MSOP 标本处理.doc

MSOP-A-1
标本处理

MSOP-A-2
尿标本的处理

MSOP-A-3
上呼吸道标本的处理

MSOP-A-3.I
细菌性咽颊炎的实验室诊断

MSOP-A-3.II
白喉的实验室诊断

MSOP-A-3.III
百日咳的实验室诊断

MSOP-A-3.IV
鼻窦炎的实验室诊断

MSOP-A-3.V
奋森(氏)咽峡炎的实验室诊断

MSOP-A-4
下呼吸道标本的处理

MSOP-A-5
军团菌的实验室诊断

MSOP-A-6
类鼻疽-Pseudomonas pseudomallei的实验室诊断

MSOP-A-7
胃肠道标本的处理

MSOP-A-8
挤压出乳奶的实验室诊断

MSOP-A-9
无菌体液的培养（血液、脑脊液、尿液除外）

MSOP-A-10
骨骼和组织的培养

MSOP-A-11
其他拭子的培养

MSOP-A-12
特殊标本的处理

芽孢管-湿热灭菌的生物指示剂

甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌（MRSA）的筛选

静脉内导管头的培养（Maki 技术）

灭菌物品的培养-

血液透析器来源的透析液的定量培养

血液制品的培养？？

水标本的细菌计数

细菌培养标本处理流程表

年度总结和修改记录

MSOP-A-1 标本处理
I. 原理
微生物实验室的主要功能是检验和培养微生物标本，对重要的致病菌准确鉴定并按照要求进行抗生素药敏试验。
标本处理是标本分析的重要环节。要最小限度对标本进行处理：保证标本的连续性和完整性，并减少标本中苛养菌的死亡机会和正常菌群的过度生长；正确的化验申请；可接受的标本；适当的容器和运输培养基才能满足我们的要求（见样本采集指南）。
II. 程序
o 样本的接收
o 检查申请单上病人信息是否与标本相符合。
o 检查申请单上病人信息
a. 病人姓名是否完整、清晰。
b. 申请单号码和住院号。
c. 标本来源描述是否完整、清晰、特异。
d. 申请医师的姓名是否完整、清晰。
e. 标本采集日期。
f. 诊断/临床病史
g. 用过的抗生素。
h. 接收日期
o 检查容器和运输培养基是否合适。
o 检查标本是否泄漏。
o 仔细总结和分析标本是否符合申请单的要求
o 给标本标注一个实验室号码用于实验室内部使用
III. 标本拒收标准
o 泄漏
o 对于非侵袭性的标本（尿，痰，或喉）
拒收标本并在申请单上标注-“标本容器泄漏”（附1）并要求重新送检。
在本室拒收标本登记表上登记。
o 对于侵袭性程序采取的标本（CSF，体液或组织）
处理前联系临床医生说明情况并征求意见，并在化验单上标注。
o 标签丢失或与化验单不符
o 对于非侵袭性的标本（尿，痰，或喉）
拒收标本并在申请单上注明原因；
在本室拒收标本登记表上登记。
o 对于侵袭性程序采取的标本（CSF，体液或组织）
征求临床取标本医生的意见。
o 拒收所有迟送的尿标本，并注明原因。
o 拒收Foley 导管头做培养，要求其送检尿标本。
o 用非无菌容器送检标本作细菌培养。
o 对于非侵袭性的标本（尿）
拒收标本并注明原因
o 对于侵袭性程序采取的标本（CSF，体液或组织等）
征求临床取标本医生的意见
o 拒收唾液标本做痰培养（特别指出的除外），并要求重新送检。
o 标本与申请单不符
o 用尿做淋球菌培养。
o 可能被正常菌群污染的标本（例如：尿，喉拭子等）不能做厌氧培养。
o 有大量上皮细胞的痰标本怀疑为口咽部菌群污染。该标本不适合作进一步培养应要求重新送检。
o 拒收其他实验室开展的实验项目（附一）。（例如：粪潜血试验）-“细菌室不做该实验，请与其他实验室联系”
o 拒收干燥的吸头（如：静脉导管，心脏导管）并注明-“干燥吸头不适于培养，因为它们在通过皮肤和粘膜层时可能不经意的污染。进一步咨询，请联系细菌室。”
o 拒收气管内管道做培养，注明-“不合适的标本。该检测未做。如有临床指征，请送气管抽吸液或痰标本送检。
o 拒收鼻咽抽吸物做培养并注明-“该该检测未做，因为常规鼻咽抽吸物做培养不能提供有临床价值的信息。”
o “拒收”单和/或标本应放置在一起，并注明拒收原因。
IV. 标本保存
o 处理前
o 室温保存
温度敏感的细菌（如：化脓链球菌，脑膜炎奈瑟菌，百日咳杆菌等）
所有咽拭子（直肠拭子除外），手术组织和体液
o 4度保存
含正常菌群可能过渡生长的标本。
粪，痰，尿标本和尸检组织
o 处理后
o 大部分标本在丢弃前要放置一周，特殊标本如CSF保存更长。
o 室温保存
含温度敏感的细菌的标本和难以重复检出的细菌（如百日咳杆菌），
经鼻或口咽部的拭子
o 4度保存
以上类型之外的标本
o 用于血清学检测的标本，上午8：00-11：00，其余时间放置4度保存。
V. 参考文献
附录1 拒收单A
o 请咨询细菌室
o 标本容器泄漏
o 空容器
o 收到的运输拭子未使用
o 标本送检太迟
o 请注明病人姓名、性别、年龄、和住院号
o 要求特别注明实验目的
o 特殊类型的标本
o 临床信息不全
o 非无菌容器，不适合用于培养
o 未收到标本
o 未收到申请单
o 标本不合适，不能提供相关临床信息
o 细菌室未开展本实验，请联系其他实验室
o 病人资料与瓶上和申请单上标本类型不符
o 不合适的标本。实验未做，如果临床需要请送气管抽吸物或痰标本送检。
o 实验未做。因为常规鼻咽部抽吸液细菌培养不能提供有用的信息。
o 干燥吸头不适于培养，因为它们在通过皮肤和粘膜层时可能不经意的污染。进一步咨询，请联系细菌室。

MSOP-A-2 尿标本的处理
I. 原理
尿常规为脓尿的标本可做出辅助诊断。尿标本必须做定量培养。标本在培养前应放置冰箱以避免细菌复制。正确处理并接种的尿标本>105,用显著的临床意义。不过，急性膀胱炎菌落计数结果可能低一些。
II. 标本
3. 类型
A. 无菌中段尿（MSU）
B. 导管尿（CSU）
C. 无菌尿：耻骨弓上尿，输尿管尿
D. Foley’s 导管尿，耻骨弓上的导管尿，malcclot引流管和尿道管头不适合作尿培养，可以做CSU培养
E. 拒收尿标本作G.C培养，要求送检尿道拭子。
F. 拒收尿标本的做厌氧培养，穿刺尿除外。
4. 标本运输
A. 采集标本后应尽快送检尿标本到实验室，因为容器内无保护剂。
B. 标本采集后放置如果>24 h，将被拒收。在申请单上注明“标本放置时间过长，请重新取标本送检”。
III. 材料
3. 培养基
A. 胱氨酸乳糖电解质缺乏的琼脂（CLED）
B. 血琼脂
C. 麦康克琼脂
4. 试剂和材料
A. 10ul标准接种环（）
IV. 质量控制
3. 培养基使用之前，QC由培养基组负责。
4. 10ul接种环的QC证明由厂家负责提供。
5. 操作
V. 培养程序
3. 不同的尿标本按照类型不同选择不同的培养基（表1）
VI. 定量接种尿标本
3. 把0.01ml定量接种环垂直插入重复混匀的尿标本中，让尿附着在环上。
4. 把环上尿标本，涂布琼脂板上。
5. 再次将接种环垂直插入尿标本中，接种另一块平板。
6. 怀疑为伤寒热培养/肠热/伤寒沙门菌携带者做尿培养，按如下方法：
A. 15-20ml尿标本3000rpm离心15分钟。
B. 接种沉淀到SF肉汤。
C. 35度过夜培养后转种麦康克或DCA平板。
7. 用于诊断细菌性前列腺炎的培养，按照图1 用Stamey 方法进行操作。
VII. 参考文献：
标本
CLED
血平板
中国兰
备注
MSU，尿袋，注射器穿刺尿，管道尿
+

定量接种环
导管尿，CSU
+

定量接种环
耻骨弓上尿

+
+
定量接种环
输尿管尿

+
+
定量接种环
肾造瘘术尿

+
+
定量接种环
malcclot引流管尿

+
+
定量接种环
硅橡胶管

+
+
定量接种环
PCN（经皮引流）

+
+
定量接种环
表1 尿标本培养基和方法的选择图1 “Stamey 方法”
VB：膀胱排出的尿 EPS: 挤出的前列腺分泌物

VB1
VB2
VB3
EPS
0.01ml
10ul接种环
0.1ML
9.9ml H2O
(1:100稀释)
0.01 ml
10ul接种环

血琼脂，CLED，
中国兰，&G.C
×100
血琼脂，CLED，
中国兰，&G.C
×10000

+

MSOP-A-3 上呼吸道标本的处理
大部分步骤需要在生物安全柜内接种
I. 细菌性咽炎的实验室诊断
A. 原理
大多数上呼吸道感染是由病毒引起的。细菌性咽炎经常是由化脓性链球菌引起。但重度的会厌炎和喉气管炎则是例外，其一般是由于b型流感嗜血杆菌引起。
B. 标本
从扁桃体和后咽部采集标本的咽拭子
C. 选择性培养基（如表1）
1. 5%羊血琼脂
2. 含抗生素的Thayer Martin 琼脂（GC+）和无抗生素的(仅用于淋病奈瑟菌病例)
3. 巧克力琼脂（仅用于会厌炎和喉气管炎病例）
D. 质量控制
培养基使用之前，QC由培养基组负责。
E. 培养程序
1. 在1/6琼脂表面用力滚动拭子，并划线分离。
2. 在一区用接种针穿刺血平板几次。（图1）
3. 把平板放置在5%CO2培养。
图1 咽拭子的划线技术图解

II. 白喉的实验室诊断
A. 原理
临床白喉有两种类型：鼻咽和皮肤型。咽部白喉的体征从轻度咽炎到因假膜生成导致气道损害引起缺氧症状等变化很大。皮肤白喉型的皮肤损害通常覆盖着一层灰褐色的假膜。致命的系统性并发症，主要表现为失去运动功能。（例如：吞咽困难）和充血性心力衰竭，可能是白喉毒素作用于周围运动神经元和心肌引起的，虽然白喉在接种白喉疫苗的地区发病很罕见，但白喉也可爆发于非免疫地区或免疫妥协的人群。
B. 标本
1. 从扁桃体和后咽部采集标本的咽拭子
2. 鼻咽拭子
3. 对于皮肤白喉，应送检皮肤标本。
C. 选择性培养基（见表1）
1. 5%羊血琼脂
2. 巧克力琼脂
3. Hoyle’s培养基（cytsine tellurite blood）
4. Loeffler 琼脂斜面
D. 质量控制
1. 在1/6琼脂表面用力滚动拭子，并划线分离。
2. 在Loeffler琼脂斜面滚动拭子
3. 把平板放置在5%CO2培养。
III. 百日咳的实验室诊断
A. 原理
博德特氏百日咳菌引起痉咳，是一种严重的呼吸道感染，其表现为
IV. 鼻窦炎的实验室诊断
V. Vincent’s咽峡炎的实验室诊断
表1 咽拭子/鼻拭子/鼻咽拭子/口腔拭子
标本
血平板
巧克力平板
特殊培养基
咽拭子
+a

咽拭子（白血病或中性白细胞减少症的病人）
+
+
中国兰琼脂b
咽拭子（急性epigottitis 病人）
+
+

咽拭子（疑似白喉的病人
+
+
Loeffler’s 和Hoyle’s培养基
鼻拭子
+
+

鼻咽拭子
+
+
碳平板用于“痉咳”
口腔拭子/口腔溃疡拭子
+
+
PAGO平板
a所有咽拭子，请用接种环穿刺琼脂内，以便观察beta-溶血链球菌的溶血情况。
b用于鉴定该类病人革兰阴性杆菌引起的感染
VI. 参考文献
MSOP-A-4 下呼吸道标本的处理
大多数标本需要在安全柜内操作
常规细菌培养
I. 原理
下呼吸道感染包括支气管炎，细支气管炎和肺炎。以上炎症，特别是肺炎，可以引起严重甚至是致命的疾病。虽然病毒，支原体，立克次(氏)体和真菌都可以引起下呼吸道感染，但细菌是主要的病原体，其所占的比例要比上呼吸道感染要高很多。
II. 标本
A. 痰
B. 气管或经气管壁抽吸物
C. 支气管标本
支气管灌洗液，毛刷，活检标本
III. 材料
A. 培养基
B. 5%羊血平板
C. 巧克力平板
D. 中国兰
E. 念珠菌显色培养基
0. 试剂
1. Sputasol（OXOID）
IV. 质量控制
1. 培养基使用之前，QC由培养基组负责。
V. 操作程序
1. 肉眼观察
2. 记录痰标本的外观并记录在申请单背面。
3. 外观描述及简写如下：
唾液（S） 带血 （BS） 粘液状（M） 水样（W）
粘液脓性的（MP） 脓痰（P）脓性粘液痰（PM）
4. 拒收“唾液”标本并报告“标本不适合用于进一步处理”“请重留”
II. 显微镜检
1. 用拭子取所有类型标本的脓液部分涂片，（最好在60度热固定涂片2小时），并准备革兰染色
2. 低倍镜下检查涂片（10倍目镜）；定量计数10个视野下鳞状上皮细胞和白细胞平均数。按照表1分级标准记录在工作表上。
表1 痰直接涂片分级
低倍镜下细胞计数（10个视野平均数）

倍数
0
偶见
1+
2+
3+
上皮细胞
×100
无

<10
10-25
>25
WBC
×100
无
<25
/
25-75
>80(或四分之一视野> 20)
III. 如果标本要求革兰染色，在100倍目镜下检查病原体并记录在工作表上
IV. 对涂片显示上皮细胞占优势，（3+）丢掉标本并报告“涂片显示口腔正常菌群污染”“标本不适合用于进一步处理”“请重留”
V. 培养程序
A. 水样痰标本
直接接种到培养基，并划线分离
B. 脓性标本（特别是痰）-匀浆化
1. Sputasol（OXIDE）的配制
a. 无菌操作下，取瓶中的液体1.5ml，加入到18.5 ml无菌水中。无菌条件下2-8℃至少稳定48小时
2. 痰液化的常规操作程序。
a. 痰液中加入等体积的稀释后SPUTASOL
b. 旋涡振荡标本20-30 s， 并置室温15分钟
c. 再次旋涡振荡是标本达到进一步液化。准备立即接种标本。
d. 用拭子取混悬液到培养基，并划线。
C. 支气管灌洗液（BAL）的定量培养
旋涡振荡BAL并用0.01 ml定量接种环接种到平板上。
D. 放置在5%CO2培养箱内
VII. 参考文献
MSOP-A-5军团菌的实验室诊断
MSOA-6类鼻疽-Pseudomonas pseudomallei的实验室诊断
MSOP-A-7胃肠道标本的处理
I. 原理
急性感染性腹泻是由许多不同病原体引起的：细菌、病毒、原虫。细菌性腹泻主要有两种类型（1）肠毒素介导的腹泻：产肠毒素的细菌，如：霍乱弧菌和产肠毒素大肠埃希菌，它们定植在小肠上皮，分泌肠毒素刺激上皮细胞分泌大量液体，并导致内源性AMP增多。（2）侵袭性腹泻：侵袭性细菌，例如，志贺菌属和弯曲菌属，侵入肠道上皮。阴性血便、粘液便伴炎性细胞增多。例如，过度生长的艰难梭菌导致严重的结肠炎伴腹泻（假膜性结肠炎）
正常肠道内少量的菌群过度生长也可引起疾病。
II. 标本
粪便
直肠拭子
十二指肠、结肠、回肠造口术标本
III. 材料
A. 培养基
1. 中国兰
2. 脱氧胆酸盐琼脂
3. 木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂
4. 硫代硫酸盐-枸橼酸盐-胆汁-蔗糖琼脂（TCBS）-检测弧菌属
5. 活性炭头孢哌酮脱氧胆酸盐琼脂（CCD）-检测弯曲杆菌属
6. 纤维双糖精氨酸赖氨酸琼脂-检测耶尔森菌
7. 山梨醇麦康凯琼脂（SMA）-检测EHEC O157：H7
8. 环丝氨酸-头孢西丁-果糖-血琼脂平板
9. 亚硒酸盐 F 肉汤（SF）
10. 革兰阴性肉汤（GN）
11. 碱性蛋白胨水（pH 9.0，0.5%NaCL）（AP）
B. 试剂
1. 磷酸盐缓冲液 pH7.6 –用于耶尔森菌培养
2. 0.5%KOH-用于耶尔森菌培养基酸碱度调整。
IV. 质量控制
培养基使用之前，QC由培养基组负责。
V. 培养操作
A. 肉眼观测
1. 观察粪便性状，并记录在粪便标本处理单上。
2. 性状缩写如下：

水样（W） 软便（S） 疏松（L）
成型（F） 干燥（D） 伴粘液（+M）
3. 拒收“干燥”标本，并报告“标本不适合继续处理”，“请重留标本”
VI. 培养程序（按表1 选择适当的培养基）
（怀疑为sars病人的标本，应在生物安全柜内操作）
A. 常规培养
1. 接种MAC，XLD，DCA，TCBS，CCD以检测沙门菌，志贺菌，弧菌，气单胞菌，Pleisiomonas 和弯曲菌属
2. 划线分离菌落
3. 培养条件
(1). 35℃ 有氧
MAC，XLD，DCA。TCBS
(2). 42℃微需氧环境
B. 增菌技术
1. 对于特殊检查或有病史的患者的水样便，接种增菌肉汤（AP，SF，GN）
2. 放置35℃有氧环境培养
3. AP-培养6小时后，转种TCBS
GN-培养6小时后，转种XLD
SF-培养24小时后，转种XLD
C. 艰难梭菌的培养
1. 拒收成型的粪便做培养。并注明“艰难梭菌培养不适合于非腹泻病人”
2. 接种粪便至选择性培养基-CDA
3. 厌氧环境培养48小时
D. 耶尔森菌培养
1. 接种粪便至选择性培养基-CAL
2. 25℃培养24-48小时
E. 溶血性大肠埃细菌的培养（EHEC）
1. 出血性结膜炎、溶血性尿道综合征或血便，应检测EHEC
2. 接种粪便至选择性培养基SMA-检测EHECO157：H7
VII. 参考文献

MSOP-A-8挤压出乳奶的实验室诊断

MSOP-A-9无菌体液的培养（血液、脑脊液、尿液除外）
I. 原理
正常无菌部位体液的感染常常导致严重的发病率和死亡；快速的微生物学诊断（例如：革兰染色图片）有助于病人的治疗。作为感染的一个反应，体液可以积聚在身体的任何部位。无菌体液意味着即使一个致病微生物也可能是由临床意义的。
II. 标本
关节液，胸膜液，腹膜液，心包液，胆汁等。
III. 材料
1. 培养基（按表2 选择适当的培养基）
A. 中国兰琼脂
B. 血琼脂（BA）
C. 巧克力琼脂（CHO）
D. 脱氧胆酸盐琼脂（DCA）
E. 含抗生素的塞-马选择培养基
2. 厌氧培养基
A. 厌氧血平板
B. 硫酸新霉素血琼脂平板（Neo）
3. 增菌肉汤
A. 巯基乙酸肉汤
IV. 质量控制
培养基使用之前，QC由培养基组负责。
V. 培养程序
A． 数量较少的标本（<5ml）
1. 用无菌吸管轻轻混匀，加一大滴至每种培养基上，加2-3滴至肉汤中
2. 制备革兰涂片，血性标本建议推薄片。
B． 数量较多的标本（>5ml）
1. 无菌条件下转移至带螺塞得管中。
2. 3000转离心15分钟。
3. 把上清倾倒至另一无菌管中用于其它检查。
4. 用无菌吸管轻轻混匀，加一大滴至每种培养基上，加2-3滴至肉汤中
5. 制备革兰涂片，血性标本建议推薄片。
C． 培养条件
1. 35℃ CO2
MAC，BA，CHO，DCA，GC+
2. 35℃厌氧
厌氧血平板（B）和硫酸新霉素血琼脂平板（Neo）
3. 35℃有氧
巯基乙酸肉汤
D． 显微镜检验（革兰染色）
1. 准备革兰染色
a. 各种平板培养过夜后，直接用拭子涂抹在火焰烧过的玻璃片上。
b. 60℃干片机上干燥至少10分钟以杀灭玻片上的所有病原体。（结核杆菌除外）
c. 甲醇固定1分钟以保持红细胞和细菌的形态，特别是血性标本。
d. 分别在10，40，和油镜下计数上皮细胞，WBC和见到的微生物。
e. 按表1分级并记录在PUS标本处理单上
表1 杂项标本直接涂片分级标准

倍数
0
偶见
1+
2+
3+
上皮细胞
100
无
/
<10
10-25
>25
WBC
400
/
1-10
11-15
16-25
>25
E． 浓缩胆汁做湿片检查是否有寄生虫存在
F． 操作注意事项
1. 对要求做真菌和厌氧培养的标本应作革兰染色。
2. 所有骨髓，组织和活检标本应做常规培养，AFB和真菌培养
3. 用注射器采集的标本，应仔细转移至无菌容器中作进一步处理，并将注射器放置到塑料盒中。
4. 有血凝块的标本应按血培养处理
5. 下列情况要迅速通知临床医生
a. 急症革兰染色申请
b. 无菌部位（体液）观察到微生物
c. 在电话登记簿记录通报内容。
表2 无菌体液培养基的选择
标本
革兰染色
BA
BAC
Bld琼脂
Neo-bld
CHO
特殊培养基
胆汁
+
+
+
+
+
+
DCA，湿片检查卵细胞和寄生虫
关节液
（滑液）
+
+
+
+
+
+
GC+
Thio
腹膜液
+
+
+
+
+
+
Thio
心包液
+
+
+
+
+
+
Thio
胸膜液
+
+
+
+
+
+
Thio
透析液

+
+
+
+
+
Thio
引流液
+
+
+
+
+
+

查GC
+

GC+&GCO
活组织检查，组织栓子，血栓（用搅拌器匀质化标本，同时做真菌培养）
+
+
+
+
+
+
熟肉汤
精液
+
+
+
+
+
+
GC+&GCO
TM 培养基（分别报告TM和GC））
血液凝块
+
+
+
+
+

VI. 参考文献

MSOP-A-10骨骼和组织的培养
I. 原理
除了皮肤之外的骨骼、关节和软组织正常情况下是无菌部位。细菌在感染部位可以通过血源途径、外源性和内源性途径播撒到这些部位。在引起坏死的软组织感染部位，机体的防御功能是很重要的。感染会发展得非常快，需要外科和系统的抗生素治疗以清除细菌。
II. 标本
外科组织/活检组织，骨骼
III. 材料
A. 培养基
1. 需氧培养基
a. 中国兰（）
b. 血平板（BA）
c. 巧克力琼脂（CHO）
2. 厌氧培养基
a. 厌氧血平板（B）
b. 硫酸新霉素血琼脂平板（Neo）
3. 增菌肉汤
熟肉汤
B. 物品
1. 无菌研磨器
2. 无菌吸管
3. 无菌剪刀
4. 无菌管
5. 无菌拭子
6. 接种环和校准环
IV. 质量控制
培养基使用之前，QC由培养基组负责。
V. 培养程序
A. 大块组织
1. 用无菌剪子，剪成体积相似的小块。
MSOP-A-11其他拭子的培养
I. 原理
从病人身体获得的拭子或其他标本，用于细菌性感染的调查。

生殖道感染主要有两大类：（1）由性传播疾病病原体引起的感染和（2）由定植菌引起的感染。性传播病原体包括寄生虫，细菌（Treponema pallidum, 淋病奈瑟菌，Chlamydia trachomatis， Haemophilus ducreyi），和病毒。由于白色念珠菌或内源性正常菌群（Bacteroides fragilis 和肠肝菌科细菌）引起的生殖道感染不认为是性传播的。仅当vaginal 菌群失调时才会导致细菌性vaginosis

伤口感染可以由各种病原体引起，但大多数与金黄色葡萄球菌、beta-溶血链球菌、S. milleri group， 铜绿假单胞菌和肠道革兰阴性杆菌引起。鳞状上皮细胞出现可以提示标本是表皮，因此，分离出的细菌可能不是真正引起感染的病原体。
II. 标本
III.
IV.
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