蛋白质电泳操作步骤.doc

SDS-PAGE电泳操作步骤：

试剂配制：
（实验中采用均为分析纯）
（1）丙烯酰胺贮液 （4℃下棕色瓶中储存，试剂尽量勿存储过久）
丙烯酰胺贮液（T=30%，C=3%）
称取29.1 g丙烯酰胺和0.9 g甲叉双丙烯酰胺，用双蒸水溶解，定容至100 ml，过滤备用。(试剂有毒，操作中注意防护)
（2）浓缩胶缓冲液（1 mol/L Tris-HCl，pH 6.8）（4℃下棕色瓶中储存，试剂尽量勿存储过久）
6.06 g Tris溶解于35 ml双蒸水中，用浓盐酸调节pH至6.8，再用双蒸水定容至50 ml。
（3）分离胶缓冲液（1.5 mol/L Tris-HCl，pH 8.8）（4℃下棕色瓶中储存，试剂尽量勿存储过久）
18.16 g Tris溶解于75 ml双蒸水中，用浓盐酸调节pH至8.8，再用双蒸水定容至100 ml。
（4）10% SDS
（5）10% 过硫酸铵（APS）：使用前新鲜配制，低浓度APS一般当天用当天配制，勿过夜使用。
（6）尿素
（7）TEMED(N，N，N’，N’-四甲基乙二胺)
（8）电极缓冲液(1×) （棕色瓶中4℃储存，一般使用3-4次）
0.025 mol/L Tris，0.192 mol/L甘氨酸，0.1% SDS，pH 8.3
（9）电极缓冲液(2×) （棕色瓶中4℃储存，一般使用3-4次）
0.050 mol/L Tris，0.384 mol/L甘氨酸，0.1% SDS，pH 8.3
（10）样品缓冲液（pH 6.8）（4℃下棕色瓶中储存，试剂尽量勿存储过久）
1.6 ml浓缩胶缓冲液（pH 6.8）+ 4 ml 10% SDS + 0.6 g二硫苏糖醇(DTT) + 2.5 ml 87%甘油+0.1 mg溴酚蓝，用双蒸水稀释到20 ml.
（11）考玛斯亮蓝R-250染色方法：
a．固定液
20%三氯乙酸
b．脱色液
250 ml乙醇，80 ml冰醋酸，加水稀释至1000 ml。
c．染色液
称取0.29 g考玛斯亮蓝R-250溶于250 ml上述脱色液中

样品处理：
处理完样品应尽快使用，若存储，须于-20℃下。
.CytC酶解样
每管分别加入8 µl细胞色素C（20 mg/ml），10 ul 50 mM Tris-HCl（pH 8.0）,1 µl胰蛋白酶（细胞色素C：胰蛋白酶=50：1）。37℃水浴，2 h。立即放入-20 ℃冰箱冷冻保存备用。上样前加15μІ上样BUFFER，75℃水浴5-10min
大肠杆菌蛋白
取10μІ工程菌种接入10nml LB液体培养基里，过夜培养12h，取出1ml菌液离心10000g/r，5min。弃上清，用1ml Tris-Hcl （pH 8.0 50mM）洗涤1-2次，后分别加入20μІ（pH8.0 5mM）、10μІEDTA，-20℃保存。上样前加入2μІ 5%X，再加入50μІ上样BUFFER，75℃水浴5-10min
.CytC
15μІ CytC加入15μІ上样BUFFER，75℃水浴5-10min
.低分子量肽标准
取8-10μІMaker（2mg/ml）,加入10μІ上样buffer，再加入5μІ ddH2O，75℃水浴5-10min
.SPI多肽的制备
Ⅰ 材料及试剂（试剂均为分析纯）
纯大豆粉
木瓜蛋白酶（sigma P3250 500-2000AU/g）
正己烷
巯基乙醇
Tris-HCl缓冲液（0.03 M、pH 8.0）
0.2 M HCl
叠氮钠
考马斯亮蓝G250
标准牛血蛋白
Ⅱ 制备方法
ⅰ.SPI制备：大豆分离蛋白的制备参照Iwabuchi 和Yamauchi [9]的方法, 具体步骤如下: 全脂豆粉加正己烷(1/5)室温下搅拌1 h脱脂，于3 000 g 离心5 min, 取沉淀反复脱脂两次, 于沉淀中加入15～20 倍含10 mM 巯基乙醇0.03 M、pH 8.0 的Tris-HCl 缓冲液, 室温搅拌1～2 h, 于20 ℃ 6 000 g 离心25 min,取上清液,用0.2 M HCl 调节pH 至4.8, 置于冰箱下层冷沉过夜, 再于4 ℃ 9 000 g 离心20 min, 取沉淀分散于少量水中, 调节pH 至7.0, 搅拌1 h 充分溶解后于4 ℃下用含0.05 % 叠氮钠的蒸馏水透析2 d, 再用蒸馏水透析两次去叠氮钠, 冷冻干燥即得大豆分离蛋白(SPI)。（可能透析会损失掉一定量的多肽。）
ⅱ.SPI蛋白含量测定：利用考马斯亮蓝蛋白含量测定法，根据牛血蛋白作出的标准蛋白曲线，测定SPI的蛋白浓度：（具体方法参见《生物化学实验原理和方法》P174）测得1%（1mg/ml）的SPI吸光度为0.779，求得即在SPI质量分数为1%的情况下，其蛋白浓度约为3mg/ml.
ⅲ.SPI多肽制备：本实验采用木瓜蛋白酶水解SPI，制取SPI多肽。标准的酶解体系为溶于0.05 mol/L, pH8.0Tris-HCl 缓冲溶液的SPI 溶液(质量分数为2%),含质量分数为0.05%的叠氮钠,先于38℃下预热5 min,分别添加蛋白酶至750 AU/mL，然后继续于反应温度下反应，反应时间也很影响SPI多肽的产率，木瓜蛋白酶持续低温水解16小时也可以产生较多小肽。反应混合物可定期取样并分别加入X- PAGE样品缓冲液终止反应(1: 1, v/v)。实验上样一般采用过夜酶解透析样(2%*5%)。上样前应将酶解样与样品缓冲液混合物水浴。

操作方法：
所制均为1.0mm小板所需体积
（1）配制分离胶（16.5%T, 3%C）：
丙烯酰胺贮液—3ml 分离胶缓冲液—1.5ml 尿素—2.16g 10%SDS—72μІ
（2）配制浓缩胶（4%T, 3%C）
丙烯酰胺贮液—0.34ml 浓缩胶缓冲液—0.24ml ddH2O—1.4ml 10% SDS—24μІ
（3）将上两步配制的分离、浓缩胶真空抽气15min，同时配制10%过硫酸铵:
准确称量0.1g过硫酸铵固体（因其易氧化，操作尽量快，且尽量从底部取样），溶于1ml双蒸水中，即配即用，低浓度APS只限当天使用。
（4）吸取22µl过硫酸铵及5µlTEMED于分离胶中，轻轻混匀，灌胶，小心的在分离胶的表面加封一层水，封住胶面。注意分离胶与浓缩胶的比例。
（5）大约40min，待分离胶聚合形成界面后，吸掉水，加11µl过硫酸铵及4µlTEMED于浓缩胶中，轻轻混匀，灌注浓缩胶，慢慢斜插入梳子（以免产生气泡）。
胶配制完成之后可直接放置于室温下，而且切忌即配即用及4℃下冷藏，应使其充分凝固，这样可以在一定程度上提高分辨率。
（6）样品处理【此省略】
（7）上样：将处理好的样品依据其蛋白浓度加入上样buffer，水浴后离心，去适量体积加入上样孔内，切忌样品直接互相污染（上样量一般8-12µg，视样品不同而异）
（8）电泳：将电极缓冲液注入电泳槽中。恒流情况下，电压一般设为最大值(300V),在分离胶内电流一般为10mA左右，大约30min左右，样品前沿跑过分、浓界面后，电流加大为20-25mA，整体电泳时间约2 h；恒压条件下，浓缩胶内电压取60V，电流一般设最大值，样品跑至分、浓界面后电压加大到120V，整体电泳时间约2.5h。
（9）染色：利用考玛斯亮蓝R-250染色系统固定、染色和脱色：电泳完毕后，将胶置于固定液中固定1 h，然后放置于染色液中染色过夜，转置脱色液中脱色，并多次更换脱色液，直至背景清晰。
（10）观察分析电泳结果