细胞爬片.doc

第一，盖玻片需要过酸，并且自来水、蒸馏水冲洗干净。两张或者以上的玻片很容易因为虹吸作用粘到一起，很容易冲不干净，很容易把两张完全重叠在一起的玻片当成一张，一定要看清楚，晾干片子最好是在消毒饭盒中进行，饭盒底面放上纱布，将玻片斜靠在饭盒侧壁，玻片正面不要接触纱布，否则会粘上毛毛的。然后高压蒸汽灭菌，烤箱中烤干。
第二，爬片前最好用多聚赖氨酸或者层粘蛋白或者胶原溶液处理玻片，未处理过的细胞不容易贴壁，细胞系还好，原代细胞很少能贴得牢。这一步至关重要，否则在后面用PBS洗片时很容易将细胞洗掉。用这些促进细胞贴壁的溶液处理玻片后，放到培养皿之前需要用培养基冲洗一到三遍！层粘蛋白和胶原还好，多聚赖氨酸有几次我没冲结果细胞全部不贴壁。
第三，传代消化下来的细胞一定不要过多稀释，将浓一点的细胞悬液吹打混匀后滴在玻片上，几个小时后再追加培养基。
第四，玻片在培养皿中容易漂起，如果事先在皿中铺上液体很可能会不容易揭下来，或者揭下来时出印子在镜下很难看。漂起的玻片很容易两面都培养出细胞的，这时背面的细胞必须去除，挺难操作的，用PBS冲洗可能会伤到正面的细胞，用小镊子夹玻片很容易夹碎，也很容易脱落，小心点好。
第五，将玻片拿出后一定要记好哪边是正面，最好做玻片时将玻片切成长方形的。目前市场售的多为18mm x 18mm的盖玻片，或者24mmx24mm的盖玻片，正方形，很难分辨反正面，在某个角上打个缺口，对正方形是不中用的。可以用小砂轮切一下改成长方形，至于在某个角上用砂轮做个标记，理论上很简单，实际操作有难度。
第六，上面步骤都没问题后，玻片就需要进一步处理了，这里有几个细节，分述如下：
1.PBS对玻片是冲洗还是浸泡，我个人认为浸泡好，我吃过冲洗的亏，每一步后都要冲洗2-3次，有时还没等试验做完，大部分细胞已经被冲掉了，呵呵！我当时欲哭无泪啊！
2.4%的多聚甲醛或者别的固定液的温度是多少，有人认为4°C的好，有人认为37°C的好，我个人感觉，娇贵的原代细胞先在常温下固定较好，然后放到4°C冰箱中。我发现直接用4°C的溶液会造成细胞冷休克，从片上脱落。
3.用中性树胶粘盖玻片与载玻片时，尽量少滴树胶，一点点就够了，而且至少半个小时以上才能粘牢，防止在水中脱落。否则盖玻片就会移动，背面会出现树胶的印子，镜下很难看，而且擦不掉的。
4.固定好的片子放到冰箱中保存，我倒没怎么试过，我基本上做好的就直接做免疫组化。

滴加细胞悬液的时候，事先细胞一定要混匀。如果细胞比较多，可以直接往培养皿或孔板内滴加细胞悬液，覆盖玻片，轻柔混匀，注意呈“十”字形摇晃。如果细胞数量少，需要把细胞都滴加在玻片上，则要先从边缘开始，然后再往中央滴，这样有利于细胞均匀分布在玻片上。滴的时候速度要慢，让液体依靠表面张力呈薄层覆盖玻片，要防止细胞悬液溢出玻片。这样一般2-4小时后细胞就贴壁了这时候再补足的培养基，覆盖波片。

细胞爬片
将市售盖玻片放入烧杯中，经过严格的清洗、泡酸过夜、三蒸水冲洗10次，无水乙醇浸泡过夜，锡纸封口，高压灭菌后待用（制作比较麻烦，可以一次多做一些，比较容易碎），我做的是贴壁细胞，不用其他的处理，悬浮细胞要多聚赖氨酸处理，这我没做过。显微镜下观察细胞片生长密度为60～70％后收片，PBS缓冲液反复冲洗3次，再加入其他的荧光染料就可以了。
电镜标本制作，我做的是透视电镜，步骤：
细胞消化后，将细胞悬液转入大试管中以800r/min离心5～10min浓缩，然后将浓缩细胞悬液再置入1.5ml的Ependorf管中，以1500r/min离心10min，完毕后Ependorf管底部的细胞以一粒芝麻大小为宜，沿管壁缓慢加入2.5％戊二醛固定，切忌将细胞团打散。交电镜室，其他的是电镜室的老师做了，好像有清洗、脱水后包埋、超薄切片，醋酸双氧铀、枸橼酸铅双重染色10min等步骤。这你可以向电镜室的老师请教一下！

HE染色:
(1)细胞爬片放入4%多聚甲醛固定10分钟。
(2) PBS冲洗3遍3-5分钟。
(3)0.1 %Triton X-100溶液透化细胞15分钟。
(4) PBS冲洗3遍3-5分钟。
(5)苏木素溶液覆盖细胞染色15分钟。
自来水冲洗终止反应。封片，镜下观察。

第一个问题：我做细胞爬片的HE染色时，是采用的第一种方法，不过固定是采用的是4%多聚甲醛而不是95％的酒精。第二种方法的采用的0.1 %Triton X-100溶液透化细胞膜的做法好像应该是免疫细胞化学时采用的步骤。

具体操作是：用胰酶消化好细胞，充分吹打，使之成单细胞悬液（注意：这一点很重要，关系到将来爬出来片子的质量）

取出消毒的培养皿，可以先加少量培养基（以使玻片与培养皿紧密接触），将玻片小心放入摆放其中，然后将单细胞悬液一滴一滴的滴到玻片上。最后盖上培养皿置于37度5％CO2的暖箱中培养，根据细胞生长状况，24小时或更长时间适时取出爬片。

爬片置于37度PBS中洗三次，每次3到5秒钟，然后在4％多聚甲醛中固定15分钟，然后再用37度去离子水将甲醛冲干净，注意手法轻柔，要不然掉片很厉害。同时操作过程中注意玻片的正反面，要不然真的是前功尽弃。