软骨细胞中靶向敲除Shp2引起混合性软骨瘤.docx

软骨细胞中靶向性干扰Shp2引起混合性软骨瘤伴多发软骨突起

ABSTRACT
混合性软骨瘤是一种良性骨病，主要见于儿童或青年人的手足部，有两种不同的表现：在骨表面一种软骨覆盖的骨质过度生长称为外生骨疣，骨内部的异位软骨样结节称为内生软骨疣。最近，有报道SHP2基因，一种编码SHP2蛋白酪氨酸磷酸酶的基因，其功能丧失性突变与混合性软骨瘤有关。本研究旨在探究SHP2在出生后软骨发育过程中的作用，这种作用目前还很不了解。我们在小鼠发育过程中的出生后阶段，按软骨细胞特异性手段，利用他莫昔芬诱导系统干扰Shp2。我们发现在第一次诱导后一个月内手足部出现肿瘤样结节。经X光和CT分析发现，SHP2缺乏小鼠在手足和肋部多块骨骼处表现出外生骨疣样和内生软骨疣样表型。组织学评估显示生长板软骨，来自骨骺的一块软骨性突起，缺乏组织结构，并且骨内有异位软骨结节，这与人类中的混合性软骨瘤的病理学特点相符合（即同时有外生骨疣和内生软骨疣）。在分子层面上，我们在SHP2缺乏小鼠的受累软骨结节中观察到Indian Hedgehog蛋白（IHH）及成纤维细胞生长因子2（FGF2）大量表达，而有丝分裂活化蛋白激酶（MAPK）表达受损。总而言之，我们做出了一个混合性软骨瘤的小鼠模型，该模型包括外生骨疣和内生软骨疣的特征。本研究为该病的病理生理研究提供了新的模型，并推进了对混合性软骨瘤的理解。该模型对识别该病病因和病程中的分子机制十分有用，同时也可用于将来开发新的治疗措施。

INTRODUCTION
混合性软骨瘤（MC，OMIM 156250）是一种主要见于儿童和青年人的疾病，患者出现良性骨肿瘤形成肿块，影响骨骼的生长，最常见于手足部。本病为常染色体显性，特点是常累及手足部骨骼（即指骨和掌骨/跖骨）的外生骨疣（即从骨表面出现良性骨质生长），以及长骨干骺端和髂嵴的内生软骨疣（1，2）。经典的多发性外生骨疣就是人们已知的多发性遗传性外生骨疣（MHE，OMIM:133700）（3），它在临床上与混合性软骨瘤是不同的，因为手足受累是混合性软骨瘤的标准，但在经典的多发性外生骨疣中少见（4）。另外，MHE患者不会发生内生软骨疣。但是，混合性软骨瘤与经典多发性外生骨疣疾病机制上的差别目前仍不清楚。最近，人类基因研究利用全基因组测序和连锁分析揭示出SHP2种系失活突变与混合性软骨瘤之间有关系（1，2）。
蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2，即11型蛋白酪氨酸非受体（PTPN11），在某些受体酪氨酸激酶下游的RAS/有丝分裂活化蛋白激酶（MAPK）信号传递中起核心作用，这些受体酪氨酸激酶包括表皮生长因子受体（EGFR）和成纤维细胞生长因子受体（FGFR）（5，6）。一般来说，SHP2促进生长因子受体下游的RAS/MAPK信号转导（6，7）。SHP2广泛表达，特别是在脑部（8），涉及到多种细胞类型的分化和组织的形成（9）。同源SHP2-/-小鼠在孕中期即发生胚胎死亡，这是由多种原肠胚形成和中胚层形成缺陷所致（10）。不过，SHP2在骨骼发育中起的作用大部分还是不清楚的。在我们的前期工作中，我们在出生后小鼠体内的体细胞中除去了Shp2基因，并发现了多种了骨骼异常，包括脊柱侧凸，脊柱后凸，骨骼石化病，以及生长板紊乱伴软骨异常（11）。在这些诱导性SHP2缺乏小鼠中，已知生长板出现紊乱，我们假定这种紊乱对于特异性研究SHP2在出生后软骨发育和重构期软骨细胞中的作用十分重要。
人们已经知道SHP2中的突变是混合性软骨瘤的原因，但与手足部外生骨疣的发生与进展相关的混合性软骨瘤机制仍然不清楚。对混合性软骨瘤机制的深入理解受限于没有太多可研究的患者。为了理解本病的病理生理过程并开发新的治疗方案，迫切需要可用的动物模型。本研究旨在研究SHP2在软骨细胞中的作用。出于此目的，我们做出了诱导性软骨细胞特异性SHP2缺乏小鼠。小鼠出生后阶段软骨细胞中SHP2的丧失造成了混合性软骨瘤的发生。这一小鼠模型对理解本病的机制和那些可能在儿童和成年患者中干预本病的手段很有帮助。

MATERIALS AND METHODS
略过

RESULTS
SHP2 cKO小鼠的产生

SHP2 cKO小鼠的手足部总体形态

SHP2 cKO小鼠手足部的影像学和microCT检测

SHP2 cKO小鼠手部的组织学检测

SHP2 cKO小鼠前肢的外生骨疣样表型和肋骨中的异位软骨

软骨结节中IHH过量表达，MAPK信号传递受损

DISCUSSION
软骨细胞中SHP2诱导丧失时出现的骨骼表型与人类中混合性软骨瘤十分相似。混合性软骨瘤含有两种病理成分：一种是软骨从干骺端向外生长，称为外生骨疣；另一种是长骨内异位软骨结节，称为内生软骨疣。在SHP2 cKO小鼠掌指关节和跖趾关节中，以及桡/尺远端，可以稳定地观察到外生骨疣样骨骼表型，范围从邻近干骺骨的地方到生长板，呈连续性。还可在肋部观察到比手足部更为典型的内生软骨疣样软骨。在混合性软骨瘤患者中，内生软骨疣在放射密度，大小以及位置方面与外生骨疣相比，患者间差异不大，在解剖学位置上这种患者间差异则很大。我们相信我们的SHP2 cKO小鼠模型与患者的混合性软骨瘤是相关的。
混合性软骨瘤似乎是从长骨的骺端发生的（Fig.3C）。在cKO小鼠中，我们在疾病发展的早期阶段，观察到骨膜或软骨膜中异位软骨的初始形成（Fig.4F,I）。cKO小鼠在尺骨和肋骨处也出现了生长板畸形（Fig.5）。因此，我们假定Shp2缺乏会引起两个事件：1.生长板畸形（即正位出现的事件），2.额外的软骨形成（即异位事件）。我们认为后者的出现不一定需要前者，因为在生长板已经完全消失的肢体骨中曾经观察到有早期阶段异位软骨独立出现（Fig.4F,I）。现在尚不清楚这两个事件是否会彼此影响。
本研究中，Cre重组酶受Ⅱ型胶原启动子驱动。因此，SHP2应当是在那些表达Ⅱ型胶原的细胞中（即软骨细胞）特异性删除。但是，我们观察到在本病发生的早期阶段，骨膜和软骨膜中呈X-gal阳性染色（即有Cre活性）（Supplemental Fig.S2）。这些发现产生了一种可能性，即骨膜或软骨膜中缺乏Shp2的软骨细胞祖细胞引起了异位软骨形成，就如同在人类和啮齿类动物的含成软骨性祖细胞的骨膜和软骨膜中所报道的那样。在Cre活性效率方面，值得注意的是软骨结节病变区有X-gal阴性软骨细胞（Supplemental Fig.S2）。与之相比，在结节中IHH和FGF2都大量表达（Fig.6）。目前仍不清楚本病的机制，但我们认为本病的发生与发展既有细胞自主性模式，也有非细胞自主性模式。最近有个有趣的发现，在EXT1条件性敲除小鼠模型中，只需要有6~15%的Cre重组即足以出现异位软骨形成。我们的这些证据与这个有趣的发现相一致，提示有这样一种可能，一小部分软骨细胞中目标基因的失活即足以影响周围的其它软骨细胞从而产生明显的表型变化（19）。另外，若我们只注射一次他莫昔芬时，就会观察到本病的早期阶段，而没有晚期阶段。因此，我们认为多次他莫昔芬注射带来的非细胞自主性机制可能对本病的进展十分重要。
有趣的是，小鼠中混合性软骨瘤表型的发展十分依赖于SHP2删除的时间本研究中，我们在4周龄时诱导Shp2基因破坏（即小鼠未成熟期），并观察到指骨末端在6~8周时出现表型（即手足部），随时间发展到12周。但是，我们在胚胎期或成年期（即8周以后）小鼠中诱导删除SHP2后，并没有观察到这种表型，尽管这些时期Cre活性被诱导。另外，我们在第8周时诱导基因破坏时没有发现IHH和Erk有任何变化，这可能与混合性软骨瘤表型缺失有关系。与此一致的是，在我们之前的研究中曾经在6~8周范围内广泛诱导基因破坏，没有观察到混合性软骨瘤表型（11）。因此，我们相信SHP2可能在软骨中起一种年龄依赖性作用，这可能是因为存在一种或数种年龄依赖性辅因子或代偿机制。这种年龄依赖性现象，与人们已知的混合性软骨瘤是一种出生后儿科疾病而非先天性疾病或成年期疾病相符合。要研究这种有趣的发现尚需更多研究。
已知多发性遗传性外生骨疣（MHE）属于经典的外生骨疣，主要起因是EXT1基因和EXT2基因突变（3，23），这两个基因编码一种糖基转移酶，它对硫酸乙酰肝素的合成是必需的。MHE-外生骨疣通常位于肱骨近侧，桡骨和尺骨远侧，胫骨近侧，以及股骨远侧的干骺区域，而混合性软骨瘤中的外生骨疣位于指骨的干骺区域（即手足部）。MHE-外生骨疣一般情况下被一层发育良好的软骨帽覆盖，伴有内生软骨疣形成，而混合性软骨瘤中的外生骨疣被一层纤维帽覆盖，没有内生软骨疣形成（Fig.4）。另外已经知道有些MHE患者EXT1和EXT2的基因测试是阴性（24），提示涉及了其它未知的分子成为MHE的致病基因。与我们的发现类似，一种成软骨细胞至少是MHE的病因细胞类型之一，因为在小鼠软骨细胞中靶向删除EXT1显示出了MHE表型（19）。混合性软骨瘤和MHE都表现出干骺端的异位骨生长。有一种可能，骨膜中的成软骨细胞参与了初始的软骨形成。作为未来的方向，比较混合性软骨瘤和MHE之间外生骨疣的病理机制将会十分有意思。
混合性软骨瘤在患者中可能是有遗传异质性的（1）。不过，我们仅仅在纯合SHP2 cKO小鼠中观察到类似混合性软骨瘤的表型。有可能体细胞第二次突变引起了人类的混合性软骨瘤，因为已知SHP2是一种重要的肿瘤抑制因子（25）。要在患者身上证明这种设想可能很困难，因为难以取得患者样本。值得注意的是人类SHP2基因的种系突变也可能引起Noonan综合征（OMIM 163950）和LEOPARD综合征（OMIM 151100），这两种综合征都有骨骼成分（6，7，26，27）。不过，在这些疾病中没有发现混合性软骨瘤，提示对于本病的发展，需要SHP2在软骨细胞中的特异性缺失。
本研究的局限在于本病的病因-后果机制在分子水平上仍然不清楚。异位软骨结节中IHH过量表达，这一发现与目前对外生骨疣或内生软骨疣中IHH表达显著增强的理解相一致（18，28）。不过，这可以是肥大前软骨细胞数量增多所致。事实上，使用Col2a1启动子的小鼠中IHH的过表达并没有引起异位软骨（29）。人们认为由FGF启动的FGF受体和MAPK都可以抑制软骨中IHH的表达（20，30）。另外，已经识别出在其它细胞系统中SHP2启动MAPK信号传递（31）。对IHH，FGF和MAPK进行深入研究以识别本病发生和进展的分子机制，这将会提供很多的信息。
总而言之，我们做出了混合性软骨瘤的小鼠模型，方法是靶向破坏软骨细胞中的Shp2基因。在外生骨疣和内生软骨疣的软骨结节中，IHH是大量表达的，而MAPK信号是减少的。这一模型将推动对混合性软骨瘤的理解，并将用于识别分子水平上的病因，并刺激对本病治疗方案的形成。