测定时单纯鼠李糖脂溶液产生的泡沫量，进而形成了发酵过程中泡沫量先上升、后下降的趋势 菌体、蛋白对发酵液起泡性能的叠加效应通过对比泡沫量和发酵液生物量曲线（图），可以发现在菌体快速生长的对数生长期，对应着泡沫量的快速增长，二者具有相同的变化趋势本研究将发酵液进行分离后分别测试了不同组分的起泡性能，以探究菌体对发酵泡沫的影响，结果如图所示 在不同转速下发酵液的起泡能力最强，去除菌体的发酵液起泡能力次之，微生物菌体的水溶液起泡能力最差 通过对比可以发现，虽然菌体本身起泡能力较弱，但是当 菌体与发酵 液混合 之 后发 酵 液的起 泡 能 力 显 著 增 强，使 得 发 酵 液 的 起 泡 能 力 提 升 倍，这是导致发酵液前期泡沫量线性增加的另一个主要原因已有文献报道鼠李糖脂发酵过程中，铜绿假单胞菌由于具有较厚的生物膜、发酵液黏度较大等因素，导致其菌体的产泡能力较强，在一定时期内其起泡性甚至超过鼠李糖脂的起泡能力，是发酵泡沫的主要因素 另外，鼠李糖脂的发酵过程是以油脂为碳源，微生物需要首先分泌大量的脂肪酶，也有报道认为脂肪酶等胞外蛋白也是发酵液起泡的重要因素 然而，本研究的结果结合文献分析后认为，细胞、胞外蛋白，甚至发酵液中的部分营养物质都是起泡的因素，但鼠李糖脂仍然是其中最主要的直接因素，而细胞、蛋白等其他物质由于其在气泡液膜中发挥较好的稳定性作用，可以显著提高发酵液的起泡能力，对鼠李糖脂发酵泡沫具有显著的叠加效应第期王嫣然，等：鼠李糖脂发酵泡沫时空规律解析图菌体和蛋白对发酵泡沫的影响 鼠李糖脂浓度对泡沫稳定性的影响随着鼠李糖脂浓度的升高，液体的起泡能力会迅速升高然后逐渐趋于稳定 然而，与发酵液起泡能力的趋势不同，随着鼠李糖脂浓度的升高泡沫的稳定性持续上升，结果如图所示溶液起泡性是指含有表面活性剂的溶液，在通气、搅拌等作用下产生泡沫的难易程度，通常采用泡沫高度来衡量；泡沫的稳定性是指在泡沫的持久性或泡沫“寿命”的长短，以泡沫的半衰期来衡量 鼠李糖脂在低浓度时即可导致其溶液具有较强的起泡性能，随着浓度的提升快速跃升至最大值；然而其泡沫的稳定性在鼠李糖脂浓度较低时较差且增长趋势较为平缓 在发酵过程中，泡沫的稳定性随鼠李糖脂的浓度的增加逐步提升，发酵结束时泡沫稳定性时长可达到 ，且与泡沫柱中测定的鼠李糖脂稳定性趋势相似，呈现较好的同步性图鼠李糖脂浓度与泡沫稳定性的关系泡沫稳定性主要取决于液膜的结构、性质和其衰变速度的快慢，不同因素通过影响液膜的变化从而影响泡沫的稳定性目前，泡沫衰变的理论主要有液膜排水和气体扩散两种，其中液膜排水理论较为公认并为多数研究所接受 气泡生成之后不会单独存在，而是会相互靠拢并聚集在一起，大小相近的气泡之间聚并过程可以分成个阶段：）两个气泡形成厚夹层；）夹层变薄成液膜；）膜表面波纹不断扩张，最终气泡破灭 泡沫的稳定性则主要取决于气泡聚拢的程度以及液膜的排液速率 液膜排液过程会导致膜表面液体的流动，导致表面活性剂发生对流传导，液流方向的表活剂浓度增加、界面张力降低，形成了沿着界面变化的表面张力梯度递变；进而产生了液流动力导致表面活性剂对流传导，去降低高表面张力区域的表面张力的现象，这个现象就是马拉格尼效应 马拉格尼效应是表面张力的修复过程，其作用是可以恢复液膜强度，使得泡沫具有更好的稳定性 在没有鼠李糖脂存在的情况下，液膜排液会导致液膜逐渐变薄，气泡快速破灭；然而当液膜中存在鼠李糖脂时，鼠李糖脂分子会在表面张力梯度的压力下，自液膜的低表面张力区域迁移至高表面张力区域，这种反向流动对逐渐变薄的液膜起到了修复作用，使得液膜具有更高的强度、起到了稳定气泡的作用马拉格尼效应越显著，泡沫的自我修复能力就越强，泡沫稳定性就会越好 随着发酵的进行，发酵液淮阴师范学院学报（自然科学版）第 卷中鼠李糖脂的浓度逐渐升高，泡沫中鼠李糖脂的含量也随之提高（图），导致发酵后期泡沫液膜张力修复的速率更快，液膜强度也就更强，因此发酵后期泡沫的稳定性逐渐增加图发酵液与泡沫鼠李糖脂含量测定鼠李糖脂除了可以加速液膜修复作用之外，还可以通过减缓液膜排水起到稳定泡沫的作用 鼠李糖脂属于阴离子表面活性剂，其分子两端带有不同的电荷，鼠李糖脂在液膜表面吸附使得液膜带有相同的电荷 当多个气泡互相靠近后，液膜在毛细管压力作用下开始排水、逐渐变薄；此时，由于液膜两边吸附了大量的鼠李糖脂分子，其所带的电荷产生了电相斥作用，可防止或减慢液膜进一步变薄，从而使得液膜更加坚固，泡沫稳定性更高 因此，随着发酵液中鼠李糖脂浓度的提高，液膜中所携带的鼠李糖脂含量就越越高，双电子层的排斥作用更强，导致泡沫稳定性随着发酵的进程也会逐渐提高结论鼠李糖脂发酵过程中的反应器内泡沫生成规律与异位测定的结果存在较大的差异 发酵过程中泡沫量总体呈现前期快速增加，达到最大速率后逐渐减小，最终趋于稳定 本研究发现单个气泡的体积对泡沫量具有重要的影响；发酵中前期，虽然鼠李糖脂含量较低，但此时单个气泡的体积大、生成泡沫的量就越大；发酵后期虽然鼠李糖脂浓度升高，但是由于气泡体积较小泡沫量反而减小 此外，虽然鼠李糖脂是导致发酵泡沫的主要因素，但是细胞、蛋白等其他物质由于其在起泡液膜中发挥的稳定性作用，对鼠李糖脂发酵泡沫具有显著的叠加效应，可使发酵液的起泡能力提升 倍泡沫稳定性方面，泡沫液膜中的鼠李糖脂分子对逐渐变薄的液膜起到了修复作用，使得液膜具有更高的强度、起到了稳定气泡的作用，鼠李糖脂发酵结束时泡沫稳定性时长可达 ，起到了稳定气泡的作用参考文献：全国表面活性剂和洗涤用品标准化技术委员会 中国表面活性剂行业发展“十三五”规划 ，：，（）：，（）：，（）：，：，：，（）：，（）：，：，第期王嫣然，等：鼠李糖脂发酵泡沫时空规律解析 ，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，：，（）：，：，：，：，（，）（，）：，：；责任编辑：蒋海龙淮阴师范学院学报（自然科学版）第 卷