植物多倍体的细胞学鉴定.doc

遗传学实验
植物多倍体的细胞学鉴定

姓名：温建丽 学号： 201100140160 班级：生物技术1班
同组成员：马存英 实验时间：2013.11.4

摘要 多倍体这个名词在人们的日常生活中也许并不多见，但在自然界中多倍体的分布却十分广泛，此次实验通过对大蒜根尖细胞进行多倍体诱发，初步了解并掌握诱导多倍体的方法和技术，并对诱导组织进行了染色和压迫观察，进行了细胞学鉴定，掌握了判断多倍体细胞的方法和技术。

1.引言
多倍体是指细胞中具有3个或3个以上染色体组的细胞或个体。同源多倍体是指具有3个以上相同染色体组的细胞或个体，且染色体组来源于同一物种（AAA，AAAA）。异源多倍体是指具有3个以上染色体组且染色体组来源于不同物种，通常由不相同的种杂交的杂种再经过染色体加倍而来（AABB，AABBDD）。
随着植物自然演化地位的提高，多倍体所占比例增大。自然界中，多倍体在裸子植物中占物种的13%；据估计，50％～70％的被子植物在其进化过程中至少经历过1次多倍化过程。许多重要的作物为异源多倍体(allopolyploid)，如小麦、燕麦、棉花等，或同源多倍体(autopolyploid)，如紫花苜蓿、马铃薯等。其他一些作物，如玉米、大豆、甘蓝等虽为二倍体(diploid)，但其祖先在进化中也经历了多倍化过程。自然界中多倍体可由以下方式产生：有丝分裂时染色体分离而细胞没有分裂，导致体细胞染色体加倍；减数分裂时染色体没有减数，使生殖细胞染色体加倍；不同物种杂交产生的杂种经过自然加倍产生异源多倍体。
多倍体植物的特征：
（1）巨大性
随着染色体加倍，细胞核和细胞变大，组织器官也变大。根、茎粗壮、叶宽厚、色深、花大、色艳、气孔、花粉粒、果实、种子大。
（2）可孕性低
多倍体特别是三倍体是高度不孕的。表现----无籽、种子皱缩，如无籽香蕉、无籽葡萄、无籽西瓜、无籽柑橘、无球悬铃木。配子染色体组合成分的不平衡导致同源三倍体的高度不育，同源三倍体基因分离缺乏规律性。但是偶倍数的异源多倍体具有与二倍体相同的性状遗传规律。
（3）适应性强
植物多倍化不仅使植株基因活性及酶的差异性增强，而且还增强了植株的生态适应性、对逆境的抗耐性，所以分布地区较广。多倍体杜鹃多分布在我国西南山区，而二倍体只分布在平原。
（4）有机合成速率增加
多倍体有多套基因，新陈代谢旺盛，酶活性加倍，提高了有机物的合成速率。多倍体甜菜，产糖量高；三倍体表现出明显的超亲优势；浆果类，贮存期延长； 多倍体花卉花大香味浓。
人工诱导多倍体的方法主要分为两种，物理方法：温度剧变、机械损伤、各种射线处理等。化学方法：各种植物碱、麻醉剂、植物生长激素等。秋水仙素是诱导多倍体的最有效的方法之一，本实验就是采取此种方式。秋水仙素是百合科植物秋水仙的根、种子等器官中提炼出的一种植物碱。分子式为C22H25O6N，具麻醉作用，性极毒，易溶于酒精、氯仿、甲醛和冷水中，不易溶解于乙醚、苯中其主要作用是细胞分裂时抑制纺锤体的形成，抑制细胞板的形成且无残效。
2.实验材料及方法
2.1实验材料
2.1.1试验材料 大蒜根尖
2.1.2实验器具
显微镜一台，解剖针两根，眼科镊，载玻片，盖玻片（20mm×20mm），滤纸条，解剖刀片。
2.1.3实验试剂
改良苯酚品红，1mol/LHCl，蒸馏水，卡诺氏固定液，0.15%秋水仙素溶液，70%乙醇。
2.2实验方法
2.2.1大蒜根尖细胞多倍体诱导
取材：取大蒜（选取可生根成熟未经农药处理的大蒜）发根至0.5~1cm（约24h），然后转入盛有0.15%秋水仙素水溶液的培养皿中继续培养约24小时-30小时，待观察到根部有膨大时取出固定。
固定：根尖于卡诺固定液中，常温固定约24h，移至70%乙醇中保存或备用。
2.2.2材料的获取及处理
酸解法解离根尖：植物的分生组织需要经过处理以便除去细胞之间的果胶层并使细胞壁软化，经解离的组织才能使压片步骤顺利进行。固定后的材料用清水洗涤后，用1M HCl在60℃水浴中恒温处理5min。在酸解过程中一定要掌握好温度和时间，若解离不够，则压片不易分散。若解离太过，在下一步处理材料时由于材料过软而易丢失。水洗3次，每次1-2min。
染色：切取根尖分生组织区，用改良苯酚品红染色15-20min。
2.2.3制片及观察
将染色后的材料盖上盖玻片，在盖玻片上盖上两层吸水纸，用一个双面刀片，插到盖片与载片之间的一角，用左手食指压紧盖片，防止滑动，用右手持解剖针，用针柄轻敲盖片，使材料均匀分散开。然后将刀片轻轻撤出，再用针柄重敲盖片，使细胞分散压平。镜检时先用低倍镜进行观察，找到好的视野后再转用高倍镜观察。

3.结果
3.1实验结果图示

图1 （40*） 图2（40*）
图3 （40*） 图4（40*）
3.2图片分析
大蒜是二倍体生物，其2n=16。秋水仙素能抑制有丝分裂，破坏纺锤体，使细胞停滞在分裂中期，而一般植物生长周期约17~18h，所以，经过24h秋水仙素处理，理论上应形成四倍体的大蒜根尖细胞，即4n=32条染色体。
图1展示了该视野下多个细胞染色体的数目及状态，从中可看出，此次实验效果较好。图2中的染色体数目为32条，说明此细胞是一个大蒜四倍体细胞，移动载玻片，尽管有些细胞中染色体仍发生部分重叠，如图4所示没有完全分散开，但依旧可判别很多此数量的细胞。图3是正常的二倍体，其中每一个染色体包含两条姐妹染色单体，推断此细胞正处于有丝分裂时期。对于这个细胞，将来若姐妹染色单体分离，但细胞并不分裂，则会发育呈多倍体细胞，若姐妹染色单体分离其细胞分裂，则会发育呈两个正常的二倍体细胞。尽管此细胞中染色体有些过于分散，但根据其周围隐约的细胞轮廓，仍可确定所有染色体都是同一细胞中的，没有丢失，也没有被外来染色体污染。
4.讨论
本次实验采用大蒜根尖作材料，大蒜容易获得，价格便宜，但应选择市场上未经农药处理过，可生根的大蒜，且大蒜根部生长迅速，根尖分生区细胞分裂快，可在短时间内获得较理想的材料。
本次实验大蒜根尖细胞的多倍体诱导较为成功，秋水仙素处理24h后，从外观上可明显看出根尖膨大入鼓槌状，初步判断其中大部分细胞已成为多倍体。制片后，整体上看，大多数细胞处于分裂期，可以清楚的观察到染色体或包含两条姐妹染色单体的染色体，且视野内基本上为一层平展的细胞，视野内的细胞都在一个平面上，染色均匀，细胞质着色浅且染色体着色深，且观察到包含4n=32条染色体的细胞，可初步判断根尖已称为多倍体。
综合同学们的实验结果，我觉得此次实验好坏的关键要点是：（1）秋水仙素处理时间长短不好控制，我们应充分考虑何时固定材料获得更好的效果；（2）压片时的力度和时间，可影响大多数细胞中染色体交错聚集，无法计数，此步骤最为重要；（3）解离时间，可能会影响压片时染色体分离程度；（4）切取根尖时切取范围太大的话，导致制片时其他组织的细胞进入，使分生区细胞比例下降，影响观察。从别的组实验结果看，很多同学出现了此现象，不过我们小组都做得较成功，之后便可进行拍照分析。
5.注意事项
（1）在酸解过程中一定要掌握好温度和时间，若解离不够，则压片不易分散。若解离太过，在下一步处理材料时由于材料过软而易丢失。
（2）在准备实验材料时应考虑到材料的易得性、价格、准备周期等方面。
（3）切取根尖时要准确，若切取组织过大，制片后视野中细胞过多，且多层，影响观察；若过小，则丢失细胞，观察不到多倍体。
（4）在解离之前和之后，均要用清水洗涤根尖，否则前者影响解离，后者影响染色。
（5）在制成的染色体玻片标本中，染色清晰而且分散良好的中期分裂相总是少数，所以，在压片之后需要认真地进行镜检。
（6）压片时应耐心、长时间的敲击盖玻片，以达到分散染色体的目的。

参考文献

[1]杨大翔. 果蝇唾腺染色体标本的制备与观察—— 遗传学实验,2010年9月第八次印刷