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毛细管电泳在药物分析中的应用
林金明*, 陈子林
1　前言
　　毛细管电泳(CE)的历史可以归溯到1967年Hejerten发表的博士论文，现在人们普遍将CE定义为在内径100 μm以内的毛细管中进行的电泳分析，它的出发点应归功于1979年Mikkers等人在内径0.2 mm的聚四氟乙烯管中进行的研究。1981年Jorgenson和Lukacs发表的研究论文对CE的发展作出了决定性的贡献，他们用内径75 μm的毛细管对荧光标识氨基酸化合物进行CE测定，获得理论塔板数高达40万的高分离性能，并且深入地阐明了CE的一些基本性能和分离的理论依据。1984年Terabe［1］等人提出了胶束动电毛细管色谱法(MEKC)，使许多电中性化合物的分离成为可能，大大拓宽了CE的应用范围。到80年代后期，CE的研究成为分析化学领域的热门课题，至今已有各种英文专著10多部，这里列举3部与药物分析有密切关系的专著［2～4］，从80年代末开始每年都有多次国际性CE学术会议，表1列出比较有代表性的国际性HPCE会议召开地点和专辑情况，可以看出到目前为止CE研究的中心仍然还在美国。通过STN(the Scientific & Technical Information Network)对美国化学文摘的检索结果表明，90年代以来，CE的论文数几乎成直线上升，应用范围迅速扩大，大有取代目前广泛应用的高效液相色谱(HPLC)之势。鉴于文章篇幅的限制，并考虑到药物分析涉及的范围广、品种多的特点，本文从应用出发，着重叙述一些普通低分子有机合成药的CE分析情况。有关更为详细的综述可以参考最近的报道［5］和J Chromatogr A的特集［2］。
Tab 1　International symposiums on high-performance capillary electrophoresis and their special issue

Symposium
Year
Place
　Special issue
First
1989
Boston, MA (USA)
J Chromatogr, 1989, 480
Second
1990
San Franciso, CA(USA)
J Chromatogr, 1990, 516
Third
1991
San Diago, CA(USA)
J Chromatogr, 1991, 559
Fourth
1992
Amsterdam (Netherland)
J Chromatogr, 1992, 608
Fifth
1993
Orlando, FL(USA)
J Chromatogr A, 1993, 652
Sixth
1994
San Diego, CA(USA)
J Chromatogr A, 1994, 680
Seventh
1995
Wrzburg (Germany)
J Chromatogr A, 1995, 716
Eighth
1996
Orlando, FL(USA)
J Chromatogr A, 1996, 744
　　　　　　　　　1996, 745
Ninth
1997
Anaheim, CA(USA)
J Chromatogr A, 1997, 781
Tenth
1997
Kyoto (Japan)
J Chromatogr A, 1998, 802
Eleventh
1998
Orlando FL(USA)
J Chromatogr A, 1998, 817
Twelfth
1999
Palm Springs, CA(USA)

2　CE与药物分析
　　药物分析大致可分为二大部分：一是原药的定量，原药中不纯物的测定、药剂的分析以及对它们的稳定性的评价等以药品质量管理为目的的测试方法。这些方法要求有良好的选择性，适当的分析灵敏度和可靠的准确度等。二是对进入人体内的药物或代谢物的吸收、分布、代谢、排泄等体内动态的研究，即临床药物分析。这两大部分的测定一般需要分离与检测相结合。目前HPLC法仍然是药物分离测定的主要手段之一，从总体来说CE还处于发展阶段，研究的对象往往与HPLC有许多重复之处，也可以理解成是一种新旧分析方法的半取代过程。CE的高分离性能、超微量进样和几乎没有废液的特点，吸引了大量的分析化学者从事这一领域的研究，使其在药物分析中的应用得到迅速发展，并将持续较长时间。
　　采用CE作为药物分离的手段，首先需要判断分析对象的存在状态，以离子形态存在的样品，一般选择CZE分离模式，而非离子状态的样品则选择MEKC分离模式。这两种分离模式都难以达到满意的结果时，就有必要考虑在泳动电解液中加入一些能与样品产生相互作用的添加剂，如环糊精(CD)或有机溶剂。在泳动电解液中添加适当的修饰剂使分离效果得到改善也是CE分析的主要特征之一。
　　CE的高分离性能和超微量进样成为药物分离分析的一大优势，但也有检测灵敏度不足和再现性差等问题。常用的紫外检测器的检测浓度一般要求样品的进样浓度在10-5 mol.L-1以上，这对于纯药品的测定或实验室进行的研究来说或许不成问题，但在实际应用中，药品中杂质的含量大都只在0.1%左右，浓度过低，难以达到被检测的水平，需要对试样进行前处理。在临床分析时，紫外检出器灵敏度不够的现象也相当突出，所以超微量进样的同时也要求高灵敏度的检测方法。萃取、浓缩等常用的前处理方法仍然在CE分析中发挥重要的作用。Lloyk等［2］针对CE应用于人体液分析时样品的前处理和进样方法作了综述。另外，改善CE的检测方法来提高分析灵敏度也是一项受人关注的研究，如扩大毛细管检测部位的体积或延长毛细管的吸收光路可以使检测灵敏度提1～2个数量级［6］。而根据等速电泳法原理进行的在柱浓缩方法使分析的灵敏度提高上百甚至数万倍［7］。荧光、化学发光、电化学和质谱等高灵敏度检测方法在CE中的应用也有力地推动了CE在药物分析领域的渗透。最近我们开发的固液化学发光体系［8］使CE的在柱检测灵敏度提高到10-8 mol.L-1，并成功地应用于分离和检出ABEI标识的氨基酸。
3　CE在药物分析中的实际应用
3.1　药品质量控制
3.1.1　维生素　维生素是人体机能不可缺乏的一类化合物，它所包含的种类相当多，一般分为水溶性维生素和脂溶性维生素。水溶性维生素大多是以离子形态存在于溶液中，可以采用CZE法进行分离分析，如果遇到混合样品中含有电中性的维生素试样时，则必需选用MEKC分离方法，如烟酸以及它的代谢物具有较强的亲水性，尽管这一类化合物中有个别代谢物在水溶液中以中性分子存在，但它们在水中良好的溶解度可以应用MEKC达到分离的目的［9］。有关脂溶性维生素的分离分析报道还相当少，这一部分的药物具有较强的疏水作用，在表面活性剂形成的胶束中可溶程度相当高，造成用MEKC分离的困难。这种情况下，添加CD能较好地分离维生素A和B［10］。这是因为CD分子内部的空洞结构属疏水性而外部的羟基属亲水性，电中性的CD分子不溶于胶束而随电渗流一起移动，在这过程中，疏水性的药物既溶于胶束又可被CD所包接，在这两种不同相中的分配之差使分离得以实现。同样添加有机溶剂或用非水MEKC也可达到既能溶解脂溶性维生素又可提高分离度的目的。
3.1.2　氨基酸　氨基酸、小肽类化合物的分离是CE研究领域里一个活跃的分支，近几年来，我们研究室一直致力于氨基酸混合物以及分子异构体的分离，采用了几种不同的分离模式，如CGE［11］，MEKC［12］和CEC［13］等，成功地分离了一系列氨基酸混合物，特别是采用了金属络合物的配位基交换原理，在表面活性剂的存在下，简单地分离了如图1所示的12种既具有手性异构又含有位置异构的氨基酸，解决了这一分支中的一个难题。从近年的报道中可以发现，由于组成肽化合物的氨基酸的数目不同，肽分子的分子量以及它们在不同的pH条件下的全电荷量的差异，可以很方便地通过调节泳动液的酸度来进行分离的最优化，所以CZE法非常适用于肽类化合物的分离。周国华等［14］用pH 4.0的磷酸盐缓冲液，对重组人红细胞生成素进行CZE分析，他们认为所建立的方法可有效地分离唾液酸化程度不同的糖基化形式，还可反映重组人红细胞生成素的体内生物活性。同样利用CZE法成功地分离分析抗肿瘤肽类药物醋酸百消灵［15］，比较了缓冲溶液pH 2～12之间的分离情况，发现在pH<3.5时能获得满意的分析结果。但是，也有一些特殊情况，如构成肽分子的氨基酸数目相同，只是肽链中所含的中性氨基酸所处的位置不同，这种情况下，电泳移动度相当，难以采用CZE法，有必要考虑MEKC法。如一种名为抹地灵(motiline)的消化道激素，它是由22种氨基酸组成，只是在第13位上的亮氨酸与蛋氨酸不同，在MEKC电泳中添加有机溶剂作为修饰剂，利用样品的疏水性的差别，得到良好的分离［16］。

Fig 1　Electropherogram of 12 positional and optical isomers of amino acids. Running electrolyte kept at pH 4.0 contains 25 mmol.L-1 Cu2+, 50 mmol.L-1 4-OH-proline and 10 mmol.L-1 SDS. Peaks 1, 2 and negative peaks are system peaks; 3: p-L-tyrosine; 4: p-D-tyrosine; 5: m-L-tyrosine; 6: m-D-tyrosine; 7: o-L-tyrosine; 8: o-D-tyrosine; 9: o-fluoro-L-phenylalanine; 10: o-fluoro-D-phenylalanine; 11: m-fluoro-D-phenylalanine; 12: p-fluoro-L-phenylalanine; 13: m-fluoro-D-phenylalanine; 14: p-fluoro-D-phenylalanine.

3.1.3　解热镇痛药、抗组胺药、消炎药和止咳药　这些药物常用于治疗感冒头痛。这些化合物大部分在溶液中是电中性或不溶于水，比较适合采用MEKC法，早在90年代初寺部等［17］对12种感冒药成分的分离进行了研究，发现5种不同的直链烷基阴离子表面活性剂的极性功能团对分离的选择性有很大的影响。市售的解热镇痛药片中的无水咖啡因、扑热息痛等用MEKC进行分离与定量，回收率接近100%，相对标准偏差低于2%［18］。有关这一方面的应用报道，近几年来逐渐增加，特别是添加有机溶剂、环糊精或混合表面活性剂使MEKC法所能适用的样品范围得到扩大。
3.1.4　降压药　以普萘洛尔为代表的降压药物，分子内含有苯乙醇胺骨架，大多数的化合物呈碱性(pH 10左右)，所以用阳离子表面活性剂的MEKC法分离这一类化合物相当适用［19,20］。如用MEKC法分离测定了尿样中10种β-阻滞剂的含量［19］以及血清样品中9种β-阻滞剂的浓度［20］，尿样测定结果的相对标准偏差在7%以内，但对血清测定结果的相对标准偏差则偏高，大部分在10%左右，最高达15.8%，这也表明对于成分越复杂的样品，测定结果的误差可能性越大，在这一点上，CE与其它方法是相同的。Prunonosa等［21］在100 mmol.L-1硼酸缓冲溶液中(pH 8.3)加入25 mmol.L-1 SDS和10%乙腈，使用内标法对血液中吡啶类降压药环泰宁的浓度进行测定，结果与HPLC法相比较，MEKC分析所需时间短，试样用量少。
3.1.5　抗生素、合成抗菌剂　抗生素、合成抗菌剂大多以离子形态存在于溶液中，适用于CZE法。如用0.15 mol.L-1硼酸作为电泳液(pH 9.4)对硫酸庆大霉素进行分离与定量［22］，针剂中的3种有效成分的移动时间的相对标准偏差为5%，定量结果的相对标准偏差为2.1%～3.6%，与微生物定量法的结果一致。另外，头孢拉定(cephradine)以及所含的主要杂质头孢氨苄(cephalexin)的分析，采用MEKC法可以得到良好的分离［23］，比较了9批头孢拉定冲剂的HPLC和MEKC分析结果，两组的数据非常相近，测定结果的相对差值在-1.66%～0.22%之间。Croubels等［24］比较了用CZE，MEKC和HPLC分离四环素、二氧四环素和二氯四环素的分离特性，在0.2 mol.L-1磷酸盐缓冲溶液(pH 2.2)中添加适当的表面活性剂Triton-100或Tween 20与Tween 80的混合物可使分离效果得到很大的提高，但在含有Triton-100和Briji-35的电泳液中添加β-CD时则分离未改善。而用HPLC分离由于受到酸度的影响，得不到满意的分析结果。
3.1.6　激素、甾族类化合物　甾族类化合物或卵巢激素等，一般是脂溶性和电中性的，比较适合采用MEKC法进行分离分析，但是由于这类化合物的亲脂能力强，在水中不溶或难溶，很容易溶解于具有直链烷基的表面活性基SDS形成的胶束中，这种情况也给分离带来困难。笔者［25］利用非水溶剂的MEKC法对3种甾族化合物进行分离，发现以含有20 mmol.L-1 NaH2PO4和180 mmol.L-1 SDS的甲酰胺有机溶剂为电泳液时，分离效果好，其谱图如图2所示。除了用有机溶剂体系使试样在胶束相和有机相中的分配更有利于分离的处理方法以外，还可在电泳液中添加高浓度的尿素、环糊精等改善试样分子在不同相中的分配比例，在水相溶液中添加适当的有机溶剂是提高分离的有效手段。Vomastova等［26］用由0.81%己醇、6.61%丁醇、3.31% SDS和20 mmol.L-1磷酸盐组成的微乳剂(pH 10.0)作为CE电泳液，分离分析了组织中11β-羟甾脱氢酶，可测的浓度范围为3×10-4～3×10-5 mol.L-1，检出下限达1 pmol。

Fig 2　Electrophoretic separation of three steroids. (1) dexamethasone, (2) prednisolone, (3) testosterone. Conditions: The electrolyte is a formamide containing 20 mmol.L-1 K2HPO4 and 180 mmol.L-1 SDS. The capillary was 0.050 mm ID (0.375 mm OD) of 50 cm in total length and 35 cm to the detection. The applied voltage was 20 kV and the detection wavelength was 254 nm.

3.2　临床应用
　　CE在临床应用方面的研究报道较少，主要原因是检测问题，许多临床样品的浓度都很低，并且成分复杂，所以对血液、尿、唾液等人体液中的相关药物测定时，通常需要对样品进行萃取、浓缩等前处理。尽管如此，采用MEKC作为分离手段时，也有可能直接对血浆或尿样中的某些药物进行分离分析。如尿样中的阿替洛尔以及与其分子结构相类似的一类β-阻滞剂，用pH 9.0的硼酸盐作电泳液时，能成功地分离和分析尿样中阿替洛尔、阿米洛利、氢氯噻嗪和苄氟噻嗪［27］，检出的相关系数在线性范围0.1～10 μg.mL-1内为0.990～0.997，测定的下限为0.1～0.6 μg.mL-1。应用MEKC直接测定血浆、尿、唾液中黄嘌呤时在75 mmol.L-1 SDS (pH 9.0)溶液中得到良好的分离［28］，待测药物的迁移时间约为7～12 min，15 min后才出现血浆蛋白质的吸收峰，这样样品中的蛋白质就不构成对分离的干扰。血浆、尿液中的阿司匹林代谢物的测定也可以采用MEKC法［29］，样品不需前处理，因为样品中的蛋白质成分可以被表面活性剂胶束所包溶，在MEKC过程中，待测物的泳动速度快于蛋白质，可采用直接进样方法，分析速度快，操作也相当方便。此外，还有许多有关医学上CE应用的报道，特别是针对血清、尿液和其他人体组织相关的样品中的药物或代谢物的测定可以参考最近发表的综述文献［30］。
4　结语
　　CE由于它所能应用的药物种类相当多，仅近5年发表的论文已近千篇，对它们进行全面的综述评价是有相当难度的，笔者只能以自己近年来的研究所相关的文献为主，着重介绍了一些常用小分子医药品的CE分离分析的近况，还有许多研究论文以及各种技术等可以参考其他综述文献。
　　从CE的发展来看，目前仍然是分析化学的一个热门的分支，Anal Chem, J Chromatogr等杂志每期都刊登多篇CE分离的论文。尽管如此，这一由经典电泳发展起来的新型分离手段也存在测定的稳定性和准确度的问题。将来能否普及有效地应用于药物的实际分析还有待于时间的证明。不过，从欧美，日本等国发表的药物CE分析数据来看，这一新方法已经涉及到新药开发的研究领域，可以预言在今后较长的一段时期内，CE与HPLC将并驾齐驱，成为药物分析的一种重要工具。
　　关键词　毛细管电泳；胶束动电毛细管色谱法

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作者简介：林金明　男，36岁，博士
　　　　　陈子林　男，35岁，博士生
作者单位：东京都立大学大学院工学研究科应用化学专攻，日本 东京
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转自《药学学报》

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