植物细胞悬浮培养技术.docx

植物细胞悬浮培养技术
一、基本原理
    利用固体琼脂培养基对植物的离体组织进行培养的方法在某些方面还存在一些缺点，比如在培养过程中，植物的愈伤组织在生长过程中的营养成分、植物组织产生的代谢物质呈现一个梯度分布，而且琼脂本身也有一些不明的物质成分可能对培养物产生影响，从而导致植物组织生长发育过程中代谢的改变而利用液体培养基则可以克服这一缺点，当植物的组织在液体培养基中生长时，我们可以通过薄层震荡培养或向培养基中通气用以改善培养基中氧气的供应。植物细胞的悬浮培养是指将植物细胞或较小的细胞团悬浮在液体培养基中进行培养，在培养过程中能够保持良好的分散状态。这些小的细胞聚合体通常来自植物的愈伤组织。
    一般的操作过程是把未分化的愈伤组织转移到液体培养基中进行培养。在培养过程中不断进行旋转震荡，一般可用100～12Or/min 的速度进行。由于液体培养基的旋转和震荡，使得愈伤组织上分裂的细胞不断游离下来。在液体培养基中的培养物是混杂的，既有游离的单个细胞，也有较大的细胞团块，还有接种物的死细胞残渣。
    在液体悬浮培养过程中应注意及时进行细胞继代培养，因为当培养物生长到一定时期将进入分裂的静止期。对于多数悬浮培养物来说，细胞在培养到第18～25d 时达到最大的密度，此时应进行第一次继代培养。在继代培养时，应将较大的细胞团块和接种物残渣除去。若从植物器官或组织开始建立细胞悬浮培养体系，就包括愈伤组织的诱导、继代培养、单细胞分离和悬浮培养。目前这项技术已经广泛应用于细胞的形态、生理、遗传、凋亡等研究工作，特别是为基因工程在植物细胞水平上的操作提供了理想的材料和途径。经过转化的植物细胞再经过诱导分化形成植株，即可获得携带有目标基因的个体。
二、器材
超净工作台、高压蒸汽灭菌器、恒温培养箱、磁力搅拌器、恒温空气摇床、镊子、锥形瓶、水稻种子
三、操作步骤
1．配制培养基
   按照培养基配方取各种药品，最后用蒸馏水定容到所需体积。所配制的培养基经高压蒸汽灭菌后备用，固体琼脂培养基分装在250mL 的锥形瓶内，每瓶约分装30mL。
2．水稻种子的消毒
（1）将种子置于无菌的培养皿内，以体积分数95％的酒精消毒1～2min。
（2）取出后用无菌水冲洗2～3 遍。
（3）将种子放入25.0g/L 的次氯酸钠溶液中轻轻摇动后，浸泡60min 。
（4）取出后用无菌水冲洗，将次氯酸钠溶液充分洗净。
3. 接种
   在超净工作台内，将灭菌后的水稻种子接到诱导愈伤组织的固体培养基上，每个培养瓶接5～10 粒种子。接种完毕后用封口膜将培养瓶封好，放在26℃的恒温培养箱中进行黑暗培养。
4．悬浮培养的开始：
   当得到愈伤组织后，将其转人到AA 液体培养基中。注意愈伤组织块应小于3mm . 若组织块较大可用无菌解剖刀将其分割成小块。液体培养基分装在250mL 的锥形瓶内．接种完毕后将瓶口用封口膜封好，把培养瓶放到恒温摇床上进行震荡培养。调整摇床的旋转速度，使之为120r/min。培养温度为26℃，在黑暗中培养。
5．悬浮培养物的保持
   进行悬浮培养后要不断进行观察，由于培养物的继代培养与培养瓶内培养物的密度及细胞生长速度有关，因此当发现培养瓶中培养物密度较大时，应及时用无菌的吸管吸取部分培养物到一新的50mL 培养基中继续培养。同时还要及时淘汰一些大的组织团块和黄褐色的坏死组织。一般每隔4～7d 就要继代一次。
植物组织培养技术
2011-05-08 19:21
第五章 细胞培养
教学目的：掌握植物单细胞培养与细胞悬浮培养的方法和技术，熟悉细胞培养的影响因素，了解细胞培养的应用。
教学重点：1、单细胞培养的方法与技术；
2、细胞悬浮培养的方法与技术；
3、悬浮细胞的同步化技术。
教学难点：细胞培养的影响因素及其生长调控。
教学内容：
1、植物细胞培养：指在离体条件下对植物单个细胞或小的细胞团进行培养使其繁殖的技术。
2、植物细胞培养的类型：
（1）根据培养规模：分为小规模培养和大批量培养；
（2）根据培养方式：分为悬浮培养、平板培养和看护培养；
（3）根据要求的产物不同：分为诱变的细胞培养和生产次生代谢物的细胞培养。

第一节 单细胞培养
意义：在进行细胞株（种子细胞）的选择以及一些需要对细胞活动跟踪观察的情况下必须进行真正意义上的单细胞培养。
一、单细胞的分离：
1、由培养组织中分离单细胞：
（1）松散的愈伤组织：通过液体振荡培养、分离过筛获得，最常用；
（2）幼胚、幼苗等：通过破碎、酶解等方法获得。
2、由完整植物器官分离单细胞：
（1）机械破碎法：刀刮或研碎，如叶肉细胞
特点：细胞不受酶毒害，无质壁分离，生活力强，但应用不普遍，仅适用于排列松散的植物组织。
（2）酶解法：果胶酶、纤维素酶
特点：可获得大量游离细胞，但必须对细胞给予渗透压保护。
（3）化学方法：秋水仙素
二、单细胞培养的方法：
1、看护培养法：
（1）方法：在固体培养基上置入一块活跃生长的愈伤组织，上放一小片滤纸（一般放置过夜），滤纸上接种细胞悬浮液，待细胞长出微小细胞团后直接转至琼脂培养基上让其迅速生长，即可获得单细胞无性系。
（2）特点：操作简便，易于成功，但不能在显微镜下观察。
2、微室培养：便于观察
（1）方法：采用载玻片和盖玻片用石蜡油或其它物质密封做成微室进行细胞悬浮液的培养，待细胞团长至适当大小时转入新鲜半固体培养基上继续培养。
（2）特点：便于显微观察记录，但营养液容易变干，需及时转接。
3、平板培养法：应用最广泛
（1）平板培养：指将一定密度的悬浮细胞接种到一薄层固体培养基中进行培养的技术。
（2）方法：将琼脂或琼脂糖培养基冷却至35℃左右（不凝固），与细胞悬浮液混合后进行植板（厚度约1mm），使细胞被包埋在固体培养基中形成一个平板，培养于25℃、黑暗的条件下。
（3）特点：筛选效率高、筛选量大、操作简单，且便于定位观察。
（4）效果：一般用植板率衡量
植板率：指能长出细胞团的单细胞在接种单细胞中所占的比例。
植板率=每个平板形成的细胞团数/每个平板接种的细胞总数×100%
4、其它单细胞培养技术：
（1）饲养层培养技术：加入饲养细胞混合后进行培养。
（2）双层滤纸植板培养技术：将饲养细胞与培养细胞用双层滤纸分离培养。
三、影响单细胞培养的因子：
1、初始植板细胞密度：一般为1×103-1×105个/ml
密度较高时对培养基成分要求相对较低，密度较低时对培养基成分要求相对较复杂。
2、培养基成分：一般需有机附加物。

第二节 细胞悬浮培养
一、细胞悬浮培养：
1、概念：指将单个游离细胞或小细胞团悬浮在液体培养基中进行培养增殖的技术。
2、意义：
①在液体状态下便于细胞和营养物质的充分接触和交换；
②细胞状态可相对保持一致，利于进行各种遗传操作和生理生化活动的研究。
③为植物细胞的大规模培养提供前期技术基础。
3、内容：
①小细胞团培养；
②单细胞培养；
③原生质体培养。
二、悬浮培养的启动：
1、种子细胞悬浮系的要求：细胞增殖速度快、有用成分含量高、分散程度大、再生能力强。
2、优良细胞株系的筛选方法：
①从已经建立的愈伤组织中挑选出外观疏松、生长较快、胚胎发生能力强的淡色愈伤组织；
②采用振荡培养或酶解法得到更好的单细胞系或小细胞团；
③培养后单细胞或小细胞团搁在固体培养基上进行培养；
④挑选生长较快、生长良好的细胞株进行继代培养；
⑤挑选各细胞系的培养物进行有效成分测定，筛选有效成分高而生长较快的细胞株作为种子细胞。
三、细胞悬浮培养的方法：
（一）分批培养：
1、分批培养：指在一个封闭的系统中进行的细胞悬浮培养，仅气体和挥发性代谢产物可同外界空气交换。
2、悬浮细胞的生长：细胞数量随着培养时间的变化，其扩增生长呈S形曲线，包括停滞期、对数生长期、直线生长期、减慢期和停止期5个时期。
注：①通过缩短继代的时间或是经过一些其他的处理使悬浮培养的细胞始终处在对数生长期；
②加入条件培养基可以缩短停滞期的时间，使悬浮细胞快速恢复生长。
3、分批培养的方法：
①旋转培养：培养容器呈360°旋转，转速
②往返振荡培养：培养容器在一个方向上往返振荡；
③旋转振荡培养：培养物在一个平面上进行旋转振荡，转速40-120r/min，如摇床培养；
④搅动培养：培养物在搅棒的搅动下进行的培养。
4、分批培养的特点：细胞生长和培养基的成分都在不断地变化，对细胞生长和代谢的研究不利。
（二）半连续培养：
1、指在培养容器中接种细胞并培养一段时间后，将部分培养液和新鲜培养进行交换的一种培养方法。
2、半连续培养的特点：
①培养中不断补充培养基的营养成分，细胞可保持旺盛的生长；
②培养中没有进行继代，细胞不会出现停滞期；
③通过数次的、反复的操作达到生产细胞和有用物质的目的，简化了操作过程。
（三）连续培养：
1、连续培养：指采用一定体积的但非密闭的生物反应器来进行大规模培养的方法，培养过程中不断排出旧的培养基、注入新鲜培养基，使其营养物质连续得到补充，细胞的生长和增殖连续进行。
2、连续培养的方法：
（1）封闭式连续培养：指在连续培养中收集流出的细胞返回原培养体系进行培养的方法，培养中细胞数目不断增加，适合于非生长偶联型产物的生产。
（2）开放式连续培养：通过不断添加新鲜培养基，同时移去等体积的原培养液（内含培养细胞）来维持培养液体积不变，细胞始终维持在接近最高水平的一个稳定的数值上。
①化学恒定法：新鲜培养基的某一种营养液或成分被除调节成限制因子，并以恒定速率输入而建立一个恒定状态。
特点：通过营养物质的浓度来控制细胞增长的速率，适合于生长偶联型产物的生产。
②浊度恒定法：通过比浊计来测定培养液中的细胞混浊度，通过控制培养液的流入量使悬浮液浊度恒定。
特点：灵敏度高，适合于自动控制。
四、细胞悬浮培养基：
1、常用基本培养基：B5、ER
  使用：仅适合于细胞的初始浓度大于5×104个/ml时，较低的细胞浓度需加入其他复合的有机成分。
2、细胞悬浮培养对培养基的需求特点：细胞的生长、分化或次生代谢物质的生产所要求的营养成分不同。
两步培养：先在细胞生长培养基中培养大批量细胞，当细胞生长至合成产物阶段后，再转入到产物合成培养基中进行培养生产次生代谢物质。
五、影响悬浮细胞生长的因素：
1、起始愈伤组织的质量：增殖快、易松散、产量高
2、接种细胞密度：一般为（0.5-2.5）×104个/ml
3、培养条件：方式、温度、继代周期、振荡频率等
六、悬浮细胞的同步化：
1、物理方法：对细胞正常的生理生化代谢影响较小，但细胞获取量太少。
①电动离心分层法：不同分裂时期细胞的沉降速率不同；
②温度处理法：低温抑制细胞分裂；
③辐射处理法：使细胞在分裂前积累；
④有丝分裂选择法：有丝分裂期细胞常变圆，易脱离生长表面。
2、化学方法：采用化学试剂抑制细胞生长
①饥饿法：控制营养物质；
②秋水仙碱法：阻抑有丝分裂；
③抑制法：采用DNA合成的抑制剂，如5-氨基尿嘧啶氟尿嘧啶脱氧核苷等。
七、悬浮培养细胞生长计量：
1、细胞数目：血球计数板计数，最好先采用果胶酶或铬酸对细胞进行预处理。
2、细胞总体积：离心沉淀
3、细胞的鲜、干重：
4、有丝分裂指数：镜检500个细胞
八、细胞活力的测定：
1、相差显微术：根据细胞中质环流和正常细胞的存在与否鉴定细胞的活力。
2、四唑盐还原法：采用TTC测定细胞的呼吸速率，活细胞被染成红色，可采用分光光度计进行定量检测。
3、二乙酸荧光素法（FDA法）：活细胞在紫外线下呈绿色荧光。
4、伊凡蓝染色法：活细胞不被染色。
九、细胞悬浮培养的应用：
1、突变体的选择：自发变异率高，单细胞系容易诱变且易选择。
2、细胞悬浮培养在人工种子和植物快速繁殖上的应用：易培养、量大。
3、悬浮细胞培养在种质保存当中的应用：占地空间小，保存数量大，易再生。
4、悬浮细胞是遗传转化的良好受体：避免嵌合体的产生。
5、细胞悬浮培养技术在工业上的应用：
①生产次生代谢物质；
②用于生物转化，合成天然化合物。