尿沉渣细胞检查的自动化.doc

尿沉渣细胞检查的自动化
自尿液检查对全身性疾病特别是肾、泌尿系疾病的诊断重要性明确以来，人们对尿液的检查越来越重视。各种尿液分析仪的问世，对尿液化学成份和部分有形成分检查提供了可靠的数据，但对尿液有形成份的计数和形态学的分析还没有完全解决。由于有血细胞计数仪和流式细胞仪的开发经验，在世界上许多先进国家都有尿沉渣分析仪的问世。
一、尿沉渣自动化分析的发展历史
1988 年美国国际遥控影像系统有限公司（ International Remate Imaging Systems Co.， Ltd.），生产了世界上第一台"yollow IRIS"高速摄影机式的尿沉渣自动分析仪，简称y-1尿自动分析仪。
1990年日本东亚医疗电子有限公司(TOA Medical Electronics Co.，Ltd.)与美国国际遥控影像系统有公司合作，对原有的尿沉渣分析仪进行改进，生产出影像流式细胞式的UA-1000型和UA-2000型尿沉渣自动分析仪。由于此类尿沉渣自动仪对图像粒子测绘不十分满意，处理能力低，重复性不好，管型分辩不清，价格较昂贵等原因，故没能普及。
1995年日本东亚医疗电子有限公司在原来影像流式细胞式尿沉渣自动分析仪的基础上，将流式细胞和电阻抗技术结合起来，生产出新一代的UF-100型全自动尿沉渣分析仪(UF-100 Fully Automated Urine Cell Analyzer)。
二、全自动尿沉渣分析仪的原理
(一)、尿沉渣细胞分析的原理：
UF-100型全自动尿沉渣分析仪使用流式细胞和电阻抗的原理：当一个尿液标本被稀释液稀释和染色液染色后，它靠液压作用通过鞘液流动池。当反应样品从样品喷嘴出口进入鞘液流动室时，它被一种无粒子颗粒的鞘液包围。然后，每个细胞从单个纵列的形式通过流动池的中心(竖直)轴线，在这里每个尿液细胞将被氩激光光束照射。每个细胞有不同程度荧光强度（Fl， fIuortscent light，从染色尿液细胞发出的荧光主要反映细胞的定量特性如细胞膜、核膜、线粒体和DNA）和散射光强度（这种仪器测定的是前向散射光，Fsc， forwat scattered light，它以成比例反映细胞的大小）和电阻抗的大小（电阻抗电信号主要与细胞的体积成正比）。仪器正是将这种荧光、散射光和电阻抗的信号转变成电信号， 分析这些电信号才能使得每个尿液标本产生出直方图（histogram）和散射图（scattergram），然后分析这些图形即可区分每个细胞和得出每个细胞的形态。
(二)、检测模式
图 是UF-100型全自动尿沉渣分析仪检测的模式，它包括光学检测系统、液压系统、电阻抗检测系统和电子系统。
⒈光学系统
光学系统由氩激光（波长488nm）、激光反射系统、流动池、 前向光采集器和前向检测器组成。
激光作为光源用于流式细胞分析系统，它被双色反射镜反射，然后被聚光镜收集形成射束点，这种射束点是椭园的并且聚集于流动池的中央。从氢激光发出的激光束被光束塞封闭。当样品流到流动池，每个细胞被激光光束照射，产生前向散射光和前向荧光的光信号。当无用的偏向光被带小孔的面板排除后，双色过滤器区分出前向散射光和前向荧光。
散射光信号被光电二极管转变为电信号，再输送给微处理器。根据光散射Mie散射定律，尿液标本在分析时，由于细胞的种类不同和分布不均， 光的反射和散射主要取决于细胞表面，因此散射光强度主要取决于细胞的大小，所以仪器可以从散射光的强度得出测定细胞大小的资料。
荧光通过滤光片滤过一定波长的荧光后，输送到光电倍增管将光信号放大再转变成电信号，然后输送到微处理器。
UF-100型全自动尿沉渣分析仪使用两种荧光染料：菲啶( phenantridine)和羧花青（carbocyanine）。前者染细胞的DNA，在480nm 光波激发时， 产生610nm的橙黄色光波，但该染料的渗透能力差； 后者是一种穿透能力较强的染料；它主要与细胞浆膜的脂层（细胞膜、核膜和线粒体）结合在460nm 的光波激发时，产生505nm的绿色光波。这些染料具有下列特性：⒈反应快速； ⒉背景荧光低；⒊从细胞发生的荧光与染料和细胞的结合程度成比例，因此，仪器通过分析荧光信号来获得细胞的不同资料。
⒉液压（鞘液流动）系统
反应池染色标本随着真空作用吸入到鞘液流动池。固定体积标本被样品鞘液注射器集中通过流动池。为了使尿液细胞进入流动池不凝固成团一个一个地通过,加压的鞘液输送到流动池，使染色的样品通过于流动池的中央。 鞘液形成一股液涡流（似鞘流的电流）使尿液细胞吸成单个的纵例。这两种液体不能混合，这就表明尿液细胞永远在鞘液中心通过。如果有大颗粒存在，在流动池中它不可能凝固成团，因为有液体流体包围它。鞘液流动机制改进了细胞计数的准确性和重复性。当颗粒以纵列通过流动池的中心时，鞘液流动机制防止错误的脉冲和减少流动池被尿液标本污染的可能。
⒊电阻抗检测系统
电阻抗测定系统包括测定红细胞体积的电阻抗系统和测定尿液导电率传导系统。
电阻抗测定的方法是：当尿液细胞通过流动池（流动池前后有两个电极并维持恒定的电流）小孔时，在电极之间产生阻抗使电压发生变化。当尿液细胞通过小孔时，细胞和稀释液之间存在着较大的传导性或阻抗的差异，阻抗的增加引起电压之间的变化，它与阻抗改变成正比例。根椐欧姆定律，这种现象可表示为：
电压(V)=电流(I)X电阻(R)
如果电极之间固定电流I，则电压V和电阻R同时变化。 即当细胞有较大阻抗通过小孔时则电压也增大。因此，电压的不同主要依靠细胞的体积，所以细胞体积和细胞数量资料可以从电压这个脉冲信号中获得。
由于部分尿液标本在低温时含有结晶，它影响电阻抗测定的敏感性，引起不准确的分析结果。 为了保证尿液标本传导性稳定， 此类仪器使用：⒈用URINOPACK稀释液稀释尿液标本，由于稀释液中含有RDTA盐 合物可除去尿中所含的非晶型磷酸盐结晶；⒉尿液标本在染色过程加热到35℃，加热可以溶解尿标本中的尿酸盐结晶，这样就可以除去尿中结晶在电阻抗测定过程中通过检测器所引起的误差。
导电率的测定：导电率的测定采用电极法进行测定──当样品进入流动池之前，在样品两侧有一个传导性感受器，它接收尿液样品中的导电率电信号，将电信号放大直接送到微处理器。稀释的标本的传导性在它被吸入流动池之间测定。这种传导性与临床使用的渗透量密切相关。
⒋电子系统
从样品细胞中得到的前向散射光很强，并不需要极敏感光检测器，电光二极管能够将光信号转变成电信号。
从样品细胞中得到的前向荧光很弱，因此,使用极敏感的光电倍增管。 这种光电倍增管能够吸收在光电表面(负极)光子的能量并使用金属光电效应发出光电子。发出的光电子能够被外加电压促进，产生许多继发电子导致放大。这种放大的前向荧光转变成电信号。
从样品中得到的电阻抗信号和传导性信号被感受器接收后直接放大输送给微处理器。
以上所有这些电信号通过波形处理器整理，再输给微处理器汇总，得出每个细胞的直方图和散射图，再通过计算得出每微升各种细胞定量数和细胞形态。
(三)、尿细胞分析
仪器通过分析前向散射光波形（散射光强度和散射光脉冲宽度）、前向荧光波形（荧光强度和荧光脉冲宽度）和电阻抗值的大小一起综合分析，来得出细胞的形态，细胞横截面积，染色片断的长度，细胞容积等信息绘出直方图和散射图。仪器通过分析每个细胞信号波形的特性来对其进行分类。（图）

前向散射光反映细胞的大小。Fsc（前向散射光强度）反映细胞横截面积；Fscw（前向散射光脉冲宽度）反映细胞的长度。Fscw可用下列等式表达：
CL+BW
Fscw=─────
V
三.全自动尿沉渣分析仪检测项目及临床意义
尿沉渣检查虽然已有一个多世纪的历史，但发展远不如尿化学成分检查迅速，其主要是尿沉渣检查的局限性，主要在于：第一、检查方法不统一，目前尚未执行标准化方法，也无统一的质控标准；第二、检查所需要的时间长，有待开发出简便，快速的自动尿沉渣分析仪器；第三、检查重复性差 (检查人员之间的个体差异大，各检验机构之间的差异也大)， 全自动尿沉渣分析仪较好地解决了上述问题，是目前比较满意的尿沉渣分析仪。
㈠全自动尿沉渣分析仪检测项目
UF-100型全自动尿沉渣分析仪采集标本体积为9ml， 自动进样模式所需标本体积不少于4.0ml，实际汲取标本体积为0.8ml，检测标本体积为9.0ul， 相当于显微镜检测50个视野，它每小时能够检测100个尿液标本。 本仪器检测总粒子范围为0～40000，检测项目为：
⒈红细胞
红细胞出现在散射图的左下角。由于红细胞没有核和线粒体，所以红细胞荧光很弱由于红细胞在尿液标本中大小不均，且部分溶解成小红细胞碎片，或者在肾脏疾患时排出的红细胞也大小不等，因此，可以看到红细胞前向散射强度差异太大。
仪器除给出尿红细胞定量 (每微升的细胞数和每高倍视野的平均细胞数)参数外，还给出尿红细胞均一性。非均一性的百分比，非溶血性红细胞的数量和百分比；平均红细胞前向荧光强度（RBC-MFl）、 平均红细胞前向散射强度（RBC－MFsc）和红细胞荧光强度分布宽度（RBC-F1-DWSD）。
红细胞及它相关参数的临床意义：1.红细胞数增高主要见于：泌尿系结石、结核及肿瘤，肾小球肾炎，泌尿系血管畸形和出血性疾病等。⒉红细胞均一性和变异性参数对于鉴别肾小球源性血尿（简称肾性）和非肾小球源性（简称非肾性）血尿有重要价值。
2.白细胞
白细胞出现在散射图的正中央，表明白细胞在尿液的分布直径大约为10微米，细胞含有核而有高强度的前向荧光。白细胞也象红细胞那样有很多形状，当白细胞存活时，白细胞会呈现前向散射光高和前向荧光弱，当白细胞受损害或死亡时，会呈现前向散射光弱和前向荧光强。
仪器除绘出的白细胞定量（每微升的细胞数和每高倍视野的平均细胞数）参数外，还给出尿液中白细胞的平均白细胞前向散射强度（WBC-MFI）。
尿白细胞检测的临床意义：白细胞增多见于泌尿系感染、结石、结核和肿瘤。
⒊上皮细胞
上皮细胞由泌尿道的上皮细胞脱落而来，它的种类较多，大小不等。一般来说，大的鳞状上皮细胞和移行上皮细胞分布在散射图的右角，因为上皮细胞胞体大，散射光强，都含有细胞核、线粒体等，荧光也比较强。
仪器除绘出上皮细胞数量参数外，还标出小园上皮（SRC ）并在第二个屏幕上显示出小园上皮细胞每微升细胞数。小园上皮细胞是指细胞大小与白细胞相似或略大，形态较园的上皮细胞，它包括肾小管上皮细胞。中层和底层移行上皮细胞。
由于这些细胞散射光、荧光及电阻的信号变化较大，仪器不能完全区分出那一类细胞，因此当这类细胞的细胞数仪器标出到达一定浓度时，还须通过离心染色镜检得出准确的结果。
尿上皮细胞检测的临床意义：正常尿液中可见少量上皮细胞主要是鳞状上皮细胞和移行上皮细胞，如数量增多，可见小园上皮细胞，可认为泌尿道炎症表现。
⒋管型
由于管型种类较多，且形态各不相同，仪器不能完全区分开这些管型，只能检测出透明管型和标出有病理管型的存在。
透明管型出现在散射图的最右角，因为透明管型有极高的前向散射光强度和微弱的荧光强度，病理性管型包括细胞管型，由于他们都含有线粒体。细胞核等，所以有很强的荧光强度，借助于荧光强度，即可区分出透明管型和病理管型。当仪器标明有病理性管型时，由于仪器只能起过筛作用，不能完全判定就是病理管型，只有通过离心镜检，才能确认是那一类管型，这对疾病的诊断才会有真正的帮助。
管型测定的临床意义；正常时可见极少量的透明管型，当数量增多和有病理性管型时表现有肾实质损害。
⒌细菌
细菌分布在散射图红细胞和白细胞之间的下方区域，由于细菌含有DNA 和RNA，所以染色荧光强，分布在高荧光强度处，但因细胞较小， 所以其分布在低散射光强度区域。
尿液分析仪使用检测亚硝酸盐来确定尿中是否有细菌感染， 因只有部分细菌(主要是大肠杆菌)可将硝酸盐还原成亚硝酸盐，所以常常出现假阴性。此仪器能够检测出杆菌和球菌。
细菌检查临床意义主要用于泌尿系细菌感染的诊断。
⒍其它的检测
全自动尿沉渣分析仪除检测上述五项参数，还能标记出类酵母细胞（YLC）、精子细胞（SPERM）、晶体（X'TAL）。
类酵母细胞和精子细胞由于含有RNA和DNA荧光强度很高，繁殖过程中的类酵母细胞和精原细胞荧光强度变得很强，加上这些细胞散射光强度与红、白细胞差不多，所以类酵母细胞散射图分布在红、白细胞之间的区域，由于类酵母细胞的前向散射光脉冲宽度小于精子细胞的前向散射光脉冲宽度，根椐前向散射光脉冲宽度可将类酵母细胞和精子细胞区别开来。但在低浓度时，精子细胞与酵母细胞区分有一定的难度，在高浓度时，部分类酵母细胞对红细胞计数有交叉污染。
晶体出现在散射图红细胞区域，由于晶体的多样性，所以其散射光强度分布很宽，如草酸盐在散射图上分布接近FSC轴， 尿酸盐依靠自己的荧光其分布区域和红细胞重复在一起，因结晶的中心分布不稳定，所以它和红细胞能够被区分开。当尿酸盐浓度增多时，部分结晶会对红细胞计数影响。
因此，当仪器对类酵母细胞、精子细胞和结晶有标记时，都应离心镜检，才能真正的区分。
⒎导电率的测定
仪器除检测尿沉渣有形成分以外，还能检测出尿液标本的导电率。导电率与渗透量有密切的关系。导电率代表溶液中溶质的质点电荷，与质点的种类、大小无关而渗透量代表溶液中溶质的质点（渗透活力粒子）数量，而与质点的种类、大小及所带的电荷无关，所以导电率与渗透量又有差异，如溶液中含有葡萄糖时，由于葡萄糖是无机物，它没有电荷，与导电无关，但与渗透量有关。
导电率测定的临床意义：⒈正常人尿导电率为──────. ⒉评定病人肾脏浓缩功能。
㈡、全自动尿沉渣分析仪检测项目的临床意义
⒈红细胞、白细胞参考值的调查
由于尿液常规有形成份的检查一致都使用显微镜检查，该法操作要求高、费时、重复性差，结果不易于临床动态观察。干化学尿液分析仪的问世，虽然给尿液有形成份检查带来一些革新，但它给出的结果只是一个半定量的结果，只起过筛分析，也不易于临床动态观察。全自动尿沉查分析仪的开发使用，较好地解决了尿沉渣检查中存在的主要问题。国内外虽有使用，但迄今见健康人参考值的报道。我们使用全自动尿沉渣分析仪对400例健康人尿液红、 白细胞进行测定。结果显示，年龄组之间无明显差异，但男女性别有显著性差异。红细胞：男性为0～12/ul，女性为0～24/ul；白细胞：男性为0～12/ul，女性为0 ～ 26/ul。同时还发现， 全自动尿沉渣分析仪红和白细胞平均数分别为 7.21/ul和5.15/ul，要比离心尿定量检法（分别为2.7/ul和3.26/ul）高2.7 倍和2.2倍，这与国外学者Hawkins报道相似。
⒉检测红细胞形态鉴别血尿来源
1979年Birch和Fairley首先用相差显微镜观察尿红细胞形态变化，把血尿分为肾小球性（肾性）和非肾小球性（非肾性）血尿，这种分类方法以后得到了许多学者的赞同。这样分类法把尿红细胞形态分为均一性和变异性两种，全自动尿沉渣分析仪也是有该功能，它规定：80%红细胞前向光散射强度（Fsc）≥84ch称为均一性红细胞；80%红细胞前向光散射强度（Fsc）≤126ch 称为变异性红细胞；介于二者之间称为混合性红细胞。我们用仪器对95例肾小球和非肾小球出血病人尿红细胞进行测定，如果以临床诊断肾小球病变（肾活检）为标准，以此仪器检测尿变异性红细胞为肾小球病变诊断依居，其敏感性为100%，特异性为78.2%，这与日本学者兵头报道的敏感性为100%，特异性为92.54% 相似。张颖等用该仪器和相差显微镜对肾活检确诊为肾小球疾病患者25例，单纯采用仪器Fsc这一指标诊断肾小球性血尿，则符合率为88%，而采用Fsc 结合尿中病理管型（仪器检测结果）进行判断，则符合率为94.9%， 而相差显微镜的符合率有80%。日本学者兵头报道此仪器的符合率为94.9%，而相差显微镜的符合率为89.8%。因此，在临床诊断工作中， 如尿沉渣检查尿红细胞为均一性可认为肾小球血尿的可能性不大。
⒊判断泌尿系感染，提供有用的白细胞情报
泌尿系感染是泌尿外科的常见病，在尿液中往往同时存在白细胞和细菌，因此，检查尿中白细胞和细菌的存在是诊断泌系感染重要的指标。Muranaka利用此仪器对泌尿系感染病人的尿液进行测定，用白细胞和细菌参数作指标，发现有较好的敏感性和特异性。同时用白细胞数作指标来判断急、慢性泌尿系感染，结果显示：白细胞数＞60/ul可作为急性泌尿系感染；白细胞数＞10/ul可作为慢性泌尿系感染。图 代表典型的急性泌尿系感染时尿白细胞图形，白细胞为高的前向散射光强度和低的荧光强度；图 代表典型的慢性泌尿系感染时尿白细胞图形，白细胞为低的前向散射光强度和高的荧光强度。因此用白细胞和细菌数及白细胞所在图形的区域可以判断是否有泌尿系感染和泌尿系感染的类型。

四、全自动沉渣分析仪操作及注意事项
随着计算机在医院工作的普及，实验室全程自动化，这是当前自动化的趋势，即将几台自动化仪器串联结合起来，构成一个流水作业的‘工作站’。一个样品从贴上条形码，由传送带送到实验室，进入仪器系统，由条码阅读器加以识别，确认，编号，由仪器自动采样，进入仪器测试，打印出报告，并由计算机储存以及通过医院的计算机网络将测试结果传送到各临床科室的终端。自动化程度越高，这就要求检验人员的素质越高，对自动化仪器可能出现的问题全面了解，才能很好地管理好自动仪器，为临床服务。