DNA电泳常见问题分析.doc

DNA电泳常见问题凝胶电泳操作注意事项1、 琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同，影响DNA的迁移及荧光背景的强度，应有选择地使用。2、凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶化的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出现气泡，以免影响电泳结果。3、电泳缓冲液：为保持电泳所需的离子强度和pH，应经常更新电泳缓冲液。4、样品加入量：一般情况下，0.5cm宽的梳子可加0.5g的DNA量,加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定.当加样孔大时,样品上样量应相应加大,否则会造成条带浅甚至辨认不清;反之则应适当减少加样量，但是上样量过多会造成加样孔超载，从而导致拖尾或弥散，对于较大的DNA此现象更明显。5、DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率，平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响。6、DNA迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度，迁移分子的形状及大小。采用不同浓度的凝胶有可能分辩范围广泛的DNA分子，制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度。小片段DNA的检测应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，以提高分辨率。7.选择的实验材料要新鲜，处理时间不易过长。8.在加入细胞裂解缓冲液前，细胞必须均匀分散，以减少DNA团块形成。9. 提取的DNA不易溶解：不纯，含杂质较多；加溶解液太少使浓度过大。沉淀物太干燥，也将使溶解变得很困难。10. 电泳检测时DNA成涂布状：操作不慎；污染核酸酶等。11.分光光度分析DNA的A280/A260小于1.8；不纯，含有蛋白质等杂质。在这种情况下，应加入SDS至终浓度为0.5%，并重复步骤28。12.酚/氯仿/异戊醇抽提后，其上清液太黏不易吸取：含高浓度的DNA，可加大抽提前缓冲液的量或减少所取组织的量DNA电泳常见问题分析之一1 请问配制聚丙烯酰胺凝胶电泳胶时，促凝的是TEMED还是过硫酸铵？胶聚时间很长如何解决？过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所需的自由基，而TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速它俩的聚合。胶聚合时间长可能是TEMED失效了，过硫酸铵固体时间过久也会失效的。一个让PAGE胶很快聚合的方法：不要先配AP（过硫酸铵）溶液，因为AP很容易变质。在保证TEMED和AP质量的情况下，每次配胶时，直接称一定量的AP粉剂溶入液体状态的PAGE中，这样可以保证AP的催化能力，而且可以多加一点。配25ml的PAGE胶，加0.03克AP粉剂，最后加入25ulTEMED，20分钟左右就可以凝固（当然这个时候拔梳子，会有少量未凝固的PAGE在孔里形成丝状干扰，使加的样品看起来不太漂亮，但一般不影响跑胶效果和条带的形状和位置）。 2 DNA电泳的MARKER怎么是扭曲的？1、 配制胶时的缓冲液需要和电泳缓冲液不是同时配制的.最好是同时配制.电泳时缓冲液高过液面12mm即可。2、 电泳时电压过高,可以在电泳前15分钟用较低电压(3V/cm),等条带出孔后比较漂亮了.然后再调电压。3、 上样时尽量慢慢加样,等样品自然沉降后再加电压。 3 跑出的DNA带模糊？1、 DNA降解：避免核酸酶污染。2、 电泳缓冲液陈旧:电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液。3、 所用电泳条件不合适:电泳时电压不应超过20V/cm，温度30；巨大DNA链电泳，温度应15；核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力。4、 DNA上样量过多：减少凝胶中DNA上样量。5、 DNA样含盐过高：电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐。6、 有蛋白污染：电泳前酚抽提去除蛋白。7、 DNA变性：电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。4 有不规则DNA带迁移?1、 对于/Hind III片段cos位点复性：电泳前于65加热DNA 5分钟，然后在冰上冷却5分钟。2、 电泳条件不合适：电泳电压不超过20V/cm；温度30；经常更换电泳缓冲液。3、 DNA变性：以20mM NaCl Buffer稀释DNA，电泳前勿加热。5 跑出的DNA条带带弱或无DNA带？1、 DNA的上样量不够：增加DNA的上样量；聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度稍高，上样量可适当降低。2、 DNA降解：避免DNA的核酸酶污染。3、 DNA走出凝胶：缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度。4、 对于EB染色的DNA，所用光源不合适?应用短波长（254nm）的紫外光源。6 跑出的DNA带缺失不完整是怎么回事?1、 如果是小DNA带走出凝胶，可以缩短电泳时间或降低电压或增强凝胶浓度。2、 分子大小相近的DNA带不易分辨?增加电泳时间，核准正确的凝胶浓度。3、 DNA 变性：电泳前请勿高温加热DNA链，以20mM NaCl Buffer稀释DNA。DNA链巨大，常规凝胶电泳不合适?在脉冲凝胶电泳上分析。7 做PCR电泳后跑电泳，目的基因是489BP的，结果每次切胶回收后再跑电泳就变成500多了，快到600了？为什么？有时只靠电泳结果判断是不准确的，同样的片段每次跑的远近会有不同。有经验显示目的片段是1300多，结果就跑到1000的marker下面去了，后来证实片段没有问题。也有做的一个片段也是这样，是490BP.理论上两个条带一样，可是PCR结果显示就是大小不一致。然后回收以后的检测结果又全部都一样了，后来又拿去做了下一个测序，才知道根本没有问题。8：为什么marker条带非常模糊，无法辨别具体条带？ A：出现上述情况，可能有以下几个原因：1. marker条带出现了降解。请确保在使用过程中避免核酸酶污染；2. 电泳缓冲液陈旧。电泳缓冲液多次使用后，离子浓度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果，建议经常更换电泳缓冲液；3. 电泳条件不合适。电泳时电压应不超过20V/cm，温度应低于30；4. marker上样量过多。请根据说明书选用合适上样量；5. 凝胶质量不好。建议使用质量较好的琼脂糖；此外，凝胶凝固不均匀也会导致条带模糊。9：为什么marker条带出现不规则的条带（如哑铃状等）？ A：出现上述情况，多与以下几个原因有关：1. 电泳缓冲液陈旧。老化的电泳缓冲液离子浓度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果，建议经常更换电泳缓冲液；2. 电泳条件不合适。电泳时电压应不超过20V/cm，电压太高可能也会导致marker条带出现不规则现象。此外，凝胶质量差以及凝胶冷却时凝固不均匀也会导致该现象出现。10为什么marker条带非常弱或者根本没有条带？ A：出现上述情况可能是：1. marker上样量较低，可适当增加上样量；2. 凝胶质量较差或凝胶凝固不均匀也会导致电泳条带弱或根本没有条带；3. 电泳时间过长导致marker条带跑出凝胶，可缩短电泳时间，降低电压，增加凝胶浓度。11：为什么marker缺带？ A：对于含有较小片段的marker，如果出现缺带现象，可能是因为：1. 小条带跑出凝胶或分子量大小非常相近的条带不易辨认所致，可适当缩短电泳时间，降低电压，同时增加凝胶浓度；2. 凝胶中EB含量过低，导致大片段结合EB量太少或没有，在紫外光下亮度太低，可适当增加EB用量。问题原因解决办法DNA带模糊DNA降解避免核酸酶污染电泳缓冲液陈旧电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液所用电泳条件不合适电泳时电压不应超过20V/cm，温度30；巨大DNA链电泳，温度应15；核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力DNA上样量过多减少凝胶中DNA上样量DNA样含盐过高电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐有蛋白污染电泳前酚抽提去除蛋白DNA变性电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA不规则DNA带迁移对于/Hind III片段cos位点复性电泳前于65加热DNA 5分钟，然后在冰上冷却5分钟电泳条件不合适电泳电压不超过20V/cm；温度30；经常更换电泳缓冲液DNA变性以20mM NaCl Buffer稀释DNA，电泳前勿加热带弱或无DNA带DNA的上样量不够增加DNA的上样量；聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度稍高，上样量可适当降低DNA降解避免DNA的核酸酶污染DNA走出凝胶缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度对于EB染色的DNA，所用光源不合适应用短波长（254nm）的紫外光源DNA带缺失小DNA带走出凝胶缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度分子大小相近的DNA带不易分辨增加电泳时间，核准正确的凝胶浓度DNA 变性电泳前请勿高温加热DNA链，以20mM NaCl Buffer稀释DNA DNA链巨大常规凝胶电泳不合适 在脉冲凝胶电泳上分析问题可能原因解决方法DNA Marker降解核酸酶污染每次吸取时更换灭菌枪头，勿将电泳缓冲液带入管中；用后密闭4C保存保存不当4C 或-20C保存，避免多次反复冻融；不可加热DNA Marker无法正确分离琼脂糖质量差使用质量可靠的琼脂糖制胶电泳缓冲液多次使用后失效更换缓冲液条带黯淡核酸浓度过低增加上样量核酸降解使用不含核酸酶的试剂和耗材制备样品DNA条带被示踪染料掩盖提高上样量；避免使用与目的片段迁移率相同的示踪染料条带模糊或弥散电泳缓冲液多次使用后失效更换缓冲液核酸部分降解使用不含核酸酶的试剂和耗材制备样品核酸样品纯度差，含有DNA结合蛋白或高浓度的盐份酚/仿抽提或乙醇沉淀去除蛋白、盐份等杂质电压过低，电泳时间过长根据凝胶大小和电泳缓冲液类型，使用适当的电压进行电泳染色时间过长或拍照前放置过久，DNA条带弥散电泳结束后及时观察、拍照条带缺失DNA条带分子量过大使用脉冲凝胶电泳分子量接近的DNA条带没有分开选择适当的凝胶浓度进行电泳电泳缓冲液使用不当SD和TBE缓冲液适于分析较小分子量的DNA片段，大片段分子不能完全分离；TAE缓冲液不适于分离很小的DNA片段电泳时间过长或电压过高，DNA走出凝胶缩短电泳时间，调整电压电极插反，DNA走出凝胶正确连接电极方向条带大小不正确核酸降解或形成聚合物加热处理或重新制备样品 DNA酶切Marker的cos位点复性电泳前65C加热5分钟，冰上冷却5分钟以后再上样相同分子量的DNA片段由于结构或序列的差异而有不同的迁移率判断DNA分子是否有特殊结构，如缺口、超螺旋、二聚体等；富含AT碱基的DNA迁移率比同分子量富含GC碱基的DNA片段慢梳子变形，点样孔不在同一水平线上使用完好的梳子制胶带型异常不同样本的上样条件不同选用相同的上样缓冲液，上样量尽可能接近上样量过大或过小选择合适大小的上样孔，样品应完全覆盖点样孔底部核酸样品纯度差，含有DNA结合蛋白或高浓度的盐份酚/仿抽提或乙醇沉淀去除蛋白、盐份等杂质电泳缓冲液未完全浸没凝胶上样和电泳时，确保缓冲液始终能完全覆盖凝胶电压过高或电泳时间过长致使凝胶过热和DNA变性根据凝胶大小和电泳缓冲液类型，使用适当的电压进行电泳凝胶中加入EB造成染色不均加入EB时充分混匀或电泳结束后再染色凝胶中有气泡或污染物使用纯水和洁净容器制胶；缓慢灌胶，并赶除气泡点样孔质量差待凝胶完全凝聚后再取出梳子；