兴奋剂与兴奋剂检测.pdf

第 23卷?第 2期大 学 化 学2008年 4月今日化学兴奋剂与兴奋剂检测杨树民(国家体育总局运动医学研究所?北京 100029)?汉语中的兴奋剂一词原是指对中枢神经有兴奋作用的一类药物,有时又叫做中枢神经刺激剂,例如麻黄素、苯丙胺等药物。兴奋剂对应的外文词汇是 dope,在 Webster?sNew CollegiateD ictionary中,对 dope的相应注释有两条,一是 麻醉药物制品!(a narcotic preparation),应当就是中文的毒品;另一个是 用于赛马的一种有短暂刺激作用的药物制品!(a preparationgiving to racehorse to sti mulate it te mporarily)。可见 dope一词可能包含着这样一个历史事实,即滥用药物行为始于对麻醉药品的吸食和作为商业活动的赛马,而后又波及到竞技体育中。?竞技体育运动中的可能滥用药物除刺激剂(sti mulant)外,还有麻醉镇痛剂(narcotics),?阻断剂(?blocker),合成类固醇(anabolic steroids),?2?受体激动剂(?2?agonist),利尿剂(diuretics)以及肽类激素(peptide hor mone)。这些药物的 体育临床!作用包括:提高竞争愿望、减缓伤痛、促进人体蛋白合成、稀释尿液中的药物浓度、快速降低体重、促进红细胞的生成进而提升血液中的载氧量等。它们对运动员的训练和比赛成绩都有明确、有效的辅助作用。?20世纪 80年代以来,国外竞技体育中的药物滥用行为有加剧的趋势,国际奥委会为了奥林匹克运动的纯洁和公正,开始重视和加强了兴奋剂检测(dope test)工作。目前国际反兴奋剂局(W orldAnti?Doping Agency,WADA)公布的禁用药物清单包括近 200种药物和被禁止的相关欺诈行为(manipulation)。?兴奋剂检测工作就是针对以上所述的药物种类和 体育临床!药理在尿液和血液中检测这些药物的存在并以此判断个别运动员可能的药物滥用行为。1?兴奋剂检测的样品特点?按国际奥委会的规定,兴奋剂检测的绝大多数项目在人体尿液中进行。正常人的尿液中含有尿酸、尿素、肌酸(酐)、微量的蛋白、微量的糖、内源性化合物代谢物等成分,样品基质的构成相对要复杂一些。运动员的尿液由于大负荷的训练和比赛可能含有比正常人更多的蛋白,也比正常人容易出现血尿。?正常人的尿液比重为 1.005 1.030之间,pH 为 5.5 7.5。有意超量饮水或服用利尿药物可以增加排尿量,冲稀尿液,达到降低尿中药物浓度的目的,但此时的尿液比重会出现异常。服用利尿药物也可以达到冲稀尿液的目的,但此时可在尿中检出服用的利尿剂,而利尿剂也是禁用药物。服用碳酐酶抑制剂(利尿剂的一种)可以使尿液碱性化,碱性尿液对碱性药物(如某些中枢神经刺激剂)的排泄有抑制作用,会降低尿液中的药物浓度,也可以达到掩盖用药行为的目的。这就是在兴奋剂检测中要准确测定尿液样品的比重和 p H 作为辅助检测项目的原13因。?禁用的兴奋剂药物基本上都要通过肾脏来消除,服用药物之后,在一定的时间段内尿中会出现服用的原形药物及其代谢物。这些药物有的是以游离形式存在于尿中,有的则是以所谓结合方式进入尿中。药物以结合方式进行的代谢又称为二相代谢,结合产物通常是葡萄糖醛酸酐和硫酸酯,它们均出自于人类、试验动物和一些饲养动物体内自发的对弱极性异物的排除过程 1。?药物的葡萄糖醛酸酐和硫酸酯具有极性大、水溶性好、沸点高的特点,一般不能被直接用作分析对象,特别是在气相色谱或气质联机上。这样在方法程序上就要加入酶解或酸解步骤,使其重新成为原来结构形式的药物分子。酶解采用的试剂为葡萄糖醛酸苷/硫酸酯水解酶,酶解条件较为温和,有利于保护药物分子的完整,但酶解需要增加分析成本。酸解一般使用盐酸,成本低,但条件严酷,而且在酸解过程中可能有部分药物分子被破坏。?服药后尿液中的药物浓度主要与给药剂量有关,也与给药方式、代谢途径、药物自身的化学性质等因素有关。在建立标准的检测方法前,要通过人体给药实验确定在一定剂量下每一种药物的可检出 时限。由于兴奋 剂检测对绝大多数 禁用药物的规定为 不得 检出!(no detecting,ND),也就是说只要能确认尿液中存在某种外源性(exogenous)禁用药物,则无论其浓度高低,均可以判定为阳性。又由于检测中所采用仪器(GC?MS,LC?MS)的绝对灵敏度对多数药物而言处在 ng级水平,因此兴奋剂检测实际上是一种?g/L水平上的定性分析工作。这就要求所用的检测仪器对数目众多、化学性质不尽相同的药物都有一定的响应值和特征的信号表达。目前能够满足这一要求的仪器主要是气相色谱?质谱联用仪(GC?MS)和液相色谱?质谱联用仪(LC?MS)。?对于这种检测模式,国内外的兴奋剂检测实验室都在检测方法的灵敏度及用药和停药后的可检出时限方面做了大量研究工作,使得有些药物在停药一个月后,尿样中仍可检测出被服用的药物代谢物。这样的检测技术对药物滥用行为构成了很强的制约作用,但同时也会大大增加先期研究的工作量,同时对日常的检测工作也提出了很高的要求。2?兴奋剂检测的方法特点?简言之,兴奋剂检测是在大量的常规(routine)样本中,在 有限!未知范围内(禁用药物表)筛查出含有某种禁用药物的可疑样品。因此其工作特点是样品量大、涉及到多种药物或代谢物,类似于农药或兽药的多组分残留分析。?兴奋剂的样品检测开始于初筛(screening)分析,必需的化学前处理通常采用液液萃取(LLE)或固相萃取(SPE)。前处理过程提取并富集尿液中的药物成分,并对提取物进一步纯化,尽量除去那些能对检测造成干扰的、统称为生物学基质的样品成分,如蛋白质等。兴奋剂检测的多年实践证明,液液萃取由于可采用不同的萃取溶剂、控制不同的 p H,从而可适用于各类兴奋剂药物的检测,并且具有稳定的回收率。固相萃取则具有选择性好、溶剂用量少等优点,但回收率有时不稳定。?在进行了化学前处理之后,如果采用 GC?MS作为检测仪器,则许多诸如合成类固醇一类的高沸点药物要经过衍生化处理方可进样分析。如果采用 LC或 LC?MS,样品经前处理后就可以进样分析。如同其他的分析检测领域一样,LC?MS分析技术的快速发展和完善,使得许多药物在 LC?MS上实现了可靠、快速的分析。14?初筛分析的数据采集模式一般用 GC?MS或 LC?MS的 SI M(selected ionmonitoring)模式来完成,即所谓的选择离子采集模式或者是多级质谱(离子阱、串联四极杆)中的 MRM 模式(multiple?reaction monitoring)。这样做提高了对目标离子的采集频率,可以成数量级地提高仪器的检出灵敏度,同时减少了数据存储所占用的空间。?对任何一个特定的药物或药物代谢物,首先经过先期试验确定它的几个质谱特征离子,观察几个离子之间的丰度比的恒定程度,确定检测用的目标离子。确定目标离子后,以色谱保留时间为中心,在控制程序中指定这几个离子的采集时间范围,即所谓采集的时间窗口(ti mew indow)。检测中一旦在此窗口中发现了这几个离子,且丰度比与标准化合物基本吻合,即可判定为可疑样品。图 1是一个 SI M模式工作的示意图。如图 1所示,如果发现 3个离子丰度的极大值重合在同一时间点上,则可证明这 3个离子来自于同一个化合物。(图 1所示的是一个最理想状态。)窗口式的采集模式首先要保证色谱保留时间的稳定重现,因为如果保留时间出现较大的偏离,则可能在窗口中被丢失,造成漏检。图 1?时间窗口式采集示意图?初筛中一旦发现了可疑样品,则要进行确证(confir mation)分析。确证分析的样品前处理方法要与初筛分析保持完全一致,但要另取一定体积的同一份尿样进行提取。由于确证分析要以全扫描(full scan)模式进行,取样量可以稍大一些。?对确证分析的要求是以被测定样品全质谱图经过与标准化合物(标准品)、阳性尿样(标准样品)的全质谱图比对,确认构成全质谱图的离子及其丰度比一致方可认定为阳性。标准物、阳性尿样和被确证样品中的同一药物或代谢物在色谱上的相对保留时间(rRt)也要一致。确证分析中还要求用试剂空白和空白尿样进行比对,以避免由于污染造成假阳性结论。?在采集现场采集的运动员的同一份尿样要密封保存在两个瓶子中,称之为 A瓶和 B瓶,实验室检测时仅开启 A瓶使用。如果确证结果为阳性,运动员有权要求对 B瓶进行复核检测,这个规定程序称之为 开 B瓶!。A瓶和 B瓶的检测结果一致,则该份尿样被最终判定为阳性。3?内源性物质的分析检测?人类在研发临床药物的过程中,对许多体内自身产生的活性物质进行了模拟,合成了大量的这类药物。当它们被用于人体时,就构成了这些活性物质的内、外源性来源,而兴奋剂检测必须对此加以识别。?兴奋剂检测中涉及到内源性来源的药物有 3类,即拟交感神经剂、蛋白同化激素和分子量15很大的肽类激素。?内源性拟交感神经剂(sympathom i metics)主要是由肾上腺髓质分泌的肾上腺素(adrena?line)和多巴胺(dopa m ine),它们是一个化合物族群,统称为儿茶酚胺(catechola m ine)。这是一类人体自身分泌的小分子神经递质,应激状态下的分泌会明显增加。这类药物的滥用在竞技体育中并不多见内源性类固醇是一类被称为生命激素的物质,主要包括雄性激素、雌性激素、孕激素和糖皮质激素(图 2)。这些激素有相同的母体结构,即环戊烷多氢菲,又称为甾体结构。这种结构具有并合的 A、B、C 3个六元环和一个五元环,多为椅式和半椅式结构,整体为弯曲平面,取代基有 和?之分。就整体分子的碳数而言,雄性激素一般为 19碳,雌性激素为 18碳,孕激素和糖皮质激素则为 21或更高的碳数。这些化合物都有成熟的工艺可由人工合成,且多数已经成为注册药物或原料药物。图 2?几种内源性类固醇的结构?雄性激素在人体内有两种作用,一是作为性激素(sex hor mone)维持人体生殖功能、性功能和性征;二是作为蛋白同化激素(anabolic hormone或 anabolic steroid)。竞技体育中滥用的是后一种作用。蛋白同化作用可以促进人体的蛋白合成,加速人体的肌肉生长并增强肌肉力量,同时也会增强用药者的攻击性和竞争愿望。?雄性激素的分泌、转运、吸收、代谢过程较复杂,涉及到人体的内分泌系统以及肝脏功能和性器官功能,与体内的多种生物化学过程密切相关。?业已证明的是,雄性激素对于运动成绩的提高具有明确的作用,是滥用药物中最为流行的一种,也是兴奋剂检测重点控制的药物品种。在被滥用的这类药物中,包括外源性合成药物诸如大力补(methandienone)、康力龙(stanozolol)等。外源性药物是指人体内本来不存在的成分。对于外源性药物检测,只要确证其药物原形和(或)其代谢物的存在就可以判定为阳性;而内源性药物(体内本来就有的)的检测就要麻烦得多。?人体自身可以分泌(即内源性)的雄性激素包括:睾酮(testosterone)、双氢睾酮(dihydrotes?tosterone);睾酮前体物质雄烯二酮(androstenedione)、雄烯二醇(androstenediol)、脱氢异雄酮(dehydroisoandrosterone,DHEA)等。?内源性药物的分子结构、分子量以及它们在体内的代谢方式与相应的人工合成物是完全相同的,这些人工合成物经一定的给药方式进入体内后,对它们的检测首先要解决的是它们与人体自身内源性来源的区分问题。区别这些药物的内源性或外源性来源只有两个办法,一是16做量上的区别和判断,二是作属性的区别和判断。?早期的检测方法主要依靠量的区别,即首先要知道人体的正常(尿)水平应当是多少,对于多种体内成分来说,这无疑是一个工作量巨大且繁琐的工作。临床内分泌的研究和实践提供了一部分正常值可资借鉴,但数量不多,且多为血液中的数据。因此兴奋剂检测实验室要自行完成更多的正常值测定及样本统计工作。?人血清睾酮正常值一般为几十到上千 ng/mL(包括男性和女性),被代谢进入尿液中的睾酮正常值一般为 ng/mL级水平。血清或尿中的睾酮水平均与人种、民族、性别、年龄相关,职业运动员的训练强度和体能状态对它的影响也很明显。由于以上诸种因素的影响,测定尿中睾酮的绝对浓度并以此作为判据就变得很困难。为此在实际检测中采用了睾酮的一个非活性的表化异构体表睾酮(epitestosterone)作为参比,并将它们的比值作为检测指标。根据国内外实验室多年积累的检测数据,目前确认睾酮与表睾酮在人尿中的浓度之比应为 1.2左右。考虑到上述的差异及先天性生理异常、正常的生理变化以及潜在的病理变化等诸种因素,国际奥委会将内、外源性睾酮的区别依据,也就是阳性判据规定为睾酮与表睾酮之比小于 6时为阴性;6 10之间为可疑,要进行追踪检测;大于 10时可以确认为有睾酮类物质的外源性来源,即该尿样为阳性。这个规定一直延用至今。?除睾酮外,双氢睾酮也是一个重要的可经人工合成的内源性物质。双氢睾酮可以被认为是睾酮的还原代谢产物,但它的活性非常强,有报道说其蛋白同化作用要比睾酮强 10倍,并因此受到滥用者的青睐。双氢睾酮的商品制剂多为注射用药和舌下含服剂,药物半衰期仅为20m in。专门的实验证明,双氢睾酮可以引起尿液中多种相关代谢物水平的变化(见表 1),并据此建立了检测方法。表 1?双氢睾酮的阳性判据测定原始数据(尿液)测定物!/ng mL-1有阳性判断意义的比值基于样本统计的阳性判据男性女性AndEtioET5 3 5?3 5 3?DHT673218262196184489375 3/5?3 And/EtiomDHT/EtioDHT/ET11.43.7513445 3/5?3 And/EtiomDHT/EtioDHT/ET 3 3 30 2.5 2 2.5 14 3.5?表 1中 And为雄酮;Etio为苯胆烷醇酮,是睾酮的终极代谢产物;5 3?和 5?3 指雄甾烷二醇的一对异构体,被认为是主要产生于双氢睾酮的代谢物;DHT为双氢睾酮,ET为表睾酮;mDHT为 DHT#1000。由于 DHT半衰期很短,单剂量注射后超过 16h原形药物在尿中就很难检测到,因此在实际检测中最重要的阳性判据是 5 3/5?3,And/Etio可以作为辅助判据。?作为睾酮前体化合物的雄烯二醇和雄烯二酮同样有比较强的蛋白合成作用。其中对雄烯二醇的研究证明,在单次给药 100mg后的 10h之内,睾酮和表睾酮在尿中的质量浓度将分别达到 3000 5000ng/mL和 1000ng/mL,这虽然是极为异常的绝对浓度,但他们的比值不会超过I OC的 控 制 范 围。某 些 研 究 文 章 提 出 雄 烯 二 醇 的 检 测 可 以 依 据 一 对 称 为3?,3?羟基?4?雄烯?17?酮的异构体,它们是雄烯二醇向雄烯二酮、睾酮乃至最终代谢物雄酮/17本胆烷醇酮转化过程中产生的中间体(图 3)。在 GC?MS分析中,它们的保留时间更短,质谱信号将出现在雄酮和苯胆烷醇酮的前面,在气质联机采集到的总离子流图上有很明显的位置,很容易辨认。图 3?雄烯二醇向睾酮转化的中间体?以上叙述说明,按照以量区别的方法来检测内源性雄性激素人工合成产物是比较繁琐的,因此现在倾向于使用气相色谱?同位素质谱联用仪来检测这一类化合物。?同位素质谱检测的依据是用于类固醇人工合成原料的12C/13C与体内自身合成的类固醇的12C/13C有着微小的差别这样一个事实,这一差别已经通过实验得到证实,并可以在同位素质谱上进行鉴别。检测中配合气相色谱的保留时间即可判定所发现的人工合成内源性物质的确定归属。4?LC?M S技术在兴奋剂检测中的应用?随着兴奋剂 滥用水平!的提升,兴奋剂检测也需要技术上的不断进步。某些药物原本在GC?MS做得不好,许多新增药物品种根本不适合以 GC?MS来检测,此时可以优先考虑采用LC?MS技术。?糖皮质激素是人体肾脏皮质分泌的内源性物质,它可以维持/提升人体糖、蛋白质和脂肪的基础代谢水平。相应的体外合成产物与内源性物质的生理活性完全相同,对运动员的体能和竞技状态都有一定的增强作用,但没有明显的蛋白合成作用。此外,糖皮质激素是运动创伤治疗中的一线药物。因此与雄性激素不同,它存在着正常临床使用和滥用两种可能。?就化学性质而言,糖皮质激素极性大,沸点高,气化困难,即便经过硅烷化、乙酰化或混合衍生化反应,在气质联机上仍然很难给出可靠、完整、重现的质谱信号。因此,在液质联机技术出现之前,多是依靠 HPLC?UV来完成它的定性和定量检测。有关方法学研究也多专注于气相色谱的衍生化技术,但始终没有形成可靠的质谱检测方法。?随着液质联机技术和产品的成熟,目前兴奋剂检测已经采用液质方法对人尿中糖皮质激素进行检测,但这个方法目前仅限于原形药物的检测,还没有用于相应代谢物的检测;究其原因,并不是仪器方法的问题而是一般所公认的糖皮质激素的复杂代谢过程。?用液质联机,以 ESI(电喷雾电离)或 APCI(大气压化学电离)为接口(离子化装置),可以在液相色谱较好分离的前提下快速确证尿中的 20多种糖皮质激素。检测工作在 ESI或 APCI接口的正、负模式下均可进行,而且都能给出很特征的质谱信号。如,在正模式下大多数糖皮质激素会出现准分子离子峰(M+1)和一系列的脱水峰(M+1-n#18),脱去 1分子水、2分子水甚至 3分子水。而在负模式下可以出现脱去一分子甲醛生成 M-1-30碎片,这些质谱碎片显著不同于其他药物,构成了非常特征的质谱,为检测工作带来了很大的便利 2。图 4是糖皮质激素之一泼尼松龙的 ESI(-)质谱图,图 4中的(M-1-30)碎片丰度很高,很容易识别。缺点是其他碎片丰度太小,且开裂机制不清楚,没有太高的鉴定价值。18图 4?泼尼松龙 ESI(-)全扫描质谱图?液质联机技术不需要对被测定的药物分子进行衍生化反应,质谱信息保留了药物分子的结构原貌,这非常有利于对那些未知程度更高的药物进行鉴定,在保健食品的兴奋剂检测中也显得尤为重要。?我国保健食品的独特之处在于许多产品是以中药组方为基础开发的,它们对于人体的某些慢性疾病有很好的调理作用。但以中药为基础的保健品并不像某些宣传那样有立竿见影的效果。基于商业利益的驱动,在某些中药保健品中非法添加兴奋剂或类兴奋剂化学合成药就成了个别商家的 秘密!武器。尽管添加物一般是在临床药理或药理新阐述的指导下进行,但某些添加药物已经超出了允许的范围。其中一部分,特别是一些处方药物还可能对消费者造成严重的后果。由于国家有关部门加强了对非法添加行为的打击力度,药物添加行为变得更为隐蔽。为了逃避检查,添加药物倾向于使用一些未加控制的新品种或经过结构改造但保存了原有药理活性的药物。这种情况促使检测工作的筛查范围更为广泛,同时要求结论更为准确,因此获得最直接的药物原始结构信息就变得尤为重要。由于液质联机技术对绝大多数药物分子都可以进行有效的离子化,无须对被测定的药物分子进行衍生化反应,质谱信息又可以保留药物分子的结构原貌,从而可以在高 未知程度!的药物检测中有效地发挥它的优势。?以下是两个检测实例:实例 1?人尿中热不稳定化合物 mesocarb及其代谢物检出。?mesocarb(Mr=322),系统名称为:(3?(1?methyl?2?phenylethyl)?N?(phenyla m inocarbonyl)?1,2,3?ox idiazolium?5?am inide),属 N?氨基甲酰斯德酮胺一族的化合物。这个药物曾一度为 热门!的竞技体育滥用药物,虽已经过了作为抗抑郁剂和刺激剂的临床实验,但仍是未经注册的 地下!药物 3。?mesocarb分子中含有一个内消旋离子杂环(meso?ionic heterocycles),整体分子的热稳定性很差,虽经各种衍生化(甲基化、硅烷化、乙酰化)处理,用 GC?MS方法也只能检出该药的一个热解碎片。人尿中的 mesocarb 经乙酰化后的 GC?MS 分析也仅可检出碎片离子m/z 91,m/z 119,m/z 230和m/z 299,仅以这些碎片来确认被检出物为 mesocarb是不可靠的,更无法判定这个碎片是来自于母体药物或是其代谢物(图 5)。?使用液质联机技术对此药物进行的检测则可以得到清晰的结论。口服 mesocarb后采集的阳性尿液经酸解后以单四极杆液质联机进行分析,结果如图 6、图 7所示。?由于液质离子化方式可以保留分子的整体结构,进而在质谱上表达出完整的结构信息,因此对于如 mesocarb这样的未经注册的,高未知程度且热稳定性不好的药物可以进行有效的识别和确认,而使用气质联机的 EI质谱则很难做到。19图 5?人尿中乙酰化 m esocarb的气质联机 EI质谱?图 6?人尿中 m esocarb的 ESI(+)质谱?图 7?人尿中 m esocarb代谢物(羟基化)的 ESI(+)质谱?实例 2?抗疲劳保健食品兴奋剂类药物检测中发现的某未知西药成分 391!的被测定准分子离子为m/z 391(M+1),因此该药物的 Mr应当是 390。该药物 TIC(总离子流图)和一级全扫描质谱如图 8。?根据先前的检测经验,这个药物与当时市场流行的一种血管扩张剂(vasodilator)西力士(C ialis)的一级质谱非常类似(见图 9)。?观察两个药物的总离子流图和质谱图可知,未知药物 391!与西力士的准分子离子峰及主要碎片 m/z 268都只差单位质量数。两个药物在液相色谱上的保留时间也仅差 0.4m in,因此可以认为这是一个与西力士化学结构(图 10)很相近的药物。由于该药物的分子量为偶数,根据 N律知道它应当含有偶数个 N原子,也就是说这个药物结构被进行了改造,增加了 N原子的个数。为了确认这个结论,进行了核磁共振氢谱分析,结果表明,与西力士相比,391!多了一组活泼氢的信号,可以支持 N原子个数增加的结论。?根据以上所述的质谱分析和核磁共振氢谱分析,可以基本确定未知药物 391!是在西力士结构的基础上经过改造而得到的。这个结论在获得 391!的高纯度(99%)原料药物之后,经过比对分析,得到了最终证明。20图 8?391!的 TIC和一级质谱图图 9?西力士的 TIC和一级质谱图图 10?西力士的化学结构?以上两个实例可以说明对于某些未知程度高的药物和某些未知程度高且化学性质不稳定的药物,液质联机技术已经成为检测方法的首选。在实际检测中,仅仅以质谱数据来判定一个未知程度很高的药物的归属并不是十分可靠的,但综合样品来源、药理、药效信息,并在必要时使用其他一些辅助检测手段,就可以基本确定这些未知药物的归属。参?考?文?献1?BoguszM J,M aierR D,ErkensM,et al.J ChromatogrB,1997,703:1152?M azzarino M,Bragan?M C,Botr?F.R ecentA dvances in Doping Analysis(14),Buch B cher dd ag.Birkach.2006,17:253?汪正范,杨树民,吴侔天,等.色谱联用技术.第 2版.北京:化学工业出版社,200721