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实训二 MS培养基的配制与灭菌（3学时）

一、目的要求
通过MS固体培养基的配制，掌握配制培养基的基本技能。
二、仪器与用具
1、仪器：酸度计或pH试纸、电磁搅拌器、电炉
2、用具：高压灭菌锅、微量移液器、移液管、量筒、容量瓶、培养瓶（三角瓶）、烧杯、标签
3、试剂：配制MS培养基的各种母液、生长调节剂、琼脂、蔗糖、蒸馏水、0.1 N 、0.5N NaOH，0.1 N 、0.5N HCl
三、方法步骤
（一）MS固体培养基的配制
1、将配制好的MS培养基母液从冰箱中取出，按顺序排列，并逐一检查是否沉淀或变色，避免使用已失效的母液。
2、取少量的蒸馏水（约为配制培养基量的2/3）加入烧杯中。
注意：配500ml培养基用1000ml烧杯。
3、按母液顺序和规定量，用量筒、移液管或微量移液器取母液，依次放入烧杯中。
如配制1000ml培养基：
需：MS大量元素母液 100ml
MS微量元素母液 10ml
MS铁盐母液 10ml
MS有机物母液 10ml
4、通过计算，用微量移液器取所需的各种生长调节剂母液。
5、加入蔗糖（30g/L），溶解。
6、定容：用容量瓶。
7、调pH值：一般pH=5.8。
用0.1 N 和0.5N 的NaOH和HCl 将pH调至所需的数值。
注意：①经高温高压灭菌后，培养基的pH值会下降0.2—0.8，故调整后的pH值应高于目标pH值0.5个单位。
②pH值的大小会影响琼脂的凝固能力，一般当pH大于6.0时，培养基将会变硬；低于5.0时，琼脂就不能很好地凝固。
③如果pH值与所需的数值相差很大，可先用0.5N的NaOH或HCl调节，至接近时，再用0.1N的酸、碱调节。以免加入过量的水溶液，导致溶液体积增大，培养基不能很好地凝固（因加入的琼脂量一定）。
8、分装到大三角瓶中（500ml、1000ml）。
9、加琼脂（6-10g/L）。常用6.6--7 g/L
10、封口：用棉塞或锡箔纸、牛皮纸。注明培养基名称、配制时间。

或者：5、加入蔗糖。
6、加琼脂，煮沸1-2分钟（熔化琼脂）。
7、定容，pH值。
8、分注到培养瓶中。100-150ml培养瓶每瓶装入20-35ml左右的培养基。
（二） MS固体培养基的灭菌——高压蒸汽灭菌（湿热灭菌法）
1、洗涤：把组织培养基用的培养皿、三角瓶、试管等玻璃器皿进行彻底清洗。自然晾干或烘箱干燥。
2、包扎：用牛皮纸、报纸、纱布或锡箔纸把玻璃器皿和金属器械分别包扎好。
3、装水：在高压灭菌锅内装入一定量的水（水要淹没电热丝）。（切忌干烧！）
4、装物品：在灭菌锅内放入含培养基的培养瓶或三角瓶、装蒸馏水的玻璃瓶，以及包扎好的玻璃器皿和金属器械等。
5、灭菌：将排气阀开着，加热，直至锅内释放出大量水蒸气（此时水蒸气横向喷出），再关闭阀们；或者当锅内压力升至49.0KPa时，开启排气阀，将锅内的冷空气全部排出。当锅内压力达到108KPa时，温度为121℃时，维持15-20分钟，即可达到灭菌的目的。（若灭菌时间过长，会使培养基中的某些成分变性失效。）切断电源，让灭菌锅自然冷却。
注意：①先打开放气阀，再打开锅盖。（以免锅内压力大而爆炸！）
②开盖后应尽快转移培养瓶，使培养瓶冷却、凝固。一般应将灭菌后的培养瓶储藏于30℃以下的室内，最好储藏在4-10℃的条件下。
③某些生长调节剂如IAA、ZT、ABA等以及某些维生素遇热是不稳定的，不能同培养基一起高压灭菌，而需要进行过滤灭菌。

四、作业
1、将本次实训内容写成实训报告。
2、高压灭菌时应注意哪些问题？
3、配制培养基时应注意哪些问题？

[编辑本段]
MS培养基的配制步骤
　　这样每次使用时，取其总量的1/20(50 mL)或1/200(5 mL)，加水稀释，制成培养液。现将制备培养基母液所需的各类物质的量列出，供配制时使用。
　　大量元素(母液Ⅰ) mg／L
　　NH4NO3 33 000
　　KNO3 38 000
　　CaCl2·2H2O 8 800
　　MgSO4·7H2O 7 400
　　KH2PO4 3 400
　　微量元素(母液Ⅱ)
　　KI 166
　　H3BO3 1 240
　　MnSO4·4H2O 4 460
　　ZnSO4·7H2O 1 720
　　Na2MoO4·2H2O 50
　　CuSO4·5H2O 5
　　CoCl2·6H2O 5
　　铁盐(母液Ⅲ)
　　FeSO4·7H2O 5 560
　　Na2-EDTA·2H2O 7 460
　　有机成分(母液Ⅳ)ⅣA
　　肌醇 20 000
　　ⅣB烟酸 100
　　盐酸吡哆醇(维生素B6) 100
　　盐酸硫胺素(维生素B1) 100
　　甘氨酸 400
　　以上各种营养成分的用量，除了母液Ⅰ为20倍浓缩液外，其余的均为200倍浓缩液。
　　上述几种母液都要单独配成1 L的贮备液。其中，
　　母液Ⅰ、母液Ⅱ及母液Ⅳ的配制方法是：每种母液中的几种成分称量完毕后，分别用少量的蒸馏水彻底溶解，然后再将它们混溶，最后定容到1 L。
　　母液Ⅲ的配制方法是：将称好的FeSO4·7H2O和Na2-EDTA·2H2O分别放到450 mL蒸馏水中，边加热边不断搅拌使它们溶解，然后将两种溶液混合，并将pH调至55，最后定容到1 L，保存在棕色玻璃瓶中。各种母液配完后，分别用玻璃瓶贮存，并且贴上标签，注明母液号、配制倍数、日期等，保存在冰箱的冷藏室中。
　　MS培养基中还需要加入：2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、萘乙酸(NAA)、6-苄基嘌呤(6-BA)等植物生长调节物质，并且分别配成母液(01 mg/mL)。其配制方法是：分别称取这3种物质各10 mg，将2，4-D和NAA用少量(1 mL)无水乙醇预溶，将6-BA用少量(1 mL)的物质的量浓度为0.1 mol/L的NaOH溶液溶解，溶解过程需要水浴加热，最后分别定容至100 mL，即得质量浓度为01 mg/mL的母液。
　　配制培养液 用量筒或移液管从各种母液中分别取出所需的用量：母液Ⅰ为50 mL，母液Ⅱ、Ⅲ、ⅣA和ⅣB各5 mL。再取2，4D 5 mL、NAA 1 mL，与各种母液一起放入烧杯中。
MS培养基配制培养液时的注意事项
　　配制培养液时应注意：
　　①在使用提前配制的母液时，应在量取各种母液之前，轻轻摇动盛放母液的瓶子，如果发现瓶中有沉淀、悬浮物或被微生物污染，应立即淘汰这种母液，重新进行配制；
　　②用量筒或移液管量取培养基母液之前，必须用所量取的母液将量筒或移液管润洗2次；
　　③量取母液时，最好将各种母液按将要量取的顺序写在纸上，量取1种，划掉1种，以免出错。溶化琼脂 用粗天平分别称取琼脂9 g、蔗糖30 g，放入1 000 mL的搪瓷量杯中，再加入蒸馏水750 mL，用电炉加热，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状。然后再将配好的混合培养液加入到煮沸的琼脂中，最后加蒸馏水定容至1 000 mL，搅拌均匀。
　　需要注意的是，在加热琼脂、制备培养基的过程中，操作者千万不能离开，否则沸腾的琼脂外溢，就需要重新称量、制备。此外，如果没有搪瓷量杯，可用大烧杯代替。但要注意大烧杯底的外表面不能沾水，否则加热时烧杯容易炸裂，使溶液外溢，造成烫伤。调pH 用滴管吸取物质的量浓度为1 mol/L的NaOH溶液，逐滴滴入溶化的培养基中，边滴边搅拌，并随时用精密的pH试纸(5.4～7.0)测培养基的pH，一直到培养基的pH为5.8为止(培养基的pH必须严格控制在5.8)。培养基的分装 溶化的培养基应该趁热分装。分装时，先将培养基倒入烧杯中，然后将烧杯中的培养基倒入锥形瓶(50 mL或100 mL)中。注意不要让培养基沾到瓶口和瓶壁上。锥形瓶中培养基的量约为锥形瓶容量的1/5～1/4。每1 000 mL培养基，可分装25～30瓶。培养基分装完毕后，应及时封盖瓶口。用2块硫酸纸(每块大小约为9 cm×9 cm)中间夹1层薄牛皮纸封盖瓶口，并用线绳捆扎。最后在锥形瓶外壁贴上标签。
高压灭菌 培养基的高压灭菌 步骤
　　高压灭菌 培养基的高压灭菌包括以下几个步骤。
　　第一，码放锥形瓶。将装有培养基的锥形瓶直立于金属小筐中，再放入高压蒸气灭菌锅内。如果没有金属小筐，可以在两层锥形瓶之间放一块玻璃板隔开。
　　第二，放置其他需要灭菌的物品。将其他需要灭菌的物品也放入高压蒸气灭菌锅内，如装有蒸馏水的锥形瓶、带螺口盖的玻璃瓶、烧杯、广口瓶(以上物品都要用牛皮纸封口)，用牛皮纸包裹的培养皿、剪刀、解剖刀、镊子、滤纸、铅笔等。
　　第三，灭菌。待需要灭菌的物品码放完毕，盖上锅盖。在98 kPa、121.3 ℃下，灭菌20 min。灭菌后取出锥形瓶，让其中的培养基自然冷却凝固。最好放置1 d后再使用。