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新生仔猪小肠上皮细胞的分离培养和鉴定

作者：王 静, 张彦明* , 仝 钢, 刘芳宁, 周宏超, 何 雷, 杨小云, 徐彦召, 洪海霞
( 西北农林科技大学动物医学院, 杨凌712100)
内容摘 要:
为更快捷地进行猪肠道病毒性、细菌性疾病及细胞永生化的研究提供便利, 本研究使用多种酶消化法及其他培养法尝试分离培养肠上皮细胞。结果, 利用组织块培养法能成功建立新生仔猪小肠上皮细胞株, 获得的上皮细胞具有较强的增殖能力, 22 h内贴壁并发生细胞分裂, 6~ 7 d明显增殖, 10~ 12 d汇合成单层, 连续传代培养至12代, 细胞基本失去上皮样特征。倒置显微镜下观察, 10代前培养细胞为多角状或卵圆形, 单层生长不重叠, 呈铺路石状排列, 11~ 12代细胞发生变形，间隙增大。细胞角蛋白18鉴定二者均为阳性。电镜下, 纹状缘整齐, 紧密连接结构清晰可见。结果表明利用组织块培养法可以获得能够连续传代、活力较好的猪小肠上皮细胞。
关键词: 新生仔猪小肠上皮细胞；；组织块培养； 原代培养； ；鉴定
中图分类号: Q813. 1 文献标识码: A 文章编号: 0366- 6964( 2010) 01- 0092- 07
动物细胞的体外培养已被广泛应用于细胞和分子生物学领域。就肠上皮细胞而言, 分离培养技术成为深入研究小肠功能、病理和细胞分化的重要工具[ 1 ] 。肠细胞培养物在生物技术和临床应用方面都有很高的价值, 可用作食品、化妆品、抗肿瘤药品和移植药品等的毒力活性检测[ 2] 。国外学者对肠上皮细胞研究较多, 虽然分离方法各有不同, 但多采用酶消化法, 且多局限于小鼠、大鼠和人。啮齿动物肠细胞系如IEC-6[ 3-5] 在研究多种隐窝细胞活性方面, 包括增殖活性、细胞迁移、细胞外基质分子的合成[ 6-8] ,以及在研究细胞分化方面[ 6, 8-9] 都有很重要的意义,相继建成的还有IEC-18[ 10] 。关于猪小肠上皮细胞系, 国外已有学者成功建立了来源于成年公猪回肠的IPI-2I[ 11] 以及来源于未吃初乳的乳猪空肠的IPEC-J2[ 12] 和IPEC-1[ 13] , 但国内尚无猪小肠上皮细胞连续传代并成功建系的报道。本研究使用组织块培养法成功的培养了猪小肠上皮细胞, 为构建小肠上皮细胞系奠定基础。
一1 、材料与方法
（1. 1 一）材料
无菌条件下取出刚出生12 h 内仔猪的回肠, 剔除肠系膜, 于加入双抗的PBS培养基中冰浴保存,备用。
DMEM/ F12 培养基( Gibco) : 添加50 mL # L-1的胎牛血清( Gibco ) 、10 ng # mL-1 EGF ( Sigma ) 、100 U # mL-1 青霉素、100 Lg # mL-1 链霉素、1 mmol # L-1 的HEPESI TS-G( Insulin 1. 0 g # L-1+ T ransferring 0. 55 g # L-1 + Selenium 0. 67mg # L-1 ) 蔗糖- EDTA 缓冲溶液: 0. 45 mol # mL-1蔗糖, 3. 6 g # L-1 EDTA, 1 g # L-1 牛血清蛋白溶于PBS 中, pH7. 4。细胞角蛋白18 单克隆抗体, SABC免疫组化试剂盒, DA B 显色试剂盒和苏木素均购自武汉博士德公司。
1. 2 1、仔猪小肠上皮细胞的分离培养
（1. 2. 1 1）组织块培养法 ¹ 无菌条件下剔除肠系膜, 将小肠移至培养皿中, 用PBS 液将小肠内腔冲洗干净。纵向剖开肠管, 用PBS 和无血清的DMEM/ F12 反复清洗至液体清亮; º 将肠管剪成肉眼可见的碎片, 用无血清的DMEM/ F12 清洗, 静置1 ~ 2 min 后。弃去上清, 继续剪碎, 剪成<1 mm3的碎片, 再加入无血清DMEM/ F12 进行清洗, 1 000 r # min-1 离心7 min; » 如上反复清洗组织块, 直至上清液澄清; ¼用50 mL # L-1 FCSDMEM/F12 悬浮组织块并取适量种植于培养皿或培养瓶中。½ 培养24h后换液, 继续培养。
2 二、结 果
2. 1 IEC不同消化酶液的分离效果由表1可见, 2. 5 g # L1的胰蛋白酶虽然消化速度较快, 但易对细胞造成较大的损害, 漂浮死亡的细胞较多, 大部分为单个细胞, 贴壁和生长能力均较差, 而0. 2 g # L-1的胶原酶Ñ 和50 mg # L-1 的嗜热菌蛋白酶的消化时间较长, 易造成其他细胞( 成纤维细胞、基质细胞、平滑肌细胞等) 量的增加( 消化方法同1. 2. 2) 。相对而言, 嗜热菌蛋白酶联合胶原酶Ñ可分离出较纯的上皮细胞, 但是, 分裂数次后停止分裂。组织块培养法是获得上皮细胞最简单的方法。虽然在机械剪碎过程中, 对肠隐窝器官样单位会有一定程度的损伤, 但相对而言, 上皮细胞未经过任何酶处理, 获得的细胞活性较强( 图1) 。
3三、 讨 论
（3. 1三） 肠上皮细胞的分离
3. 1. 1 3、材料来源 本研究选用的是出12 h内的未吃初乳的新生猪, 此时的乳猪未采食, 可避免源头污染。而且新生乳猪的肠上皮细胞生长迅速, 增殖能力强。林成招等[ 15] 分别使用成年大鼠和乳鼠获得小肠上皮细胞, 发现成年大鼠的分化度高, 体外增殖能力弱, 绝大多数难以继续生长, 而乳鼠上皮细胞增殖能力较强, 贴壁后以散在的克隆集落形式存在。
参考文献:
[ 1 ] KEDINGER M, HAFFEN K, SIMON- ASSMANNP. Intestinal tissue and cell cultur es[ J] . Dif f er entiation,1987, 36( 1) : 71- 85.
[ 2 ] BERTRAND K. Mammalian intestinal epithelial cellsin primary culture: A min-i review [ J] . I n Vitr o Cell Dev Biol , 2002, 38( 3) : 123- 134.
[ 14] 薛庆善. 体外培养的原理与技术[ M] . 北京: 科学出版社, 2001: 256.
[ 15] 林成招, 马海田, 邹思湘, 等. 大豆异黄酮对大鼠小肠上皮细胞生长及葡萄糖和氨基酸吸收的影响[ J] . 南京农业大学学报, 2005, 28( 1) : 71- 75.
基金项目: 陕西省自然科学基金项目( 2007C106) 资助
作者简介: 王 静( 1982- ) , 女, 新疆阜康人, 硕士生, 主要从事分子病原学与免疫学研究, E-mail: w jt ry100@ 163. com
* 通讯作者: 张彦明, E-mail: ylzhangym@ sohu. com