琼脂糖凝胶电泳的操作步骤.doc

琼脂糖凝胶电泳的操作步骤如下：1. 制备1%琼脂糖凝胶(大胶用70ml,小胶用50ml):称取0.7 g(0.5 g)琼脂糖置于锥形瓶中,加入70 ml(50ml)1TAE,瓶口倒扣小烧杯.微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化,摇匀,即成1.0%琼脂糖凝胶液. 2. 胶板制备:取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净,晾干,放入制胶玻璃板.取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好,形成模子.将内槽置于水平位置,并在固定位置放好梳子.将冷却到65左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上,使胶液缓慢展开,直到整个玻璃板表面形成均匀胶层.室温下静置直至凝胶完全凝固,垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中.添加 1TAE电泳缓冲液至没过胶板为止.3. 加样:在点样板或parafilm上混合DNA样品和上样缓冲液,上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X.用10 ul微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内,每加完一个样品,应更换一个加样头,以防污染,加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面.(注意:加样前要先记下加样的顺序). 4. 电泳:加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压60-100V,样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动.电压升高,琼脂糖凝胶的有效分离范围降低.当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时,停止电泳. (5)电泳完毕后,取出凝胶,用含有0.5 ug/ml的溴化乙锭1TAE溶液染色约20 min,再用清水漂洗10 min. (6)观察照相:在紫外灯下观察,DNA存在则显示出红色荧光条带,采用凝胶成像系统拍照保存实验原理 闭合环状质粒、线性质粒和开环质粒DNA由于构形不同，在加溴化乙锭的琼脂糖凝胶电泳上呈现不同的迁移率，因而在紫外灯下观察，能区别闭合环状质粒DNA（cccDNA）、线性质粒DNA（L-DNA）和开环质粒DNA（ocDNA）。实验材料和试剂 （一）实验样品 质粒pUC118 （二）试剂 1l DNA/HindIII分子量标准 2溴酚蓝指示剂点样缓冲液 0.2% 溴酚蓝 50% 蔗糖 31mg/ml溴化乙锭溶液 4电泳缓冲液（TAE） 40 mmol/L Tris-乙酸 1 mol/L EDTA (配制方法：24.2克Tris碱，5.71ml冰乙酸，10ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)，定容至5000ml） 50.7% 琼脂糖凝胶 （配制方法：称取琼脂糖0.35克，加入50ml TAE电泳缓冲液） （三）仪器 微量移液器 电泳仪 水平电泳槽 透射紫外观察仪 实验步骤 1选择合适的水平式电泳槽，调节电泳槽平面至水平。检查稳压电源与正负极的线路。 2选择孔径大小合适的点样梳子，垂直架在电泳胶模的一端，使点样梳子底部离电泳胶模底部的距离为1.0mm。 3制备0.7%琼脂糖凝胶，100水浴加热至琼脂糖融化均匀。 4用吸管取少量琼脂糖凝胶溶液将电泳胶模四周密封好，防止浇灌琼脂糖凝胶板时发生渗透。待琼脂糖凝胶冷却至60左右时，加入一滴溴化乙锭，摇匀，轻轻倒入电泳胶模中，琼脂糖凝胶的厚度在35mm。倒胶时要避免产生气泡，若有气泡可用吸管小心吸去。 5琼脂糖凝胶凝固后，在室温放置20分钟，小心拔掉点样梳子和电泳胶模两端的挡板，保持点样孔的完好。 6将电泳胶模放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，使电泳缓冲液面高出琼脂糖凝胶表面12mm。如点样孔内有气泡，用吸管小心吸出，以免影响加样。 7将15ml DNA样品与1/5体积的溴酚蓝指示剂点样缓冲液混合。上样缓冲液不仅可以提高样品的密度，使样品均匀沉到样品孔内，还可以使样品带颜色，便于上样和估计电泳时间和判断电泳的位置。 8用微量移液器将样品小心加入加样孔内，记录样品点样秩序。 9盖上电泳槽，开启电源开关，最高电压不超过5V/cm（100150V恒压电泳），使DNA从负极向正极移动。 10电泳时间随实验的具体要求而异。电泳一般需13小时。电泳完毕后关闭电源，戴一次性塑料手套取出凝胶，尽可能将所有的电泳缓冲液淋干，在254nm波长的透射紫外灯下观察。 【提示】 （一）琼脂糖凝胶电泳 1琼脂糖凝胶的性质 琼脂糖是从海藻中提取的一种直链多糖，它由D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖的残基交替排列组成的线型多聚糖。当琼脂糖加热至90100左右，即可形成清亮透明的液体。浇在模板上冷却至4045时，凝固形成凝胶。琼脂糖带有亲水性，不含有带电荷的基团，不引起DNA变性，又不吸附被分离的物质，因此它是一种很好的凝胶剂。琼脂糖凝胶可区分相差100bp的DNA片段。 2DNA分子的迁移率 DNA分子在电泳中的迁移率的因素是多方面的，除了决定于DNA分子大小与构型外，还有琼脂糖凝胶的浓度、电压大小、缓冲液pH值和电泳时的温度等。 （二）实验操作中注意的问题 1加热溶解琼脂糖时应不断地摇动容器，使附于壁上的颗粒也完全溶解。 2溴化乙锭是一种强致癌剂，并有中度毒性，因此必须十分谨慎小心。操作时一定要戴手套，用过的手套要及时将手套顺手翻过来，让污染有溴化乙锭的面朝里。 3用254nm波长的紫外光进行观察的效果比366nm清晰，但产生的切口DNA量也较高。紫外光对眼睛有害，观察时应戴上眼镜或防护面罩。琼脂糖凝胶电泳实验技巧核酸分子是两性解离分子，在高于其等电点的电泳缓冲液(pH8.0-8.3)中，基其碱基不解离，而磷酸基团全部解离，核酸分子因而带负电荷，电泳时向正极迁移。琼脂糖主要多海洋植物琼脂中提取而来并经糖基化修饰，为一种聚合链线性分了，使用琼脂糖凝胶作为电泳支持介质，发挥分子筛功能，使得大小和构象不同的核酸分子的迁移率出现较大差异，从而达到分离的目的。琼脂糖凝胶电泳操作简单、快速、通过调整其使用浓度，使得分辨率达到大多实验的要求。因此成为分离、鉴定、纯化核酸分子的常用方法。一、操作过程中要注意以下一些问题。1、凝胶制作1.1 凝胶浓度凝胶的浓度据实验需要而变，一般在1.8%-2.0%之间，没有用完的凝胶可以再次融化，但随着融化次数的增加，水分丢失也越多，凝胶浓度则会越来越高，导致实验结果不稳定。补水办法：一是在容器上标记煮胶前的刻度，煮胶后补充水分到原刻度；二是在煮胶前称重，煮胶后补充水至原重量。粗略一点的办法是通过多次较恒定的煮胶条件得出一个经验补水值，以保证凝胶浓度基本维持在原浓度。如果条带要回收最好不要用回收胶。1.2 梳板的选用一般每个制胶模具均配有多个齿型不同的梳板。梳齿宽厚，形成的点样孔容积较大，用于DNA片段回收实验等；相反，梳齿窄而薄，形成的点样孔容积就较小，用于PCR产物、酶切产物鉴定等。回收的话还可以将几个齿用透明胶带粘起来，形成一个窄而长的大孔以加大点样量提高回收率。梳板的选择主要是看上样量的多少而定。一般来说，上样量小时尽量选择薄的梳板制胶，此时电泳条带致密清晰，便于结果分析。另外，每次制胶时都要注意梳齿与底板的距离至少要1mm，否则，拔梳板时易损坏凝胶孔底层，导致点样后样品渗漏。当然，点样孔的破坏还与拔梳板的时间和方法有关，一般凝胶需冷却30min以上方可拔出梳板，应急的情况下可以将成型的凝胶块入4度冰箱中冷却15min左右，拔梳板的方法是将制胶槽放置在电泳槽中的电泳缓冲液中，然后垂直向上慢慢用力，因为有液体的润滑作用，梳板易拔出且不易损坏点样孔。2、点样在样品加入上样缓冲液中含有甘油或蔗糖以增加密度，使样品沉入孔底；上样缓冲液中一般还含有两种指示剂，溴酚兰和二甲苯菁，用于指示样吕的迁移过程。上样缓冲液储存液一般为6倍（10倍），表示其浓度为工作浓度的六倍。使用时上样缓冲液应稀释到一倍浓度。点样方法是将移液枪基本垂直对准点样孔，用另一只手帮助固定移液枪下端，移液枪的枪头尖端进入点样孔即可将样品注入孔内。上样量的多少根据跑胶的目的而不同，一般直接跑DNA时量最少，跑一般的分子标记适中，回收时可以都加进去。最后根据扩增条带的大小点上适合的DNA Maker。3、电泳将电泳仪的正极与电泳槽的正极相连，负极与负极相连，每次电泳时都要检查一下电极方向，以免白干（新手来做时可能就有这样的情况发生）。核酸带负电荷，从负极向正极移动。电泳槽中电泳缓冲液与制胶用电泳缓冲液应相同，电泳缓冲液刚好浸过胶为好。电泳缓冲液浓度太大则电流加大，凝胶发热，易使DNA降解。电泳早所加电压一般不超过5v/cm（正负电极之间的距离，而不是凝胶的长度）。电泳时间一般为30-60min，根据实验需要也可作适当调整。电压增高，电泳时间缩短，核酸条带相对来说不够整齐，不够清晰；相反，电压降低，电泳时间较长，条带会相对的清晰。另外，如果电泳后样品泳支很慢或者没移动可能是由于挡板没有拿开。 附 EB作用原理：观察琼脂糖凝胶中DNA最常用的方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色，溴化乙锭含有一个可以嵌入DNA堆积碱基之间的一个三环平面基团。它与DNA的结合几乎没有碱基序列特异性。在高离子强度的饱和溶液中，大约每2.5个碱基插入一个溴化乙锭分子。当染料分子插入后，其平面基团与螺旋的轴线垂直并通过范德华力与上下碱基相互作用。这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导致与DNA结合的染料呈现荧光，其荧光产率比游离溶液中染料有所增加。DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料，而被结合的染料本身吸收302nm和366nm的光辐射。这两种情况下，被吸收的能量在可见光谱红橙区的590nm处重新发射出来。由于溴化乙锭-DNA复合物的荧光产率比没有结合DNA的染料高出20-30倍，所以当凝胶中含有游离的溴化乙锭（0.5ug/ml）时，可以检测到少至10ng的NDA条带。