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肠道菌群细菌的鉴定
一、实验目的
1.掌握革兰染色法。
2.掌握IMViC试验。

二、仪器与试剂
玻片，接种环，生理盐水，酒精灯，结晶紫溶液，卢戈氏染液，石炭酸-复红溶液，沙黄液，光学显微镜，二甲基氨基苯甲醛试剂，葡萄糖蛋白胨水培养基，甲基红试剂（甲基红0.02g，95%酒精60mL，蒸馏水40mL），6%α-萘酚酒精溶液，40% KOH，铵盐作为唯一氮源，并利用枸橼酸盐作为唯一碳源的培养基，层析滤纸，正丁醇，甲酸，1.5%乳酸，1.5%乙酸溶液，3%溴甲酚蓝酒精溶液，层析缸，需氧血琼脂平板，厌氧血琼脂平板，七叶苷培养基，胆汁七叶苷培养基，65g/L NaCl血清肉汤，PYR试剂DNA琼脂平板，1 mol/L盐酸，MRS培养基，X-Gal。

三、实验步骤
1.革兰染色法
（1）涂片：取玻片在火焰上稍微加温，以清洁纱布擦净，放置桌上，左手握培养皿，右手持接种环，用无菌接种环取生理盐水一滴，置于载玻片的中央，再用接种环在火焰上灭菌，待冷却后，取培养细菌少许与盐水混匀，直接取1~2环菌液作涂片即可，涂片应厚薄均匀。接种环采菌后，要通过火焰灭菌才能放下。

（2）干燥：目的是是菌体水分慢慢蒸发，固定菌形。涂片最好在室温中自然
干燥，必要是将标本面向上，小心断续在弱火高处略烘，以助水分蒸发；但切勿紧靠火焰，以致标本烤枯，不堪检视。

（3）固定：手执玻片一端，标本面向上，在火焰外层快速地来回通过三次，共2-3秒，以玻片反面触及皮肤不觉过烫为度。冷却后，染色。目的是杀死细菌，是菌体与玻片粘附较牢以及改变对染料的通透性，因活的细菌一般不能使许多染料进入细胞。 

（4）初染：将涂片标本夹持于左手，滴加结晶紫溶液盖满涂抹面，染色1~3分钟，用流水缓缓冲洗（即将龙头打开使水缓慢流出，将玻片倾斜使水在玻片面上端沿玻片流下冲洗染液）直至无颜色流下为止。

（5）媒染：加卢戈氏染液4~5滴作用30秒到一分钟，再按上法冲洗，并将片上积水轻轻洒净。

（6）脱色：在95%酒精缸中脱色约3~5秒，拿出玻片使酒精由玻片流下，如此反复2~3次，直至流下酒精略呈淡紫色为止，现按上法以流水冲洗，并将玻片轻轻洒净。

（7）复染：
用稀释石炭酸-复红（或沙黄液）复染半分钟后按上法冲洗。

（8）光学显微镜下观察细菌染色情况

（9）G+菌被染成紫色；G-菌被染成红色。 
2.大肠杆菌
（1）革兰染色法
实验结果应为被染成红色，即G-菌。 

（2）IMViC试验
靛基质（吲哚）试验
斑点试验法：将一片滤纸放在培养皿的盖子上或一张载玻片上，滴加1~1.5mL二甲基氨基苯甲醛试剂液于滤纸上使其变湿，取18~24h琼脂平板培养物涂布于浸湿的滤纸上，在1~3min内观察。棕色的试剂由紫红变为红色者即为阳性。
甲基红（MR）试验：取一种细菌的24h培养物，接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，置37℃培养48~72h，取出后加甲基红试剂3~5滴，立即观察结果。如果培养液呈红色者为阳性，橙色者为可疑，黄色者为阴性。
二乙酰（V-P）试验：将被检细菌接种于葡萄糖蛋白胨水培养基后，于35~37℃培养48h，于2mL培养液内加入甲液（6%α-萘酚酒精溶液）1mL和乙液（40% KOH）0.4mL，摇振混合。试验时强阳性者约于5min后，可产生粉红色反应。如长时间无反应，置室温过夜，次日不变者为阴性。
枸橼酸盐利用试验：将被检细菌少量接种到培养基（铵盐作为唯一氮源，并利用枸橼酸盐作为唯一碳源）中，37℃培养2~4d，观察培养基颜色变化。培养基变蓝色，阳性；不变，阴性。
实验结果应分别为：阳性，阳性，阴性，阴性。
3.乳酸杆菌
（1）革兰染色法
实验结果应为被染成紫色，即G+菌。 

（2）乳酸纸层析法
层析滤纸的制备——将层析滤纸剪成1.5cm*11cm的长条状，在距层析纸一端约4cm处用铅笔划线确定点阳线，使用前充分干燥。
配制展开剂——正丁醇:甲酸:水=80:15:5
配制标准液——配制1.5%的乳酸、1.5%的乙酸溶液。
制备待测样品——将培养基菌种加入生理盐水37℃培养24h后离心，收集上清液离心，收集上清液。
点样——用毛细管分别吸取发酵液，多次点样于滤纸条上，样点直径不宜超过2mm平衡2h
层析——将点好样的层析纸放入，使点有样品的一端浸在展开剂中，但不可浸及样点。观察展开情况，待展开剂前沿到达离层析纸另一端约1.5cm处，取出层析纸。
显色——以3%溴甲酚蓝酒精溶液为显色剂，待层析液挥发之后，向层析滤纸喷洒并计算Rf值。
实验结果Rf值应该一致。

4.脆弱拟杆菌
耐氧试验
从每个琼脂平板上挑取4~5 个性状不同的菌落，每个菌落分别转种于2 块需氧血琼脂平板和1 块厌氧血琼脂平板(每个琼脂平板可划4~6 区，每区种一个可疑菌落) ，然后将平板分别放置在需氧、二氧化碳和厌氧环境中培养。
实验结果应为在厌氧环境生长，而在需氧和二氧化碳环境中不生长。

5.肠球菌
（1）革兰染色法
实验结果应为被染成紫色，即G+菌。

（2）触酶试验
取洁净玻片1张，用接种环挑取细菌，加3% H2O2 1滴，立即观察结果。
实验结果应为无气泡，即阴性。

（3）七叶苷水解试验
将待检菌接种于七叶苷培养基中，培养后观察结果。
实验结果应为培养基变为黑色，即阳性。

（4）65g/L NaCl生长试验：
将待检菌接种65g/L NaCl血清肉汤中，35℃孵育18-24h。
实验结果应为细菌生长且使得培养基变黄，即阳性。

（5）PYR试验：
挑取被检菌落在含有PYR的纸片上涂擦， 35℃孵育5min，再于纸片上滴加PYR试剂约1min后观察纸片颜色。
实验结果应为纸片呈红色，即阳性。

6.梭杆菌属
（1）靛基质（吲哚）试验
实验结果应为棕色的试剂由紫红变为红色者，即阳性。

（2）DNA酶试验法：
DNA琼脂平板上点种待检菌，35℃孵育18~24h，用1 mol/L盐酸倾注平板，观察结果。
实验结果应为菌落周围有透明区，即阳性。

（3）触酶试验
取洁净玻片1张，用接种环挑取细菌，加3%H2O2 1滴，立即观察结果。
实验结果应为有气泡，即阳性。

7.双歧杆菌
（1）革兰染色法
实验结果应为被染成紫色，即G+菌。

（2）在基础改良MRS培养基中添加X-Gal，对双歧杆菌进行检测 
双歧杆菌单独表面涂布呈白色或浅兰色，标准双歧杆菌表面涂布37℃48h。培养后，双歧杆菌呈白色或浅兰色,边缘整齐,表面隆起部分显白色，菌落背面观察呈兰色底晕，随机挑取5个白色菌落经革兰氏染色涂片镜检，该菌为革兰氏阳性，呈各种分叉，V形，棍棒状，单个，成对，或链状排列，多种不规则形状，即可基本判定为双歧杆菌。 

四、注意事项
使用革兰染色法应避免脱色的时间过少，以免将G-菌染成紫色。