自噬现象及其分子机制.docx

自噬现象及其分子机制的研究进展
发表时间：2011-6-2   来源：《中外健康文摘》2011年第8期   作者：刘杉珊 李薇
[导读] 自噬是真核细胞特有的普遍生命现象，在维持细胞自我稳态、促进细胞生存方面起重要作用。
刘杉珊  李薇（吉林大学第一医院血液肿瘤中心  吉林长春  130021）
  【中图分类号】R329 【文献标识码】A【文章编号】1672-5085 (2011)8-0448-04
    【摘要】自噬是真核细胞特有的普遍生命现象，在维持细胞自我稳态、促进细胞生存方面起重要作用，广泛参与多种生理和病理过程。自噬与细胞卫士p53的关系密切，目前已成为肿瘤研究中的一个新热点。本文对自噬的概念、生物学特性、自噬过程及其信号调控、以及与p53的关系作以概述，同时简要概述了目前自噬的研究方法和检测方法并提出问题和展望，为进一步研究自噬奠定基础。
    【关键词】  自噬  分子机制  p53
    近年来，自噬作为II型程序性细胞死亡，越来越成为除凋亡之外备受关注和研究的领域。目前自噬不仅被证实是一种细胞自我死亡的方式，同时也是一种细胞的自我保护机制，在肿瘤、老化和神经退化等细胞增殖和死亡紊乱疾病中发挥着重要的作用。因此通过对自噬的发生过程、分子机制、信号调控、及与细胞卫士P53之间关系的总结，为进一步研究其机制调控和临床应用奠定坚实的基础。
    1  自噬的概念
    自噬又称为II型程序性细胞死亡(type II programed cell death)是以胞质内出现双层膜结构包裹长寿命蛋白和细胞器的自噬体为特征的细胞“自我消化”的一系列生化过程。正常细胞内的物质主要有两种降解途径，一种通过蛋白酶体被降解，另一种是通过自噬作用。自噬主要降解细胞质的长寿命蛋白和一些细胞器的降解，这种降解有助于细胞内组分和细胞器的正常更新，而蛋白酶体主要降解胞内的短寿命蛋白[1]。
    根据细胞内底物运送到溶酶体腔方式的不同，哺乳动物细胞可分为3种主要方式：大自噬(macroautophagy)、小自噬(microautophagy)和分子伴侣介导自噬(chaperone—mediated autophagy, CMA)。无论大自噬还是小自噬都可以选择性和非选择性吞噬大的物质，CMA为胞浆内蛋白结合到分子伴侣后转运到酶体腔中，被溶体酶消化。由于目前对大自噬及其在疾病发生的作用的研究日益增多，所以本综述着重介绍大自噬。 
    2  自噬的诱导
    当细胞受到饥饿、高温、低氧及荷尔蒙等外界刺激, 或细胞器的损坏、突变蛋白的积聚及微生物的侵袭等应激时, 可引起细胞自噬的发生。雷帕霉素靶点TOR蛋白激酶(target of rapamycin)作为细胞中氨基酸、ATP和激素的感受器, 是调控细胞生长的关键因子之一,其是细胞氮水平的负调节剂，参与自噬反应的调节[3]。研究表明, TOR对自噬反应的调节与细胞的营养条件有关,当营养充足时, 细胞中TOR被激活而抑制自噬，而当细胞处于饥饿状态时, TOR被抑制而促进自噬。在哺乳动物细胞中又有Tor蛋白，同时Tor蛋白也随着周围环境的改变来调节自噬但是调节机制要较酵母细胞复杂。在哺乳动物细胞中mTor的上游负调节有I型PI3K激酶，PDK1和AKt/PKB,而PTEN能拮抗PI3K而促进自噬。同时伴随着自噬的发生。TOR 的失活引起Atg结构的改变, 如Atg13p部分去磷酸化, 在营养充足时Atg13可高度磷酸化而不易于Atg1激酶结合从而抑制自噬发生。相反，在细胞处饥饿状态时Atg13可很快与Atg1结合，从而增加自噬。同时mTor可增强与Atg17p和Atg1p之间的相互作用,从而调节其激酶活性。 
    3  自噬过程
    自噬其发生过程大致分为3个阶段：(1)在饥饿、氧化应激损伤等情况下，粗面内质网的非核糖体区域、高尔基体等来源的自噬体膜脱落形成杯状分隔膜，包绕在被降解物（如蛋白质降解产物，细胞器和核糖体等）周围[3,4] ；(2)分隔膜逐渐延伸，将要被降解的胞浆成分完全包绕形成双层膜自噬体；(3)自噬体通过细胞骨架微管系统运输至溶酶体，与之融合形成自噬溶酶体并降解其内成分，自噬体膜脱落再循环利用。因此自噬可被视为细胞的“回收工厂”，其不仅促进能量的利用同时转运无功能的蛋白和细胞器。而调节这个复杂的过程的分子水平有五个关键阶段[5]:（1）形成吞噬泡（2）Atg5-12复合物与Atg16L并且多聚化（3）LC3形成并且插入吞噬泡膜（4）包绕预被降解物（5）自噬体与溶酶体融合。
    3.1吞噬泡的形成
    酵母细胞的吞噬泡膜形成于PAS，而哺乳动物细胞吞噬泡膜来其于内质网[6,7]，高尔基体[3,8,9]等，甚至可能在严密调控下来源于细胞核[10]。酵母细胞形成吞噬泡膜需要Atg1激酶与Atg13和Atg17复合物，该复合物可能通过跨膜蛋白Atg9补充脂质而促进吞噬泡膜的扩增[4,11]。这个过程可通过Tor激酶调节，其磷酸化Atg13从而阻止其与Atg1激酶作用[13]哺乳动物细胞吞噬泡的形成过程仍需要进一步研究。III型PI3K激酶，Vps34和Atg6/Beclin-1在哺乳动物细胞的吞噬泡形成和自噬的作用已经很好的认识。Vps34参与细胞膜的形成，但其需要与Beclin-1和其他调控蛋白来选择性的参与自噬过程[14]。PI3P在吞噬泡的延伸和不断补充Atg蛋白过程中起重要作用，Vps34与PI3K以PI为底物获得PI3P过程中，Vps34是十分重要的[15]。Vps34与Beclin-1作用可增加PI3P的水平。其他与Vps34与Beclin-1复合物结合促进自噬调节蛋白为UCRAG，BIF-1，Atg14L和AMBRA[16,17] ,或抑制自噬蛋白Rubicon, Bcl-2[18,19]. Beclin-1与Bcl-2结合可破坏Beclin-1与Vps34的作用，所以Beclin-1与Bcl-2，Bcl-XL作用与内质网可抑制自噬[21]。
    3.2 Atg5-Atg12复合物形成
    由Atg3、Atg5、Atg7、Atg10、Atgl2和LC3(Microtubule—associated protein 1 light chain 3，MAP1-LC3)参与组成的两条泛素样蛋白加工修饰过程,在Atg 12结合过程和LC3修饰过程起着至关重要的作用。有的两个泛素样蛋白系统参与形成Atg5-Atg12复合物和LC3, Atgl2首先由El样酶Atg 7活化，之后转运至E2样酶Atgl0，最后与Atg5结合，形成自噬体前体。Atg5-12复合物与Atg16L结合形成Atg5、Atgl2和Atgl6L以复合物形式存在，这种结合一方面促进了自噬泡的伸展扩张，使之由开始的小囊泡样、杯样结构逐渐发展为半环状、环状结构；另一方面，Atg5复合物与自噬泡膜的结合还促进了LC3-向自噬泡的募集。Atg5-12复合物不依赖于自噬的作用，一旦自噬体形成，Atg5-Atgl2-Atgl6L复合物就脱离胞膜，使之Atg5-12复合物不是自噬的标志物。
   3.3 LC3形成
   第二条泛素样蛋白加工修饰过程参与LC3B 的形成，LC3B由哺乳动物细胞Atg8同源染色体编码。LC3B 被Atg4分解，生成LC3B-I，并暴露出其羧基末端的甘氨酸残基。同样LC3B-I也被E1样酶Atg7活化，转运至第二种E2样酶Atg3，并被修饰成膜结合形式LC3B-II。LC3B-II定位于前自噬体和自噬体，使之成为自噬体的标志分子。一旦自噬体与溶酶体融合，自噬体内的LC3II即被溶酶体中的水解酶降解。哺乳动物细胞内源性Atg5和Atgl2主要以结合形式存在；而胞浆可溶性LC3B-I和膜结合型LC3B-II的比例在不同组织和细胞类型变化很大。哺乳动物细胞自噬过程中两条泛素样加工修饰过程可以互相调节，互相影响。自噬形成过程中LC3合成增多，使之成为自噬的标志物。GABARAP(氨基丁酸受体相关蛋白)也是同样的自噬过程，GABARAP-II与LC3-II作用于自噬体。
    3.4 包绕预被降解物
    自噬一般是认为随机吞噬入胞液中。电镜照片展示自噬体包含有多种成分，包括线粒体、内质网和高尔基体膜[22]。然而，有证据表明扩增的吞噬泡膜可以选择性吞噬蛋白和细胞器。可能与LC3B-II，其作为自噬的受体，与靶向分子配体作用（如蛋白，线粒体）而促进选择性摄取和降解。在酵母细胞中，Uth1P和Atg32可能促进选择性摄取线粒体，这个过程是小自噬[23,24] 。

    3.5 囊泡的融合和分解
   当成熟的自噬体的外膜与溶酶体融合时, 内囊泡被释放。膜融合后, 直接释放到溶酶体内腔的不是被吞噬的胞质组分, 而是包含一层膜的自噬体。膜必须先被溶酶体的水解酶破坏, 进而水解自噬体的内容物。在一些溶酶体蛋白水解酶活化和囊泡的酸化过程中, Atg15p脂酶被证明是自噬体降解所必需的。最初溶酶体的跨膜蛋白Atg22p被认为是溶酶体内溶解所必需的。而近来的研究则显示Atg22p是细胞通过自噬作用, 利用胞质产生氨基酸所必需的一种透性酶, 是细胞在饥饿条件下存活必不可少的酶[25]。
    3.6 其它
    Sec基因(Sec12、Sec16、Sec23／24)参与了自噬体膜的形成。另外，中间丝、微管等细胞骨架成分也参与了自噬体形成晚期步骤的完成。
   4  自噬过程的信号调控 
    4.1 营养信号
    当营养缺乏时即可诱导自噬的发生。在酵母细胞和哺乳动物细胞中，TOR通路和Ras-cAMP-PKA两条通路感受营养水平，调节细胞分裂和增殖，并且负向调节自噬过程。
    4.1.1 TOR复合体1（TOR complex1 TORC1）
    TORC1对雷帕霉素抑制敏感，在营养状态被雷帕霉素抑制的TORC1可促进自噬，表明TOR本身可下调自噬。细胞外的氨基酸通过转运蛋白如SLC1A5和SLC7A5转入细胞膜，mTOR可直接或磷酸化感知[26]。然而，最新在果蝇和哺乳动物细胞中发现Rag蛋白，可通过将mTORC1移至于含有mTORC1激活剂Rheb的亚细胞结构而感受氨基酸[27,28]。其他研究表明氨基酸通过III型PI3K(hVps34)激活mTOR.氨基酸激发hVps34而激活mTOR,进而抑制自噬。
   在酵母细胞中，TORC1除了调节Atg1/ULK复合物，同时也通过磷酸化Tap42抑制自噬，Tap42通过作用于自噬的负向调节剂PP2A的催化亚群而抑制自噬[29]。
    4.1.2 Ras/PKA通路
    在酵母细胞和哺乳动物细胞中Ras/PKA通路在感受葡萄糖起着重要的作用。在酵母细胞中，Ras/PKA通路通过抑制TOR而抑制自噬，表明Ras/PKA通路抑制自噬作用与TOR- Tap42通路平行。Ras/PKA可抑制自噬可能通过Atg1调节，Atg1是PKA的磷酸化底物。同时酵母细胞中的Sch9与哺乳作用与动物细胞中的PKB/Akt相似，也参与感受营养水平。在酵母细胞中可能有三条通路参与抑制自噬，TORC1, Ras/PKA和Sch9。
    4.2 胰岛素/生长因子通路
    在如果蝇和哺乳动物细胞中的真核细胞中，通过激素来调节自噬的通路与营养的通路不同，但二者都汇集于TOR。胰岛素或胰岛素样生长因子通过I型PI3K调节mTOR。位于酪氨酸的胰岛素受体自身磷酸化可使IRS1和IRS2（胰岛素受体底物1和2）扩增并磷酸化，可与PI3K结合。由I型PI3K生成的PIP3可增加细胞膜PKB/Akt和其激动剂PDK1,通过PDK1激动并磷酸化PKB/Akt[30]。PTEN可抑制生成PIP3，进而抑制下游PKB/Akt信号而正向调节自噬。激活的PKB/Akt增加由TSC2编码的蛋白磷酸化，TSC2蛋白磷酸化阻断与TSC1作用[28]，从而阻断TSC1/TSC2复合物形成，使Rheb 与GTP 结合更稳定, 从而激活mTOR。
    除了TOR，Ras信号在通过生长因子调节自噬过程也起到重要作用。Ras可将信号从生长因子酪氨酸激酶传递到细胞内效应器如Raf/MAP激酶和I型PI3K。

期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆
在HT-29结肠癌细胞中，Ras效应器Raf-1是一个氨基酸感受器，能够正向调节自噬[29]，氨基酸靶向作用于并抑制Raf-1激酶，从而下调下游的MEK/ERK活性，从而抑制自噬。
    4.3 能量感受
    自噬活性对细胞存活十分重要。在哺乳动物细胞中，AMPK感受ATP的水平。通过上游激酶LKB1下调ATP/AMP比例而激活AMPK。活性的AMPK诱导TSC1/2复合体磷酸化并有活性，TSC1/2复合体可通过Rheb抑制mTOR活性。除此之外，LKB1-AMPK使P27磷酸化并有活性，后者可在生长因子缺乏或营养缺乏时阻滞细胞凋亡而诱导自噬。与AMPK相同，酵母细胞中的Snf1也可正向诱导自噬。
    5  自噬与P53
    P53 是重要的肿瘤抑制因子,正常的P53基因为野生型(wt P53), 在细胞正常生长过程中起着重要的调节作用, 明显抑制细胞的转化生长; 当P53基因发生丢失或突变即突变型(mtp53)将诱发癌变。对于应答DNA损伤，致癌反应，组织缺氧或者其它应激时，P53通过转录依赖和非转录依赖机制调剂细胞应答，既可以阻止或修护基因损伤，又可以清除潜在致癌细胞。P53的不仅在抑制肿瘤方面重要，同时P53在代谢，生长，老化和神经退化等也起着重要的作用。
    最新研究发现P53参与自噬调节，其中包括转录非依赖途径和转录依赖途径：转录非依赖途径是通过P53的活化激活AMPK,负性调节mTOR;而转录依赖途径可通过上调mTOR抑制因子PTEN和基因TSC1, 或是P53调节的自噬和细胞死亡基因DRAM负性调节mTOR，从而诱导自噬发生。
   以往的研究认为P53的活化诱导自噬的发生,而Tasdemir等质疑P53是自噬的正性调剂。在正常细胞和转化细胞中,利用P53 抑制剂PTF-α抑制P53的活性或用siRNA沉默P53,均可导致正常细胞和转化细胞自噬作用的增强。由P53 缺失引起的自噬作用与AMPK 的激活和TOR的抑制相关,可通过剔除AMPK或自噬基因如ATG5、Beclin1、ATG10 等抑制自噬的发生。药物抑制或沉默或剔除P53的小鼠和线虫可引起自噬的增加,表明在体内P53 可负性调节自噬, 其机制可能与P53的转录非依赖途径相关。体外实验表明,通过抑制胞质中的P53,亦可诱导自噬。从Tasdemir[30]的研究提示一个更复杂的模型，P53是否参与调节自噬不能简单由P53含量和应激水平决定，同样也由应激信号决定，Tasdemir等[30]表明抑制P53可导致内质网应激，通过敲除IRE-1α阻断内质网应激时可以降低由P53缺乏而诱导的自噬。这个发现对于决定在体内或在生长的肿瘤中P53缺失的内质网应激和/或代谢是否是自噬的诱导剂是十分重要的[47]。在细胞核内P53可诱导自噬前体靶基因表达，在细胞浆内，基态水平野生型P53能够阻止自噬体形成。P53这种双重作用仍需要进一步研究。
    6  展望
    广泛存在于真核细胞中的自噬在正常细胞生长发育和生理病理过程中发挥着及其重要的作用，不仅能清除细胞内过量或受损的细胞器和蛋白质，维持蛋白质代谢平衡及细胞内环境稳定，而且对防止如神经退行性病变、肿瘤、 心肌病、病原微生物侵入感染等疾病以及对防止老化、延长寿命有积极作用。然而就目前的研究水平，还有很多问题亟待解决，比如自噬是如何起源的、其信号转导通路是如何协调和相互影响的及其对细胞生存影响等等。这些问题还有待分子生物学和细胞生物学的进一步发展，但是随着对自噬作用机制的深入研究，我们还是可以期望通过调控细胞的自噬水平来控制癌症及神经退行性疾病的发展，延缓衰老，为人类服务提高生存质量提供更好的临床治疗方法。