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复方青黛饮含药血清对体外HaCaT细胞增殖和凋亡的影响
来源：互联网 更新时间：2009-8-26 10:41:18　查看次数：269

复方青黛饮含药血清对体外HaCaT细胞增殖和凋亡的影响
李文彬1，冯捷1，马慧群1，闫小宁2，张彩晴3
［摘 要］ 目的 体外观察复方青黛饮大鼠含药血清对人永生化角质形成细胞株HaCaT细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响，并探讨其作用机制。方法 根据中药血清药理学方法，用SD大鼠制备实验血清，采用MTT法、流式细胞术、免疫荧光Hoechst染色，观察含药血清对细胞生长抑制率、凋亡率、细胞周期分布及细胞形态学的影响。结果体外培养HaCaT细胞24h 和48 h后，复方青黛饮高、中、低三个剂量不同浓度的含药血清组，对HaCaT细胞的生长均有不同程度的抑制，与空白血清组相比，差异有统计学意义（P< 0.05），其中高剂量组抑制作用最明显。复方青黛饮含药血清组细胞凋亡率和G0/G1比例明显增加，与空白血清组相比，差异有统计学意义（P< 0.05），在镜下呈现凋亡的特征性形态改变。结论 复方青黛饮大鼠含药血清对体外培养的角质形成细胞株HaCaT细胞有生长抑制和诱导凋亡作用，并对细胞周期有一定的影响。
［关键词］ 复方青黛饮；含药血清；HaCaT细胞；增殖；凋亡
［中图分类号］ R 758.63    ［文献标识码］ A   ［文章编号］ 1001-7089（2009）08-0469-03
Effects of Compound Indigo Naturalis Decoction Serum on Proliferation and Apoptosis  of HaCaT Cells In Vitro
LI Wen-bin1， FENG Jie1， MA Hui-qun1 , YAN Xiao-ning2， ZHANG Cai-qing3
（1 Department of Dermatology, Second Affiliated Hospital of Medical School, Xi′an Jiaotong University, Xi′an 710004, China；2 Department of Dermatology, Shaanxi Traditional Chinese Medical Hospital, Xi′an 710004, China；3 The 323 PLA Hospital，Xi'an 710054, China）［Corresponding author］ FENG Jie, e_mail:boerge@
Abstract：Objective To investigate the mechanism of compound indigo naturalis decoction in treating psoriasis, we observed the effect of inactivated mouse serum containing compound indigo naturalis decoction on the proliferation, apoptosis, and cell cycle of HaCaT cell in vitro. Methods The experimental animal serum was taken from SD rats and was inactivated before the experiment on the base of the serum pharmacology method. Then the serum at different concentration of compound indigo naturalis decoction serum was added to HaCaT cell. The control was set meanwhile.The cell growth was evaluated by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay. The cell cycle distribution and cell apoptosis were measured by flow cytometry. The cell morphology was observed by Hoechst staining under fluorescence microscope. Results After coculture for 24h, 48h, compared with the blank group, the cell proliferation of HaCaT was inhibited significantly in high dose, medium dose, low dose groups（P<0.05）. Compared with that of the blank group, the cell apoptotic rate and cell percentage in G0/G1 phase obviously increased in high dose, medium dose, low dose groups（P< 0.05）. At the mean time, the distinctive apoptotic morphology was observed. Conclusion We concluded that compound indigo naturalis decoction serum not only inhibited the proliferation of HaCaT cells, butalso significantly induce apoptosis. Affecting cell cycle might contribute to the mechanism.
Key words： Compound Indigo NaturalisYin；Drug serum；HaCaT cells；Proliferation；Apoptosis
银屑病是一种常见易复发的慢性炎症性皮肤病，对患者的身心和生活质量均造成一定程度的影响。复方青黛饮是本科经多年临床实践总结的治疗银屑病的经验用方，对中医辩证分型“血热型”疗效显著。由于中药成分复杂，其具体作用机制不明，本实验以人永生化角质形成细胞株HaCaT细胞为研究对象，对复方青黛饮治疗银屑病的作用机制进行探讨。
1 材料和方法 
1.1 实验材料 SD雄性大鼠40只，清洁级，体重200±20g (购自西安交通大学医学院实验动物学中心)，人永生化角质形成细胞株HaCaT细胞（张彩晴博士惠赠），复方青黛饮（组分：由青黛、贯众、紫草、蒲公英、马齿苋、丹参、白芷、焦山楂、建曲、五味子等组成，生药购自西安交通大学医学院第二附属医院药房，水煎制成含生药量为1.85g/mL的药液，2 000r/min离心，取上清，置-4℃冰箱保存)。
1.2 主要实验试剂 DMEM购自美国 Invitrogen公司，胎牛血清购自杭州四季青生物公司，MTT试剂盒购自美国 Sigma公司， Hoechst33258试剂盒购自碧云天生物技术有限公司，AnnexinVFITC试剂盒购自深圳晶美生物工程有限公司。
1.3 实验方法 
1.3.1 复方青黛饮含药血清的制备 选用正常SD大鼠30只，禁食12h后予2.0mL复方青黛饮煎液灌胃给药，大鼠随机分为高、中、低三个剂量组，每组10只，给药剂量（折合生药）为高剂量组60.18g/kg，中剂量组为30.9g/kg，低剂量组为15.45g/kg（分别相当于成人临床推荐剂量的20倍、10倍和5倍），均2次/d，连续3d，末次给药1h后乙醚麻醉，无菌条件下腹主动脉取血，静置3h，3 000r/min离心10min；取血清，灭活后0.22μm过滤除菌，-20℃冰箱保存备用。
1.3.2 空白血清的制备 正常SD大鼠10只，禁食12h后，用生理盐水灌胃，灌胃方式和灭活血清获得方法同上。
1.3.3 细胞培养 HaCaT细胞接种于含10%胎牛血清，100U/mL青霉素、链霉素的DMEM培养液中，37℃、5%CO2孵箱培养。
1.3.4 MTT法检测细胞增殖 取对数期生长的HaCaT细胞以1.0×104/mL接种于96孔培养板中，每孔100μL；24h后弃培养液，加入高、中、低3种剂量含药血清和正常血清，各组设5%，10%，20%，40%，80%不同血清浓度，每孔均为100μL，设6个复孔；分别于培养24h和48h时，每孔加入10μL MTT(5mg/mL)，孵育4h，弃上清，每孔加入DMSO 100μL，沉淀充分溶解后，用酶标仪测定570nm波长下OD值，生长抑制率＝（1－实验组OD值/空白组OD值）×100%。
1.3.5 细胞凋亡形态观察 用细胞爬片法，将无菌盖玻片放入24孔培养板中，每孔加入1.0×104/mL细胞，待细胞爬片面积超过70%时，弃培养液，加入各组实验血清，每组设3个复孔； 48h后，按Hoechst 33258试剂盒说明书进行染色，然后在荧光显微镜下观察细胞形态，并拍照。
1.3.6 流式细胞仪术对细胞的凋亡和细胞周期的检测 细胞培养48h后，0.25%胰酶消化，离心收集细胞2.0×106/mL，按试剂盒说明书对细胞进行染色，并用流式细胞仪检测。1.4 统计学分析 应用SPSS 12.0软件。实验结果用(x±s)表示，组间比较采用oneway ANOVA和LSD t检验，P< 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 含药血清对HaCaT细胞增殖的抑制作用 单因素方差分析显示，除24h、5%血清浓度外，各剂量组对HaCaT细胞增殖抑制率比较，差异无统计学意义，余各血清浓度的各剂量组对HaCaT细胞增殖抑制率之间比较，差异有统计学意义（P<0.05）；经LSDt检验，除24h、5%血清浓度的中、低剂量组外，各剂量组与空白血清组比较，中、低剂量组与高剂量组比较，差异均有统计学意义（P均< 0.05），其中高剂量组作用最明显，24h最大抑制率为48.29%， 48h最大抑制率为59.34%（图1～2）。
含药血清不同浓度组相比较，对HaCaT细胞增殖抑制作用结果显示，5%，10%，20%各组间比较，差异有统计学意义（P< 0.05）；LSD t检验提示随着血清浓度的增加和时间的延长，抑制作用也随之增强（P< 0.0520%，40%，80%不同血清浓度组之间对细胞的增殖抑制率经单因素方差分析，无统计学意义，提示含药血清浓度达到20%后，其抑制作用不能随血清浓度的增加而增强，因此在后续实验中含药血清浓度选择为20%（图1～2）。
2.2 20%含药血清各剂量组对HaCaT细胞周期和凋亡的影响 高、中、低剂量组和空白血清组相比较，HaCaT细胞的G0/G1期细胞比例增加（P< 0.05），S期细胞比例减少，G2/M期比例减少（P< 0.05），提示含药血清可以抑制HaCaT细胞由G0/G1期向S期和G2/M期转化，其中高剂量组的作用最为显著（表1，图3a，3b）。和空白血清组相比，高、中、低剂量组均可诱导HaCaT细胞发生凋亡（P< 0.05）；中、低剂量组与高剂量组比较，差异有统计学意义（P< 0.05），其中高剂量组的作用最为显著（表1，图3c，3d）。
2.3 细胞形态学观察 作用48 h后，20%含药血清各剂量组在光镜下均可观察到细胞的生长受到不同程度的抑制，单位面积数目减少、细胞变圆、变小、漂浮。Hoechst 33258染色后，荧光显微镜下可见细胞核聚集、边缘化、核碎裂等典型细胞凋亡形态(图4)。
表1 48h后20%含药血清对HaCaT细胞周期和凋亡的影响 (x±s,%)
Tab. 1 Effects of 20% drug serum after 48h on cell cycle and apoptosis of HaCaT cells (x±s,%)
Group
n
G0/G1
S
G2/M
Apotosis rates
high dose
3
57.60±3.17*
30.82±1.01*
11.58±0.25*
49.36±5.78*
medium dose
3
48.52±1.99*#
35.91±0.87*
15.57±0.10*
29.14±2.43*#
Low dose
3
39.71±2.02*#
44.33±1.54*#
15.96±0.43*
11.43±1.14*#
Blank
3
19.89±1.03
58.52±1.33
21.30±2.92
3.01±0.15
*P<0.05; vs blank group; #P<0. 05 vs high dose group.

*P<0.05 vs blank group
图1 24h后各组不同浓度含药血清的抑制率
Fig.1Inhibition rates of different concentration drug serum after 24h ours in each group，
#P<0.05 vs high dose group
图2 48h后各组不同浓度含药血清的抑制率Fig.2 Inhibition rates of different concentration drug serum after 48h ours in each group

图3 48h后20%含药血清对HaCaT细胞周期和凋亡的影响
Fig.3 Effects of 20% drug serum after 48h on cell cycle and apoptosis of HaCaT cells

图4 免疫荧光Hoechst 33258染色 ×200
Fig.4 Immunofluorescence Hoechst 33258 staining ×200
3 讨论
研究表明银屑病组织病理表现为表皮基底层的角质形成细胞增殖加速，同时存在细胞凋亡的异常，临床表现为表皮异常增殖与脱屑［1］。目前许多治疗药物，如维A酸类和卡泊三醇，金属蛋白酶抑制因子均在一定程度上抑制了角质形成细胞增殖，同时又诱导了凋亡而发挥治疗作用［2,3］。复方青黛饮对“血热型”银屑病临床疗效满意，本研究以HaCaT细胞为靶细胞，从细胞增殖、凋亡和细胞周期方面对该方治疗银屑病的机理做了初步探讨。
利用中药含药血清制备实验动物模型是目前研究中药复方药理作用常用的一种实验方法。本研究根据文献［4］制备含药血清，为了避免实验动物自身血清中的免疫活性物质的影响和细胞培养的血清要求，选择制备了大鼠含药灭活血清和正常灭活血清［5］，并观察了含药血清对HaCaT细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响。实验结果表明高、中、低3个剂量组和对照组相比，对HaCaT细胞均有不同程度的生长抑制作用，药物作用随着剂量的增加和作用时间的延长而增强。
根据MTT实验结果，本研究选择20%含药血清观察了不同剂量组对HaCaT细胞凋亡和细胞周期的影响，结果表明复方青黛饮含药血清可以诱导HaCaT细胞发生凋亡，并可将细胞周期阻止于G0/G1期。在细胞周期中，G0/G1期向S期转化和S期向G2/M转化是细胞增殖的两个重要调控点，提示复方青黛饮可能通过抑制细胞DNA的合成来抑制细胞的增殖。
到目前为止，大量研究表明［6 7］，许多具有多种免疫学活性的细胞因子如TNF-α、IL-23、单核细胞趋化和激活因子（MCAF）等参与银屑病病理相关的免疫过程，并进一步引起T淋巴细胞和中性粒细胞的活化及趋化，角质形成细胞的过度增殖。从而导致银屑病的发病。本研究显示复方青黛饮可能通过抑制角质形成细胞增殖和诱导凋亡来治疗银屑病，但是否以免疫活性物质为介质发挥作用，以及其诱导凋亡的具体作用途径仍有待进一步研究。
［ 参考文献 ］
［1］ WRONESMITH T, MITRA RS, THOMPSON CB, et al. Keratinocytes derived from psoriatic plaques are resistant to apoptosis compared with normal skin［J］. Am J Pathol, 1997, 151(5):1321-1329.
［2］ ARECHALDE A, SAURAT JH. Management of psoriasis: the position of retinoid drugs［J］. Biodrugs, 2000, 13(5): 327-333.
［3］ SAWA M, TSUKAMOTO T, KIYOI T, et al. New strategy for antedrug application: development of metalloproteinase inhibitors as antipsoriatic drugs［J］. J Med Chem,  2002, 45(4): 930-936.
［4］ 李仪奎，吴健宇.血清药理学实验中采血时间的通法方案［J］.中国药理学通报，1999，15 (6)：569－570.
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［6］ 贺勤， 涂亚庭，刘业强，等. 寻常性银屑病皮损中SP，NK-1R和IL-23 p19基因的表达［J］. 中国皮肤性病学杂志，2008，22 (8)：459-460.
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［收稿日期］2009-04-29［修回日期］2009- 05-15