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色素概述
颜色：人对眼睛视网膜接受到的光信号作出反应，在大脑中产生的某种感觉。
色素：食品中呈现各种颜色的物质。
色素分类：
①来源：天然色素和人工合成色素；动物色素（红血素、虾青素等）、植物色素（叶绿素、胡箩卜素、花青素等）、微生物色素（红曲色素）；
②溶解性：脂溶性和水溶性；
③结构：吡咯类色素（叶绿素、红血素等）、多烯类（类胡箩卜素）、酚类（花青素、儿茶素、花黄素等）、醌酮类（红曲色素、姜黄素、虫胶色素等）、其他。
物质呈色的原理：在可见光中，不同波长的光呈现不同的颜色，这是因为不同的物质能够吸收不同波长的光，如果某种物质吸收的光的波长范围在可见光以外，这种物质就是无色的，如果吸收可见光区的某些波长的光，那这种物质是有颜色的，而它所呈现的颜色就在可
见光中未被吸收的关的颜色，即被吸收关的互补色。

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食品中的天然色素
1 吡咯色素
吡咯色素由四个吡咯环的α-碳原子通过次甲基相连而形成的共轭体系，也就是卟啉环。
中间通过共价键或配位键与金属元素形成配合物，而呈现各种颜色。
①叶绿素：吡咯环中间为镁原子。叶绿素是由叶绿酸与叶绿醇和甲醇形成的二酯。高等植物中有a、b 两种，a:b=3:1。叶绿素对酸敏感，在酸性条件下，叶绿素中的镁原子会被氢原子代替而形成暗绿色或绿褐色的去镁叶绿素，但在碱性溶液中叶绿素会被水解为仍为鲜绿色的叶绿酸盐，且形成的绿色更为稳定，因此在蔬菜技术工中可用石灰水或氢氧化镁处理，以提高溶液的pH，保持蔬菜的鲜绿色。而在适当条件下叶绿素中的Mg还可以被其他元素如：Cu、Fe、Zn 等取代或置换，形成的取代物的颜色仍为鲜绿色，且稳定性大为提高，尤其以叶绿素铜钠的颜色最为鲜亮。
②血红素：血红素吡咯环中是铁原子。肉的颜色是由两种物质血红蛋白和肌红蛋白形成的。血红蛋白是由四分子血红素与一分子由四条肽链组成的球蛋白组成，存在于血液中，而肌红蛋白是由一分子血红素与一分子一条肽链的蛋白质组成，血红蛋白的分子质量为68000，肌红蛋白为17000。当动物屠宰后，由于组织供氧停止，肉中原来处于还原态的紫红色的肌红蛋白受到空气中氧气的作用，形成氧合肌红蛋白和氧合血红蛋白，肉色边的鲜红，当氧合肌红蛋白或氧合血红蛋白继续被氧化形成高铁血红素时，则肉的颜色变成棕黑色。在鲜肉中用亚硝酸盐腌制，能保持肉的鲜红色，是因为处于还原态的亚铁血红素能与NO形成亚硝基肌红蛋白和亚硝基血红蛋白，防止血红素继续被氧化成高铁血红素。
2 多烯色素
多烯色素是以异戊二烯残基为单位的共轭链为基础的一类色素，习惯上又称为类胡箩卜素，属于脂溶性色素，大量存在于植物体中、动物体中和微生物体中。一些类胡箩卜素能在提内转变形成VA，所以又将这些类胡箩卜素称为VA 前体。如β-胡箩卜素。类胡箩卜素分为胡箩卜素和叶黄素两大类，胡箩卜素为共轭多烯，叶黄素为共轭多烯的氧化物。类胡箩卜素的加工稳定性较强。
3 酚类色素
酚类色素是异类水溶性色素，有花青素、花黄素、儿茶素和鞣质四大类。花青素多以糖苷的形式存在于生物体中，其基本结构为2-苯基并吡喃。花黄素主要指类黄酮及其衍生物，其基本结构为2-苯并吡喃酮。
影响花青素呈色的因素有：
（1）pH:花青素分子中的O 为四价，是碱性，而苯基上的酚羟基具有酸性，从而使花青素分子具有两性，在不同pH 介质中呈现不同的颜色，如矢车菊色素：pH<3.0 为阳离子，为红色→pH8.5 为中性分子，呈紫色→pH11 为阴性分子，呈蓝色。
（2）结构：不同花青素之间的区别主要为苯基上的取代不一样，并直接影响花青素的呈色，羟基越多，颜色越深（蓝色），甲氧基越多，颜色越浅（红色）。
（3）金属盐：花青素与金属盐呈灰紫色，因此含有花青素的蔬菜在加工时要尽量避免与金属容器的接触。
（4）二氧化硫：二氧化硫能于花青素形成发生加成反应，使花青素褪色。
（5）在光、热作用下花青素很快变成褐色，在氧或氧化剂的作用下褪色，在糖苷酶的作用下也褪色。
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食用合成色素的测定天然食品及食品原料多数本身具有特有的色泽和香味，人们在长期的生活习惯中也认识了各种食品应有的色泽，食品的色泽已经成为食品的一个重要感官指标。然而，食品在保存及加工过程中，其色泽往往会有不同程度的变化，为了改善食品的色泽，使食品尽可能恢复原来的颜色，除采取一定护色措施外，往往还得添加一定量的食用色素，进行着色。
食用色素就来源可分成两大类：天然色素和合成色素
天然色素的优缺点：
1、优点：
⑴ 其色素是从一些动物、植物组织中提取出来；
⑵ 安全性高；
2、缺点：
⑴ 稳定性差（对光、热、酸、碱等条件敏感）；
⑵ 着色能力差；
⑶ 难以调出任意的色泽；
⑷ 资源短缺，不能满足食品工业的需求；
⑸ 价格昂贵。
合成色素优缺点：
1、优点：
⑴ 资源十分丰富（来自于煤焦油及其副产品）；
⑵ 稳定性好、色泽鲜艳、着色力强、能调出任意颜色；
⑶ 价格低廉；
⑷ 应用广泛；
2、缺点：
⑴ 毒性较大（因为属合成所以毒性大，有的甚至致癌）；
⑵ 食用剂量加以限制。
对合成色素在测定时采用的几大步骤如下：
样品前处理→提纯→分离→鉴别（何种色素）→定量（此色素含量是否超标）
⑴ 前处理方法有：前处理不外乎是将样品打浆或者将着色部分用刀刮下，定容、吸附、解吸等方法处理；
⑵ 提纯的方法
（1） 羊毛染色法：此法应用较广泛，主要是简单，材料容易弄到，操作也方便。缺点为：要在热的酸性条件下吸附色素，用氨溶液解吸色素时，往往色素起变化。当溶液中含量低时（色素含量低），用羊毛染色法吸附色素不完全，回收率低；
（2） 聚酰胺粉法：此法是分离两种以上的色素，是目前比较理想的方法，因为食品中大多数使用拼色。聚酰胺粉在酸性溶液中能与人工合成色素牢固地结合，并能在很稀的溶液中吸附色素，但对天然色素的吸附不紧密，能被甲醇-甲酸洗脱下来；
（3） 离子交换法
（4） 分子筛分离法
⑶ 目前分离方法
（1） 滤纸层析法；（2） 薄层层析法；（3） 柱层析法；（4） 电泳法
⑷ 色素鉴定方法
（1） 采用纸层析法进行定性（与标准样进行对照 Rf）；
（2） 采用薄层层析、比色的方法进行定量。
在食品中添加色素，经常是由两种以上的色素配合而成的拼色，对色素的测定，先处理、提纯，然后把每一种色素要分离开，再对每一种色素的量进行定量。
目前，在食品行业中使用单一色素已经比较少，大多数使用复合色素方可达到比较满意色泽，因而给分析工作者带来一定困难。目前合成色素的测定方法主要有：(1)薄层层析法；(2)高效液相色谱法。
一、薄层层析法（聚酰胺粉法）
1、原理
聚酰胺是具有二极性的化合物，在酸性条件下与水溶性酸性染料结合，而与天然色素、蛋白质、脂肪、淀粉等物质分离，然后再在碱性条件下解吸色素，再在薄层层析法进行分离鉴别，与标准比较定性、定量（纸层析进行定性，薄层层析进行定量）。
2、操作步骤
食品其形态是千变万化的，添加在食品中的色素方式亦是各种各样的，有的拼色加入，有的加在食品的表层几个色素点，有的覆盖一层色素, 有的用色素和鸡蛋，很形象地作成传说中的故事、动物、花卉以及象征丰收、延年益寿、节日愉快、生日快乐等附在食品的最显眼的地方，属于这类食品的有中式糕点、西式糕点，还有饮料、小食品等色素的测定。样品不同，处理方法则就不一样。
⑴ 样品表面色素的测定
如中式、西式、生日蛋糕、节日寿糕一类，首先将代表性的样品整体称重，记录重量，然后分别取下相同着色部分，进行提取和分离，不要将部分着色样品和整个或大部分不着色样品混在一起。如果这样，分离就困难，而且增加分离误差，使结果偏差大，例如一块蛋糕重500g，取下色素部分经测定是50mg，表示500g重的含量即万分之一。
⑵ 样品外皮色素的测定
如儿童食品中的糖豆、朱古力豆、红心果等样品，只需将外表皮色素用少量的水溶下来（在用水溶解之前，先称重量并记录），并定容一定体积（将没有色素的样品弃去），供检验用，其计算与上面一样。
⑶ 非酒精性饮料中色素的测定（各种汽水、桔子汁等）
(1) 吸附
吸50ml样→与烧杯中→在电炉上加热至沸→不断搅拌除CO2→加1g聚酰胺粉（60℃活化1小时）→充分搅拌→使色素完全被聚酰胺粉吸附→用布氏漏斗过滤→用80℃热水20ml洗沉淀物→用甲醇-甲酸（6︰4）20ml再洗沉淀物（除天然色素）→直到滤下来溶液无色→再用80℃热水150ml分次洗沉淀物。
(2) 解吸
在不抽滤条件下，将9︰1乙醇氨液加在沉淀物中使吸附在聚酰胺粉上的色素全部解脱下来，收集于蒸发器中，水浴中浓液到5ml左右，加3滴20%柠檬酸溶液（使色素稳定），定容10ml，供薄层点样用。
(3) 注意事项
样品在加入聚酰胺粉之前，要用20%的柠檬酸调节pH=4（聚酰胺粉末在弱酸性溶液中对色素吸附力强，吸附亦完全）。
如果样品不含天然色素，除CO2后直接加聚酰胺吸附。
⑷ 对各种糖果色素的测定
1) 样品处理
a. 硬糖（不含蛋白质、淀粉）粉碎→称样3g→加50ml水溶解→再加30%柠檬酸3滴调pH=4
b. 软糖（含淀粉高果饴）除外层冰糖屑→切碎→加50ml热水溶解→用20%柠檬酸调pH=4→加淀粉酶1ml（消化淀粉）→90℃水浴15分钟→溶液中出现沉淀物直到变清
c. 奶糖→加9︰1乙醇氨溶液溶解→用1︰10H2SO4调pH→加1%钨酸钠使蛋白质沉淀，奶脂凝集沉淀→布氏漏斗抽滤
2) 吸附色素
1g聚酰胺粉+糖液→70℃水浴→搅拌使之充分吸附→用布氏漏斗抽滤→用80℃水洗漏斗上的沉淀物→再用丙酮洗（除油脂，硬糖不必）→再用80℃水洗沉淀物→洗到pH与原水相同
3) 解吸色素
沉淀物用乙醇氨解吸液全部解吸→收集于蒸发皿中→水浴浓液到4ml→加20%柠檬酸3滴→用水定容10ml→留做点样用（单一色素直接比色，拼色要分离，先定性后定量）
⑸ 肉和肉制品中色素的测定
1) 前处理
称处理样→加海砂3g和20ml丙酮→于研钵中一起研→除去脂肪和水分→除去丙酮
2) 解吸样液中的色素
将上面沉淀物放入布氏漏斗→用解吸液从肉蛋白中使色素全部解吸下来→加热到70℃→用1︰10H2SO4调PH再加1ml10%钨酸钠→使蛋白质全部凝聚沉淀→用布氏漏斗抽滤→用70℃水20ml洗漏斗→收集全部滤液
3) 吸附样液中的色素
称1g聚酰胺粉+上面的滤液→搅拌→抽滤→用水洗漏斗中沉淀物→直到滤水与原水PH相同
4) 解吸样液中色素（与非酒精性饮料相同）
⑹ 果脯类色素的测定
1) 处理
取样研碎后称2g→加50ml水→加热70℃使溶解
2) 吸附
吸附剂1g+上述液→抽滤→用70℃热水洗沉淀物
3) 除天然色素
用甲醇-甲酸（6︰4）混合液解吸天然色素→直到滤液无色为止→再加甲醇10ml进一步除天然色素→70℃热水洗，不断搅拌
4) 解吸
用解吸液解吸样品沉淀物中全部人工合成色素→浓液解吸液（甲醇、氨）直到无甲醇、氨时→用1︰10H2SO4调pH=4→再按上述加吸附剂操作重复1-2次，把天然色素全部去净为止，最后解吸、定容同上。
⑺ 各种加工蔬菜中色素的测定
这一类色素测定按理论应该以蜜饯的操作来处理，但在实验中这些样品胶体过多，使解吸、过滤等操作非常困难，所以我们应该按下述方法进行：取样20g（干菜2g），加入100ml 80%的乙醇溶液，浸泡2小时，再以含有1%氨水的70%乙醇反复浸出，合并浸出液，直到色素全部被洗脱下来，置70-80℃水浴上，将全部浸出液浓缩，待氨全部逸出去（没有氨味），调pH=4，加1g聚酰胺吸附，然后用布氏漏斗过滤，以200ml 70-80℃水洗涤漏斗的聚酰胺粉，然后用甲醇-甲酸洗脱天然色素。以上操作同蜜饯中色素的测定方法。
⑻ 提纯色素溶液的纸层析定性
为了判断样品中存在有几种色素以及是什么色素，必须进行纸层析进行鉴定。
经浓缩后样品色素溶液→于新华中速层析滤纸上点样→点样量3-5微升（若样品含量低可取出1ml在浓缩至0.2ml再点样）→点样点的直径应不超过2毫米为宜→点样线距底边2厘米→样点间距离以及左右纸边各距2厘米→用展开剂展开→测量各色素点的Rf值→于标准色素Rf值对照→确定何种色素（以标准色素斑点Rf值衡量样品各色素斑点的Rf值是否于标准点在同一条直线上，色素的颜色是否完全一致，就可确定样品色素属于何种色素）。
Rf（比移值）=斑点移动距离/溶剂前沿距离
所使用的展开剂有：
1)正丁醇︰无水乙醇︰1%氨水 = 6︰2︰3
2)正丁醇︰吡啶︰1%氨水 = 6︰3︰4
3)异丁醇︰无水乙醇︰水 = 3︰2︰2
⑼ 提纯色素溶液的薄层分离和定量
经过纸层析定性之后，含有一种色素的样液定容之后，离心即可定量；含有两种以上的复合色素的样品溶液，需要经过薄层分离为单色素后，再用比色法分别定量，测定出各种色素的含量。
具体步骤是：薄层板制板→点样层析→比色→标准曲线绘制→计算含量
1) 薄层板制备
聚酰胺粉1g于研钵中→加15ml 75%甲酸→搅拌，使聚酰胺全部溶解→加7.5g硅胶G→研磨1分钟→立即涂板（玻璃板要求光滑平整，先用水洗净，干燥后用酒精擦拭干净，涂板时可用涂本器或手工玻璃涂布）→可涂15×10厘米玻璃板三块（厚度为0.25-0.3毫米）→玻璃板放入盛有少量水的大玻璃缸中→盖好盖子→使玻璃板中的甲酸由缸底的水吸取→放2-3小时→取出玻璃板→于空气中风干→于60-65℃烘箱30分钟→放入干燥器中备用
2) 点样层析
用点样管（毛细管、微量注射器）将浓缩并定容的样液点在薄层板上→基线距底边2厘米→点成与底边平行的条状→两端距边各为2厘米，点样量一般为0.4ml→点样时要用电吹风机边点边吹干→然后进行展层析
展层缸先用溶剂系流30分钟→再把点好样的薄层板放入展析缸用上行法展开→薄板下端浸入溶液0.5-1厘米→大约1小时看色素已明显分开后→即可取出薄板→晾干
对溶剂系流的选择是：a) 分离胭脂红、苋菜红、新红、柠檬黄、桔黄、靛蓝等用正丁醇︰吡啶︰5%氨水=6︰6︰4（这种展开剂主要分离靛蓝，因为靛蓝上升很快，其它上升很慢）；b) 分离柠檬黄、胭脂红、苋菜红、柠檬黄、桔黄等时用展开剂为2.5%柠檬酸钠︰氨水=4︰3（柠檬黄上升很快，其它上升慢）；c) 对于分离两种红色素（苋菜红、胭脂红）的食品用甲醇︰乙二胺︰氨水10︰3︰4（主要是苋菜红与胭脂红上升快，其它色素上升慢）。
3) 比色定量
将薄层板展开后→用小刀分别将各条色斑刮下→移入砂芯漏斗→用乙醇氨溶液解吸抽滤→于水浴上蒸发到无氨味→定容10ml→分别测出消光值E（根据各种色素的最大吸收波长测定其光密度）→从标准曲线上查出相应的各色素含量.
4) 标准曲线的制备
先配成标准色素贮备液（100微克/ml），称0.1g标准色素加水稀释至1000ml
10ml比色管 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
标准应用液 0 0.1 0.5 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0
加水 分别加水至10ml
相当于μg/ml 0 1 5 10 20 30 40 50 60 70
分别测出EO-E9的消光值以水为参比，以色素浓度为横生标，消光值为纵坐标，绘制标准曲线。以水为参比，pH值为6，各色素的最大吸收波长为下：
胭脂红 508纳米；柠檬黄 428纳米；苋菜红 520纳米；
晚霞黄 485纳米；赤藓红 528纳米；靛蓝 610纳米；
注意事项
1） 上述两个公式若乘以1/100，即由mg/㎏变为几/万。例如胭脂红含量为80mg/㎏即0.8/万；2） 聚酰胺粉吸附要求预先活化，并要求在一定的温度、pH和一定的作用时间下进行，操作时要注意。聚酰胺在酸性条件下吸附色素牢固，用水洗涤聚酰胺粉以除去可溶性物质，要求水偏酸性（pH=4），防止聚酰胺上色素在洗涤过程中脱落下来；
3）样品的前处理和提纯过程很重要，要充分去除杂质（油脂、蛋白质、淀粉、糖）以免影响吸附及层析效果。
一般能溶解在水中的物质，如食盐、糖、味精、香精等，在用酸性水洗涤聚酰胺粉时都能除去，还有明胶、果胶也可以通过大量水除去；对油脂类可以用丙酮或石油醚洗涤脱脂，如果油脂含量很高，可在研钵中用丙酮、海砂研磨除去；对于样品中蛋白质、淀粉含量高时，可用蛋白酶或钨酸钠、淀粉酶水解后除去；对于天然色素可用6︰4甲醇-甲酸除去；
4） 纸层析定性时不可皱折，边缘应剪齐，不可有毛边，而且要注意纸的横、竖向，应顺纹上行，展开较好，否则结果不规律；
5） 在浓缩样液时应控制水浴温度70-80℃，应使缓慢蒸发，勿溅出皿外，防止色素干结在蒸发皿的壁上（应经常摇动蒸发皿）；
6） 靛蓝褪色由深兰色→浅兰色→黄色→无色。靛蓝褪色是由于光、氧、温度高、PH等多种因素的影响，测定靛蓝时要注意上述因素的影响；
7） 展开剂使用时最好2天换一次，以保证分离效果，放置时间过长造成浓度和极性都起变化，影响分离效果；
8）漏斗用完后要洗净，先用浓HCl20ml少量多次洗，然后用水多次冲洗，否则影响下一个样品的吸附或解吸作用；
9） 聚酰胺粉可回收使用。使用过的聚酰胺收集于干净的烧杯中，用0.5%NaOH溶液浸泡24小时之后水泵抽干，倒回烧杯，加0.1N HCl泡30分钟，然后再用水泵抽干，用水洗至中性，置60℃烘箱烘干备用；
10） 比色时样液要求清晰，若混浊使E增大，影响结果，如果混浊可离心也可放置。
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