葛根中3个异黄酮类化合物对ox-LDL诱导的脂质沉积和LPS诱导的炎症的影响.pdf

():():():沈忠明殷建伟袁海波 虎杖鞣质的降血糖作用研究 天然产物研究与开发():刘希全 虎杖多糖的提取、分离纯化及结构研究 吉林农业大学郑晓媛 虎杖提取物对 葡萄糖苷酶的抑制作用研究 四川大学刘希全焦连庆于敏等 虎杖多糖的分离纯化及结构研究中成药():王佳李进霞张慧芝等 虎杖多糖乙醇分级纯化及其抗氧化性 食品工业科技():袁德成赵寒梅杨逢建 塔拉种子多糖脱蛋白的正交优化及其抗氧化性研究 植物研究():余倩莎 龙牙百合多糖提取物抗氧化活性及其对肿瘤细胞生长影响 湖南农业大学 ():():():张敏颜苗樊新荣等 雷公藤红素对糖尿病大鼠的肾脏保护作用 中医药导报():张立秋陈玲崔艳艳等 东风菜总黄酮对四氧嘧啶糖尿病小鼠的降血糖血脂及抗氧化作用 现代食品科技():():王秋丹赵凯迪林长青 葛根多糖抗氧化性及其降血糖作用研究 食品工业科技():王生亚薛洁徐乃玉等 青稞多糖对糖尿病模型小鼠的降血糖作用及机制研究 中国药房():葛根中 个异黄酮类化合物对 诱导的脂质沉积和 诱导的炎症的影响朱智芸王自梁车彦云赵 毅(云南医药健康职业学院云南昆明 云南民族大学民族药资源化学国家民委教育部重点实验室云南昆明 云南中医药大学中药学院云南昆明)摘要:目的 探究葛根中葛根素、大豆苷和大豆苷元 种异黄酮类成分对 诱导的脂质沉积和 诱导的炎症的影响方法 采用 法确定药物浓度和作用时间 以 诱导 细胞建立泡沫细胞模型油红 染色后观察细胞泡沫化情况酶法检测 和 的含量 以 诱导 细胞建立炎症模型 检测肿瘤坏死因子()和白介素()水平结果 经 诱导后模型组细胞内出现大量红色脂滴细胞泡沫化明显与模型组比较 个化合物各浓度组的泡沫细胞中脂滴变小、颜色变浅 诱导后泡沫细胞中 和 水平显著升高与模型组比较 个化合物均可显著降低泡沫细胞中 和 水平 诱导后模型组细胞内 和 大量分泌与模型组比较 个化合物均可显著抑制模型细胞 的分泌葛根素和大豆苷元能显著抑制模型细胞 的分泌结论 葛根素、大豆苷和大豆苷元能明显抑制 诱导的脂质沉积和 诱导的炎症因子分泌关键词:葛根异黄酮泡沫细胞脂滴炎症因子中图分类号:文献标识码:文章编号:()作者简介:朱智芸女()学历:硕士 职称:助教 主要研究方向为天然活性成分与药理通讯作者:赵 毅男()学历:本科 职称:正高级工程师 主要研究方向为现代制药技术基金项目:云南医药健康职业学院科学研究基金()民族药资源化学国家民委教育部重点实验室(云南民族大学)开放基金()()():()()()()()()()():()动脉粥样硬化()是一种脂质主导的慢性炎症性疾病 有研究表明泡沫细胞中脂质沉积与炎症的发生是动脉粥样硬化的早期标志 一方面巨噬细胞通过清道夫受体过量摄取氧化型低密度脂蛋白()最终导致泡沫细胞数量显著增加而泡沫细胞中脂质沉积和细胞凋亡释放脂质丰富的坏死核心是 斑块形成的关键另一方面炎症反应参与了 发生与发展的整个过程、和 等炎症因子可损伤血管刺激血管内皮细胞分泌促进斑块形成并稳定的各类胶原和糖蛋白 此外炎症因子逐渐浸润使得斑块纤维帽变薄导致斑块破裂引发血栓事件 因此抑制巨噬细胞脂质沉积和病理性炎症是防止 的主要手段之一葛根为豆科植物野葛 ()的干燥根味甘、辛、凉归脾、胃、肺经具有解肌退热生津止渴透疹升阳止泻通经活络等功效 其主要化学成份包括异黄酮类、三萜类和香豆素类等 葛根作为药食同源的传统中药材现代药理研究表明其具有保肝、抗氧化、抗肿瘤、抗炎、镇痛和防治 等作用 目前葛根的抗动脉粥样硬化作用的研究多以粗提物或药对为研究对象在单体化合物层面上除了葛根素外大豆苷和大豆苷元等含量丰富的代表性异黄酮类化合物在抗动脉粥样硬化中抑制脂质沉积和炎症方面的研究报道鲜见 为丰富葛根异黄酮类化合物抗动脉粥样硬化作用的研究本实验分别以 和 诱导巨噬细胞()建立脂质沉积模型和炎症模型以葛根素为阳性对照探讨葛根中这 个异黄酮类化合物对脂质沉积和炎症因子的影响 为葛根中抗动脉粥样硬化先导化合物的发现与开发提供理论依据 材料与方法 药品、试剂与仪器 葛根素、大豆苷和大豆苷元(上海同田生物技术有限公司)分子质量分别为 、和 分子结构如图 所示纯度分别为 、和 氧化型低密度脂蛋白(广州奕源生物科技有限公司纯度 )胆固醇试剂盒和甘油三酯试剂盒(北京中生北控生物科技股份有限公司)油红 染料(美国 公司)胎牛血清(美国 公司)培养基(美国 公司)脂多糖(美国 公司纯度 )四甲基偶氮唑盐(广州美仑生物科技有限公司)和 试剂盒(杭州联科生物技术有限公司)型 多 功 能 酶 标 仪(瑞 士 公 司)台式离心机(美国 公司)海峡药学 年 第 卷 第 期 图像分析系统(德国 公司)型 培养箱(松下健康医疗器械株式会社)倒置显微镜(德国 公司)图 葛根素、大豆苷和大豆苷元结构式 实验对象小鼠巨噬细胞株()购自中科院昆明动物研究所细胞资源中心 研究方法 细胞培养:细胞用 完全培养液(含体积分数为 胎牛血清青霉素 、链霉素)于 培养箱内培养 细胞生长至时进行传代传代培养 次后取对数生长期的细胞用于实验 法确定药物的实验浓度和作用时间:将对数期生长的 细胞调整密度至 /将细胞液按每孔 接种于 孔板中于培养箱中孵育 设定空白组和药物组药物组加入不同浓度的葛根素、大豆苷和大豆苷元空白组加入等量的培养液 孵育 后吸去原来的培养液用 小心冲洗后每孔中先后加入新鲜培养液 和 溶液 混匀后放入培养箱孵育 孵育过后小心地吸去上层培养液每孔加入 的 放低速摇床上振荡 溶解结晶 用酶标仪在 处测量各孔 值计算细胞存活率 建立泡沫细胞模型油红 染色法观察细胞内脂质沉积情况:收集对数期生长的 细胞按照每孔细胞数量约 个均匀铺到 孔板中于培养箱中孵育 设定空白组、模型组和药物组药物组加入不同浓度的葛根素、大豆苷和大豆苷元其余加入等量的培养液 孵育 后吸去原来的培养液除空白组外每孔中加入 浓度为 的 继续孵育 后弃掉原培养液加入 中性甲醛固定 弃掉固定液用 洗 次后加入质量分数为 油红 工作液避光染色 用 洗 次后显微镜下观察各组细胞脂质沉积情况 泡沫细胞中 和 含量的检测:收集对数期生长的 细胞细胞计数后按每孔细胞数量约 个均匀铺到 孔板中于培养箱中孵育 设定空白组、模型组和药物组药物组加入不同浓度的葛根素、大豆苷和大豆苷元其余加入等量的培养液继续孵育 吸去原来的培养基每孔中加入 浓度为 的 溶液 孵育 后收集细胞在冰浴条件下将细胞超声破碎超声功率为 每次超声 间隔 重复 次制得匀浆液 将匀浆液混合均匀后按试剂盒说明书测定细胞 和 含量 建立细胞炎症模型检测 和 的含量:收集对数期生长的 细胞细胞计数后按每孔细胞数量约 个均匀铺到 孔板中孵育 设定空白组、模型组和药物组模型组加入 的 药物组加入不同浓度的葛根素、大豆苷和大豆苷元与 共同作用空白组加入等量的培养液 孵育 后收集上清液 试剂盒检测 和 含量 统计与分析实验数据由 软件进行统计分析绘制统计图 组间比较利用单因素 分析以 为差异具有统计学意义 结果 三个异黄酮类化合物对细胞活力的影响实验结果显示(见图)与空白对照组比较葛根素浓度在 范围内对 细胞活力无明显影响与空白对照组比较大豆苷和大豆苷元浓度分别为 和 时 细胞活力明显下降()结合前期预实验结果确定 个葛根异黄酮类化合物无毒性实验浓度 葛根素高、中、低浓度分别为、大豆苷高、中、低浓度分别为、大豆苷元高、中、低浓度分别为、图 葛根素、大豆苷和大豆苷元对 细胞活力的影响(与 比较 )三个异黄酮类化合物对泡沫细胞脂滴的影响实验结果显示(见图)空白组的细胞形态正常无脂滴形成 模型组细胞内出现大量的红色脂滴符合泡沫细胞的形态特征与模型组比较经不同浓度的葛根素、大豆苷和大豆苷元处理各组泡沫细胞中脂滴均不同程度地变小、减少、颜色变浅图 葛根素、大豆苷和大豆苷元对 诱导泡沫细胞脂滴的影响(油红 染色 ):空白对照组:模型对照组:葛根素低浓度组:葛根素中浓度组:葛根素高浓度组:大豆苷低浓度组:大豆苷中浓度组:大豆苷高浓度组:大豆苷元低浓度组:大豆苷元中浓度组:大豆苷元高浓度组 三个异黄酮类化合物对泡沫细胞内 和 的影响实验结果显示(见图)与空白组比较经 处理后 细胞内 和 含量显著升高()与模型组比较葛根素高浓度能显著降低泡沫细胞 和 含量()大豆苷高、中、低浓度能显著降低泡沫细胞 含量()大豆苷高浓度能显著降低泡沫细胞 含量()大豆苷元高、中浓度能显著降低泡沫细胞 和 含量()三个异黄酮类化合物对炎症因子 和 的影响 实验结果显示(见图)与空白组比较经 处理后 细胞内 和 水平显著升高()与模型组比较葛根素高、中、低浓度能显著降低炎症细胞 水平()葛根素高浓度能显著降低炎症细胞 水平()大豆苷高浓度能显著降低炎症细胞 水平()而对 水平无明显影响大豆苷元高、中、低浓度能显著降低炎症细胞 水平()大豆苷元高浓度能显著降低炎症细胞 水平()图 葛根素、大豆苷和大豆苷元对泡沫细胞内 和 的影响注:各样品浓度单位:与 组比较 与 组比较 图 葛根素、大豆苷和大豆苷元对炎症细胞分泌的 和 的影响注:各样品浓度单位:与 组比较 与 组比较 海峡药学 年 第 卷 第 期 讨论巨噬细胞通过自噬功能调节细胞内脂质代谢其细胞活力下降将导致细胞内脂质代谢紊乱加速 的发展 法研究 种异黄酮类化合物对 细胞活力的影响结果表明葛根素浓度分别为、时大豆苷浓度分别为、时大豆苷元浓度分别为、时对 细胞活力无明显影响可用于后续实验据报道脂质过量沉积和炎症反应二者之间协同作用是巨噬细胞泡沫化形成坏死核心进而引发斑块破裂促进 病变的主要原因 采用 和 诱导 细胞建立脂质沉积模型和炎症模型是体外研究 防治的简易而典型的方法 本实验发现以 诱导 后细胞泡沫化胞内脂滴增加 和 含量显著升高脂质过量积蓄 经不同浓度的葛根素、大豆苷和大豆苷元处理后泡沫细胞中脂滴明显减少 和 的含量显著降低且呈剂量依赖性 细胞经 诱导后炎性因子 和 水平显著升高而葛根素、大豆苷和大豆苷元可显著降低 水平葛根素和大豆苷元可显著降低 水平 相比之下 个异黄酮类化合物降低 水平的效果均优于降 水平的效果 这可能与不同炎症因子的抗炎作用通路不同有关系这有待后期深入探究综上所述葛根中的葛根素、大豆苷和大豆苷元对 诱导的脂质沉积和 诱导的炎症具有明显的抑制作用对 的防治有一定作用 本课题组今后将针对葛根中的异黄酮类化合物在抑制脂质沉积抗炎抑制巨噬细胞凋亡增强巨噬细胞功能等方面展开深入研究揭示其作用机制挖掘葛根的抗 活性成分参考文献肖素军赵明 动脉粥样硬化与免疫 中国动脉硬化杂志():陈艺飞 通心络抑制动脉粥样硬化进展期斑块巨噬细胞凋亡和脂质沉积的机制研究 山东大学 :():国家药典委员会编 中国药典(一部)北京:中国医药科技出版社 ()():():陈艳文佳玉谢晓芳等 葛根的化学成分及药理作用研究进展 中药与临床():呼海涛徐学琴沈晓君 葛根通脉饮调控 蛋白表达抗动脉粥样硬化的作用 中国实验方剂学杂志():顾健李佳川谭睿等 葛根丹参组方配伍对动脉粥样硬化鹌鹑脂质代谢的影响 中国中药杂志():江爽韩燕星蒋建东等 葛根素抗动脉粥样硬化作用及其机制的研究进展 药学学报():白春艳孟达张雅琼等 苦丁茶皂苷 对 诱导的脂质积累和 诱导炎症的影响 中国药理学通报():周庆兵吴立旗徐凤芹 栀子苷对 诱导的 来源泡沫细胞 异常甲基化的双向调节作用 中国中西医结合杂志():任李梅杨松卢姝言等 人参总皂苷在巨噬细胞 中降低脂多糖诱导的炎症和氧化应激 中国医院药学杂志():():():欢迎投稿海峡药学投稿系统网址:.联系电话: