外源性DNA残留量检测.doc

外源性DNA残留量检测
1.目的
描述外源性DNA残余量检定（地高辛法）的操作过程和注意事项。
2.材料及设备
2.1试剂试液
无水乙醇。Tris饱和酚。三氯甲烷。异戊醇。吐温20。
20%十二烷基硫酸钠（SDS）溶液，用盐酸调pH至7.2。
0.2mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液（pH8.0）。3mol/L醋酸钠溶液。
20×SSC溶液：0.3mol/L柠檬酸钠,3mol/L NaCl,调pH至7.0。
Buffer I (0. lmol/L Tris-HCl，0.15mol/L NaCI，用固体NaOH调pH7. 5)。
Buffer Ⅲ (100mmo1/L Tris-HCl 100mmo1/L NaCI, 50mmo1/LMgCl2，pH9. 5)。
TE缓冲液（pH8.0)：量取1mol/L Tris溶液（pH8.0）10ml,0.5mol/L EDTA溶液（pH8.0）
2ml, 加灭菌水至1000ml。
ECORI内切酶（宝生物工程（大连）有限公司）
BamHI内切酶（宝生物工程（大连）有限公司）
2.2材料和用具
细菌基因组DNA提取试剂盒（天根生物）批号H6611
琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（天根生物）批号I7908
外源DNA残留量检测试剂盒（Roche）货号：11745832910和1109365791
尼龙膜（PALL 0.45微米）
点样器（Bio-RAD;Model No:Bio-Dot SF Cell;Serial No:160BR07680）、移液器、tip头、恒温水浴锅、超净工作台、冰盒、离心机、三维旋混仪、电磁炉
3.操作原理
用随机启动法，将地高辛甙元标记的脱氧尿苷三磷酸掺入未标记DNA，通过一个手臂将dUTP与载体半抗原地高辛甙元连接起来（dig-dUTP）。与目的DNA杂交后，杂交分子用酶联免疫法检测；应用抗体－酶联接物（抗地高辛甙元－碱性磷酸酶复合物）和随后用酶促颜色反应使5－溴－4－氯－3－吲哚磷酸（BCIP）和氮蓝四唑（NBT）显色。

流程图
探针效率确定
酶切 获得DNA片段 探针标记 纯化探针

基因组DNA提取 阳性DNA 变性DNA点膜 预杂交 杂交过夜
样品
终止保存 显色 抗体杂交 封闭 严谨洗涤
4.操作过程
4.1探针制备
4.1.1提取后的基因组DNA用等体积的饱和酚溶液（饱和酚：三氯甲烷：异戊醇=25：24：1）混合均匀，12000rpm离心（4℃）5分钟。轻轻吸取上层液体到另一EP管，在上清液中加入1/10体积3mol/L乙酸钠，稍微震荡或轻弹混匀，然后加入2倍体积加入乙酸钠后的体积）冰无水乙醇，混匀后置于-20℃4小时或-70℃2小时。12000rpm离心（4℃）5分钟，弃液体，加入70%冰乙醇10000rpm离心（4℃）5分钟，弃去液体，室温晾干。加入适量无菌水或TE缓冲液，-20℃保存。
4.1.2纯化后的基因组DNA进行酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收小片段。取1μg 回收DNA用灭菌双蒸水加至16微升，然后放入沸水浴中将DNA变性，水浴10分钟后，立即放入冰水浴中，冰浴5分钟。
4.1.3冰浴后加入试剂盒中的1#试剂5微升，轻轻摇晃混匀，37℃培养过夜。
4.1.4次日，将探针取出，向其EP管内添加0.2mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液（pH8.0）2微升，3mol/L醋酸钠溶液2微升，无水乙醇50微升。
4.1.5将EP管放于-70℃环境中2小时以上。
4.1.6取出探针，15000rpm离心（4℃）15分钟，倾倒上清，用50微升灭菌双蒸水溶解探针，放于4℃环境中备用（不宜超过一周）。
4.2供试品，阳性，阴性及对照处理
4.2.1用纯化后的基因组DNA，稀释梯度为10ng/100μl、 1ng/100μl、100pg/100μl、10pg/100μl，1pg/100μl的阳性对照。阴性对照为稀释液。
4.2.2将供试品、阳性对照、阴性对照置100℃水浴加热10分钟，迅速冰浴冷却5分钟，以8000转/分离心5秒甩水。
4.3点膜及杂交

4.3.1用抽滤加样器将100μl样品全部点样于的杂交膜上。
4.3.2取下杂交膜，点样面向上，置紫外灯下照射30分钟。
4.3.3取无菌培平皿，加10ml已预热（37℃）杂交液，并将杂交膜全部浸泡于其中，置37℃水浴孵育30分钟进行预杂交。
4.3.4预杂交完毕后，倒掉预杂交液加入10ml新鲜预杂交液（50℃）及全部探针（探针置100℃水浴加热10分钟，冰浴5分钟），然后置37℃水浴孵育过夜。
4.4洗脱及显色
4.4.1低严谨性洗脱：取无菌培养平皿，加10ml2X SSC（含0.1%SDS）,将杂交膜全部浸泡其中，室温下置水平脱色摇床，洗２次每次5分钟。
4.4.2高严谨性洗脱：取无菌培养平皿，加10ml0.5X(0.1%SDS)(68℃预热),将杂交液全部浸泡其中，置68℃摇动，洗２次，每次15分钟。
4.4.3平衡：取无菌平皿，加10mlBuffer1（含0.3%吐温20）,将杂交膜全部浸泡其中，室温下置水平脱色摇床震荡。
4.4.4封闭：取一次性无菌培养平皿，加10mlBufferI稀释过的封闭液，将杂交膜全部浸泡其中，室温下置水平脱色摇床震荡30分钟。
4.4.5抗体孵育：取一次性无菌培养平皿，加10mlBufferI稀释过的封闭液，同时加入试剂盒中的4#试剂2微升，将杂交膜全部浸泡其中，室温下置水平脱色摇床，30分钟。
4.4.6洗脱：取一次性无菌培养平皿，加10mlBufferI（0.3％吐温20）,将杂交膜全部浸泡其中，室温下置水平脱色摇床，15分钟，２次。
4.4.7平衡：取一次性无菌培养平皿，加10mlBufferIII，将杂交膜全部浸泡其中，室温下置水平脱色摇床，５分钟。
4.4.8显色：取一次性无菌培养平皿，加10ml BufferIII（含200μl 5#），将杂交膜全部浸泡其中，室温下避光静置0.5小时以上至显色完毕。
4.4.9终止反应：将杂交膜置无菌水中５分钟。
4.4.10湿膜扫描、风干并封膜。
5.结果判定
5.1阳性对照应显色，其颜色深度与DNA含量相对应，呈一定颜色梯度。
5.2阴性、空白对照应不显色，或显色深度小于阳性DNA对照最低的稀释度。
5.3将供试品与阳性对照进行比较，根据显色的深浅判定供试品中外源性DNA的含量。