保健品-清咽功能评价方法.doc

附件9：
清咽功能评价方法

试验项目、试验原则及结果判定
Items, Principles and Result Assessment
1 试验项目
1.1 动物实验
1.1.1 体重
1.1.2 大鼠棉球植入实验
1.1.3 大鼠足趾肿胀实验
1.1.4 小鼠耳肿胀实验
1.2 人体试食试验：咽部症状、体征
2 试验原则
2.1 动物实验和人体试食试验所列指标均为必做项目。
2.2 应对临床症状、体征进行观察。
2.3 在进行人体试食试验时，应对受试样品的食用安全性作进一步的观察。
3 结果判定
3.1 动物实验：大鼠棉球植入实验结果阳性，同时大鼠足趾肿胀实验或小鼠耳肿胀实验结果任意一项阳性，可判定该受试样品清咽功能动物实验结果为阳性。
3.2 人体试食试验：试食组自身比较及试食组与对照组组间比较，咽部症状及体征有明显改善，症状及体征的改善率明显增加，可判定该受试样品具有清咽功能。
清咽功能检验方法
Method for the Assessment of Clear the Throat Function
1 动物实验
1.1 大鼠棉球植入实验
1.1.1 实验原理
采用棉球作为异物植入动物局部皮下，可引起与临床某些炎症后期病理变化相似的肉芽组织增生。比较给予受试样品后，实验组动物与对照组动物肉芽肿重量的差异，以确定受试样品是否具有干预慢性炎症（肉芽肿形成）的作用。
1.1.2实验动物
推荐使用成年雄性大鼠，体重150－220克。每组8－12只。
1.1.3剂量分组及受试样品给予时间
实验设三个剂量组和一个空白对照组，三个剂量组中应包括一个人体推荐量5倍的剂量组，必要时设阳性对照组。受试样品给予时间30天，必要时可延长至45天。
1.1.4 仪器和材料
手术器械、恒温干燥箱、分析天平、注射器、乙醚、碘伏、脱脂棉、脱毛器
1.1.5 实验步骤
1.1.5.1 棉球的处理 将脱脂棉制成约20~25mg紧致的小棉球，经高压灭菌后，置恒温干燥箱60°C干燥3h，取出无菌条件下称重，干燥保存，备用
1.1.5.2 肉芽肿的形成和测定
实验结束前8天，用脱毛器脱去大鼠两侧腹股沟处的毛，乙醚浅麻醉大鼠，碘伏消毒，在无菌条件下切开大鼠两侧腹股沟皮肤，植入备用的棉球，缝合切口，继续给予受试物。实验结束当天，给受试物1小时后，断颈处死大鼠，在原缝合处剪开皮肤，剥离并取出棉球肉芽组织，置于已称重洁净平皿中，恒温干燥箱60°C开盖干燥1小时后称重，计算肉芽肿净量。
肉芽肿净量（mg）＝干燥后棉球肉芽肿重量－原棉球重量
1.1.6 数据处理和结果判定
一般采用方差分析，但需先进行方差齐性检验，方差齐，则计算F值。若F值< F0.05，结论为各组均数间差异无显著性；若F值≥F0.05即P≤0.05），结论为各组均数间差异有显著性，需进一步使用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计分析。对非正态分布或方差不齐的数据需进行适当的变量转换，待满足正态分布或方差齐的要求后，用转换后的数据进行统计分析；若经变量转换仍不能达到正态分布或方差齐的目的，则改用秩和检验进行统计分析。
结果判定：实验组与空白对照组比较，肉芽肿净量明显下降，经统计处理差异有显著性，可判定该受试样品大鼠棉球植入实验结果阳性。
1.1.7 注意事项
1.1.7.1 所用棉球重量及表面积对实验结果影响较大，故在实验中，应尽可能保证所用棉球重量和表面积近似。
1.1.7.2 尽量使手术切口的大小一致，以减少差异。
1.1.7.3 植入棉球后，将切口缝合牢固，以免在实验过程中棉球脱落，影响实验结果。
1.2 大鼠足趾肿胀实验
1.2.1 实验原理
一定量致炎剂注入大鼠后肢足趾皮下，可造成足趾肿胀。测定足趾容积，比较致炎剂作用前后实验组和对照组足趾容积的变化，以确定受试样品是否具有干预急性炎症（足趾肿胀）的作用。
1.2.2 实验动物
同1.1.2。
1.2.3 剂量分组及受试样品给予时间
同1.1.3
1.2.4仪器和材料：
致炎剂（推荐使用葡聚糖4万）、足趾容积测量仪、无菌蒸馏水、0.25ml注射器。
1.2.5 实验步骤
1.2.5.1致炎剂的配制 用无菌蒸馏水配制浓度为1%的葡聚糖4万，备用。
1.2.5.2 足趾肿胀及测定 实验结束当天再给受试样品一次，1小时后，用足趾容积测量仪测量各组大鼠右后足趾的容积，作为0小时足趾容积。然后在大鼠右后足趾皮下注入1％葡聚糖4万0.1mL/只，分别于1、2、4、6小时测量大鼠足趾的容积，同一部位测量3次，取平均值。以不同时间所测足趾容积与致炎剂作用前的足趾容积之差为肿胀值，计算各个时间段的足趾肿胀率。
肿胀率（%）=肿胀值／致炎前足趾容积×100％
1.2.6 数据处理和结果判定
一般采用方差分析，但需先进行方差齐性检验，方差齐，则计算F值。若F值< F0.05，结论为各组均数间差异无显著性；若F值≥F0.05（即P≤0.05），结论为各组均数间差异有显著性，需进一步使用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计分析。对非正态分布或方差不齐的数据需进行适当的变量转换，待满足正态分布或方差齐的要求后，用转换后的数据进行统计分析；若经变量转换仍不能达到正态分布或方差齐的目的，则改用秩和检验进行统计分析。
结果判定：实验组与空白对照组比较，任一时间点刺激前后足趾容积肿胀率明显减少，差异有显著性，可判定该受试样品大鼠足趾肿胀实验结果阳性。
1.2.7 注意事项
1.2.7.1 致炎剂注入的质量对实验结果影响很大，注入致炎剂时，应将动物后肢拉直，从右后足掌心向踝关节方向皮下注射致炎剂，并应尽可能使动物不动。建议由专人负责致炎剂的注射，以保证实验结果的一致性。
1.2.7.2 测量足趾容积时，严格按仪器说明操作。注意应在鼠足某处用记号笔画线作为测量标线，将鼠足缓缓放入测量筒内，当水平面与鼠足上的测量标线重叠时，踏动脚踏开关，记录足趾容积，用吸水纸擦干鼠足上的水后，分别再进行第2次和第3次测定。为避免测量误差，测定人员应事先进行训练，掌握将鼠足放入测量筒内的最佳方式，每个样品的测量最好由专人进行。
1.2.7.3 每次测定的部位要固定。
1.3 小鼠耳肿胀实验
1.3.1 实验原理
二甲苯为无色澄清液体，涂抹于小鼠耳廓后，由于其刺激作用，可引起鼠耳局部毛细血管充血，通透性增加，导致急性炎症。比较实验组和对照组二甲苯作用后耳肿胀率的差异，以确定受试样品是否具有干预急性炎症（小鼠耳肿胀）的作用。
1.3.2 仪器和材料
直径9mm打孔器、致炎剂（二甲苯）、微量加样器、分析天平
1.3.3 实验动物
推荐使用近交系雄性小鼠，体重18－22克，每组10－15只。
1.3.4剂量分组及受试样品给予时间
实验设三个剂量组和一个空白对照组，三个剂量组中应包括一个人体推荐量10倍的剂量组，必要时设阳性对照组。受试样品给予时间30天，必要时可延长至45天。
1.3.5 实验步骤
汲取二甲苯20μl，滴加在小鼠右耳外侧面耳廓的中央，让其自由扩散，30分钟后，将小鼠脱颈椎处死，剪下双耳，用9mm直径打孔器在两耳相同部位打下耳片并称重，以两耳重量之差为耳廓肿胀值，计算耳廓肿胀率。
耳廓肿胀率（%）=耳廓肿胀值／对照耳片重量×100％
1.3.6 数据处理和结果判定
一般采用方差分析，但需先进行方差齐性检验，方差齐，则计算F值。若F值< F0.05，结论为各组均数间差异无显著性；若F值≥F0.05（即P≤0.05），结论为各组均数间差异有显著性，需进一步使用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计分析。对非正态分布或方差不齐的数据需进行适当的变量转换，待满足正态分布或方差齐的要求后，用转换后的数据进行统计分析；若经变量转换仍不能达到正态分布或方差齐的目的，则改用秩和检验进行统计分析。
结果判定：实验组与空白对照组比较，耳廓肿胀率明显减少，差异有显著性，可判定该受试样品小鼠耳肿胀实验结果阳性。
1.3.7 注意事项
1.3.7.1 二甲苯具有对眼及上呼吸道有刺激作用，操作时，操作者应注意自身的防护。
1.3.7.2 打下的耳片应及时称重，以避免水分失去而影响实验结果的准确性。
2 人体试食试验
2.1 受试者纳入标准
2.1.1 体征：慢性咽炎人群，主观症状有咽痛、咽痒、咽干、干咳、异物感、多言加重等。
2.1.2 咽部症状：咽部粘膜水肿、粘膜充血、咽后壁淋巴滤泡增生、分泌物附着。
具有2.1.1及2.1.2中至少一项检查所见的自愿受试者，即可纳入观察。
2.2受试者排除标准
2.2.1 慢性咽炎急性发作期或急性咽炎、声带结节、感冒或吸烟因素所致者。
2.2.2 鼻咽、咽、喉、鼻、喉、食管、颈部及结核、转移性肺癌病变所致者。
2.2.3 年龄在18岁以下或65岁以上者，妊娠和哺乳期妇女及对受试产品过敏者。
2.2.4 合并有心、脑血管、肝、肾、造血系统、支气管和肺等严重疾病及精神病患者和有睡眠疾病的患者。
2.2.5 短期内已服用与受试功能有关的物品，影响到对结果的判断者。
2.2.6 未按规定服用受试样品或中途加服其它药物，无法判断功效或资料不全者。
2.3 试验设计及分组要求
采用自身和组间两种对照设计。按受试者的咽部症状、体征随机分为试食组和对照组，分组时尽可能考虑影响结果的主要因素如病程、年龄、性别等，进行均衡性检验，以保证组间的可比性。每组受试者不少于50例。
2.4 受试样品的剂量和使用方法
试食组按推荐服用方法和服用量每日服用受试产品，对照组可服用安慰剂或采用空白对照，也可使用具有清咽功能的保健食品作为对照。受试样品给予时间15天~30天。试验期间受试者不改变生活、工作环境，不改变原来生活、饮食习惯。
2.5 观察指标
2.5.1 安全性指标
2.5.1.1 一般状况（包括精神、睡眠、饮食、大小便、血压等）
2.5.1.2 血、尿、便常规检查
2.5.1.3 肝、肾功能检查
2.5.1.4 胸透、心电图、腹部B超检查（试验前检查一次）
2.5.2 功效性指标
2.5.2.1 症状观察
准确记录受试者试食前后的咽部主观症状，主要咽部症状包括：咽痛、咽痒、咽干、干咳、异物感多言加重等，按症状轻重计算积分（1度—1分，2度—2分，3度—3分），统计积分变化和症状改善率。
2.5.2.2 体征观察
咽部检查：咽部粘膜充血、粘膜水肿、咽后壁淋巴滤泡增生、分泌物等体征。
按检查结果的轻、中、重分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级，分别记录试食前后体征变化，计算体征积分和改善率。
观察指标功效判定：
有效：症状减轻1度，咽部体征检查结果减轻I级
无效：症状、体征均无明显改变
2.6 数据处理和结果判定：
积分变化可用t检验进行分析。凡自身对照资料可以采用配对t检验，两组均数比较采用成组t检验，后者需进行方差齐性检验，对非正态分布或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态方差齐后，用转换的数据进行t检验；若转换数据仍不能满足正态方差齐要求，改用t’检验或秩和检验；但变异系数太大（如CV>50％）的资料应用秩和检验。
改善率为计数资料，可用X2检验，四格表总例数小于40，或总例数等于或大于40但出现理论数等于或小于1时，应改用确切概率法。
结果判定：试食组自身比较及试食组与对照组组间比较，咽部临床症状、体征积分明显降低，且症状、体征改善率较对照组有明显增加，差异有显著性，可判定该受试样品具有清咽功能。
2.7 注意事项
因咽部症状检查带有较大的主观性，建议由专人负责所有受试者试食前后的检查，尽可能保证判断标准的一致性。

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