植物酸性转化酶基因及其表达调控.pdf

植物学通报 2005,22(2):129 137Chinese Bulletin of Botany国家自然科学基金资助项目(No.30272919)。通讯作者。Author for correspondence.E-mail:收稿日期：2003-09-15 接受日期：2004-03-10 责任编辑：孙冬花综 述植物酸性转化酶基因及其表达调控1潘秋红 2张大鹏1(中国农业大学食品科学与营养工程学院 北京 100083)2(中国农业大学植物生理生化国家重点实验室 北京 100094)摘要 酸性转化酶是蔗糖代谢的关键酶，在植物体中具有重要的生理作用。近十几年来，许多植物酸性转化酶基因已经克隆，其基因表达调控的研究也取得了很大的进展。本文综述了植物酸性转化酶基因及其蛋白结构、基因表达的器官和发育特异性以及糖、受伤、病原胁迫和激素对基因表达的调节和蛋白抑制因子对酶活性的影响，并讨论了当前在该研究领域存在的问题。关键词 酸性转化酶，基因，表达调节Plant Acid Invertase Gene and Regulation of its Expression1PAN Qiu-Hong 2ZHANG Da-Peng1(College of Food Science and Nutritional Engineering,China Agricultural University,Beijing 100083)2(State Key Laboratory of Plant Physiology and Biochemistry,China Agricultural University,Beijing 100094)Abstract Plant acid invertase is one of critical enzymes in sucrose metabolism and plays animportant role during plant growth and development.In the last decade,acid invertase geneshave been cloned from many plant species,and great progress has been made in studies of theregulation of expression of these genes.This paper summarizes the research in elucidating thestructure of acid invertase genes and proteins,regulation of gene expression by organ anddevelopmental specificity,sugar,wounding,pathogen infection,stress and hormones,and regu-lation of enzyme activity by proteinous inhibitors.Problems in this field are also discussed.Key words Acid invertase，Gene，Expression regulation转化酶可将蔗糖不可逆地裂解形成葡萄糖和果糖。植物酸性转化酶主要有两大类：一类结合于细胞壁上，称之为细胞壁结合的转化酶(cell wall-bound invertase,CWI)，具有较高的 pI(约 910)，另一类存在于液泡中，称之为可溶性酸性转化酶(soluble acid invertase,SAI)，其 pI 约为5.0。目前，包括酸性转化酶的转基因和反义转基因在内的许多研究均表明，酸性转化酶在调节韧皮部糖的卸载、控制贮藏器官中糖的组成、参与植物对逆境胁迫的响应、影响植物早期生长发育以及在信号转导等方面都具有重要的作用，因此人们期望通过改变植物体内胞外转化酶和胞内转化酶13022(2)基因的表达水平，操作碳水化合物的代谢与分配，从而特异地改变植物的生长和发育模式。近年来，植物酸性转化酶基因及其表达调控的研究引起了人们广泛的重视。本文就这几个方面的研究现状进行综述，并为今后的研究作一些探讨。1 植物转化酶基因及其蛋白结构Sturm和Chrispeels(1990)首先从胡萝卜中分离出了细胞壁结合转化酶(CWI)基因，随后在马铃薯拟南芥烟草番茄和葡萄等植物中也分离到编码该酶的全长或部分的核苷酸序列。一般情况下，这些基因都包括7 个外显子和 6 个内含子的结构(图 1)，其中第 2 个外显子仅 9 bp，编码 3 个氨基酸，即DPN(天冬氨酸脯氨酸和天冬酰胺)，是迄今为止在植物界中发现的最小的外显子。该外显子是在所有植物酸性转化酶中都保守的-呋喃果糖苷酶基序(motif)(NDPNG/A)的一部分。当然也有例外，胡萝卜细胞壁转化酶基因和拟南芥可溶性酸性转化酶(SAI)的基因不存在9 bp的外显子(Ramloch-Lorenz et al.,1993;Haouazine-Takvorian,1997)，即此9 bp 的核苷酸序列与对应于图1的第3外显子之间没有内含子区隔。不同来源的酸性转化酶基因的外显子长度及它们之间的间隔区长度都比较相近。由这些酸性转化酶基因推测得到的氨基酸序列都属于一个大的蛋白质家族。成熟蛋白有40%60%同源性，这些蛋白一个共同的特征就是含有一个五肽 NDPNG/A 结构，它是-呋喃果糖苷酶的特征序列，靠近成熟蛋白的N-末端;此外还有一个半胱氨酸(Cys)残基及其邻近的氨基酸(MWECV/P)，靠近C-末端，高度保守，是酸性转化酶催化区域的重要组成部分(Elliott et al.,1993;Sturm,1999;Kimet al.,2000)。其中 Cys被认为是作为一种酸碱催化剂，对蔗糖进行亲核攻击(Geotz andRoitsch,1999)。几乎所有的 CWI 在 C-末端附近的这个保守序列上都有一个脯氨酸(P)，而 SAI 则有一个缬氨酸(V)(Tymowska-Lalanne and Kreis,1998a)。Geotz 和 Roitsch(1999)认为同一种植物中CWI与SAI的活性最适pH和对棉子糖亲和力的差异就是这一氨基酸残基的不同引起的。一般说来，来自于同一品种的纯化的 CWI 活性最适 pH 比 SAI 低0.60.9 (Karuppial et al.,1989;Fahrendorf andBeck,1990;Unger et al.,1994;Tang et al.,1996);在胡萝卜中纯化到的两种SAI对棉子糖的裂解效率比CWI低10%和30%(Unger et al.,1992)。从酸性转化酶的基因推测的氨基酸序列与成熟蛋白相比较，发现N-末端上游有一个长达 100 个氨基酸的序列，很可能组成一个信号肽和一个前肽(Unger et al.,1994)，前肽的功能尚不清楚，但它有些类似于其他预酶前体(preproenzyme)，可能起蛋白折叠、蛋白靶向和控制酶活的作用(TymowskaLalanneand Kreis,1998a)。SAI 前肽比 CWI 要长一些，SAI的另一个特征是有一疏水的C-末端延伸物，它在 SAI的靶识别中可能有着重要作用(Unger et al.,1994)。图 1 植物酸性转化酶基因结构示意图(方框示意外显子的位置和长度，下方数字为外显子编号)Fig.1 Model for the gene structure of plant acid invertase(the box represents the site and size of the exon andthe number under the box represents the name of the exon)1312005潘秋红等:植物酸性转化酶基因及其表达调控2 转化酶基因的表达调控2.1 酸性转化酶基因的表达受器官和发育特异性调节Sturm等(1995)从萝卜中分离到1个编码CWI的基因(cwF)和 2 个编码 SAI 的基因(s、s)，发现它们的表达方式明显不同；cwF基因只在长了初生根的胡萝卜的叶薄层、叶柄和根中表达，其表达量几乎相等，表明了 cw F 基因的表达有发育的特异性，但无器官特异性。s和 s的表达则有器官的特异性，s主要在初生根中，而 s在发育的根尖中。在玉米中应用Inr1和Inr2的特异性探针进行 Northern blot分析，也发现这两个基因的表达有组织和发育的特异性，而且Inr1受糖亏缺的正调节，Inr2受糖丰富的正调节；Inr1 主要在根尖和生殖器官中表达，认为 Inr1 受糖亏缺的正调节，可能是使这些重要的组织在同化物亏缺时具备输入优势，Inr2主要在碳水化合物输入的组织中表达(Xu et al.,1996)。在拟南芥中，对不同发育时期不同的器官中两种CWI基因和两种SAI 基因的表达水平进行分析，同样表明它们的表达具有明显的发育和器官特异性，而且还受到环境因子的调节(Tymowska-Lalanneand Kreis,1998b)。在百合花花芽(Ranwala etal.,1998)，胡萝卜(Lorenz et al.,1995)和番茄(Godt and Roitsch,1997)中也存在花特异性表达的酸性转化酶基因。菜豆种壳转化酶基因的表达有细胞类型的特异性，CWI基因只在前贮藏期的种壳薄壁细胞中表达，这一区域正是光合同化物卸载的部位(Weber et al.,1995)。Elliott 等(1993)发现野生种与栽培种番茄SAI核苷酸序列在一个内含子和调节区存在细小差别，认为可能正是这些差别影响着基因的发育调节，野生种番茄 SAI基因的表达比栽培种番茄要早一些。Anderson 等(2002)报道玉米中Inr2的mRNA在授粉前和授粉后早期发育中，其含量均高于 Incw1 的mRNA，后者只有在授粉后才升高。以上的这些现象表明，植物酸性转化酶的表达有组织、器官和发育的特异性。SAI 基因和 CWI基因已进化成为了一个小基因家族，它们可在植物发育的某个阶段，某个位置独立地表达，从而执行着特定的生理功能。2.2 酸性转化酶基因表达受糖调节糖不仅是重要的能源和结构组分，也是植物生理、代谢、细胞循环、发育及基因表达的重要调节因子，它通过糖感知系统(sugar-sensing system)来调节与糖代谢有关的酶活性和基因表达。植物体内可能存在 3 种不同的糖信号系统：己糖激酶系统、与己糖运输相偶联的信号系统(有己糖载体的参与)和专一化蔗糖途径(可能有蔗糖载体的参与)。在玉米植株中存在有对糖信号不同响应的可溶性酸性转化酶基因，一类是其基因的表达受糖增加诱导(如 Inr1)，另一类是其基因的表达受糖增加的阻遏(如 Inr2)，这两类转化酶基因的表达有组织或器官的特异性(Xu etal.,1996)。糖也调节着玉米细胞壁转化酶基因的表达，Cheng等(1999)利用异养生长的玉米细胞悬浮培养进行研究发现，糖在转录和转录后水平上调节着 Incw1 基因的表达，Incw1 编码两个转录本：Incw1-S(较小)和Incw1-L(较大)，其大小差异主要在于3 非翻译区长度的不同。可代谢糖(如蔗糖和 D-葡萄糖)诱导了 Incw1-S 和 Incw1-L 的转录，并伴随着相应蛋白和酶活性的升高；不可代谢糖(如 3-O-甲基葡萄糖，2-脱氧葡萄糖)也可诱导大量稳态Incw1-L的mRNA的产生，但不会导致该蛋白和酶活性的增加；它也不能诱导 Incw1-S 的转录。因此认为，Incw1 基因对糖的感知和诱导并不依赖于己糖激酶途径，Incw1 基因的 3 非翻译区可能作为碳饥饿时的感应子，联系着植物库的代谢和细胞蛋白的合成。13222(2)植物酸性转化酶基因的表达并不是都受到糖的调节，胡萝卜转化酶基因表达就不受糖(包括葡萄糖、果糖和其他可移动的糖)的调节。红叶藜细胞 SAI基因的表达也不受糖调节，但其CWI基因表达受到糖的促进(Roi-tsch et al.,1995)。为什么在不同植物品种中，酸性转化酶基因对糖的响应存在根本不同，目前仍不清楚，一种可能的解释就是：在像胡萝卜这样贮藏高浓度碳水化合物的植物中，酸性转化酶基因受糖的调节不是主要的，在这些植物中，短期的生理变化只导致糖浓度的细小变化，可能不足以有效地改变基因的表达，因此这种机制没有形成或在进化中丢失了(Sturm,1999)。此外果糖和葡萄糖作为信号分子，还可能诱导了酸性转化酶翻译后的抑制性调节，王永章和张大鹏(2001)研究认为，己糖对苹果果实酸性转化酶这种抑制机制不同于化学反应平衡系统中的产物抑制，而可能是诱导了有关抑制基因的表达或对酸性转化酶结构的某种修饰，其真实的原因尚待进一步的探讨。2.3 酸性转化酶基因的表达受到伤害病原侵染和干旱等胁迫的调节研究表明，受伤可诱导酸性转化酶基因的表达，如甘薯块茎的切片中，SAI 活性明显增加，在处理后 18 小时达到最大值，之后迅速下降(Matsushita and Uritani,1974)。当胡萝卜主根受到机械损伤时，CWI基因表达明显增强，受伤后 12 小时，稳态 mRNA达到最大值，同时酶活性也相应升高，且基因的表达不是系统的，仅局限于受伤部位(Sturm and Chrispeels,1990)。进一步分析发现，在胡萝卜CWI基因启动子区域存在一段序列与那些受到损伤或病原侵染诱导的植物基因的顺式作用元件高度同源(Ramloch-Lorenz et al.,1993)。Zhang 等(1996，1997)在豌豆中也有类似的发现。病原侵染与植物酸性转化酶活性升高的密切关系已有许多的报道，植物对病原侵染的响应是快速而短暂的，在胡萝卜主根中，细菌Erwinia carotovora侵染后1小时，CWI的稳态mRNA水平达到了最大值，之后迅速下降(Sturm and Chrispeels,1990)。受病原菌诱导的基因的表达也不是系统的，仅局限于侵染的部位(Benhamou et al.,1991)。Bussis 等(1997)研究表明，表达酵母转化酶的转基因马铃薯叶片光合效率明显下降，但抗水分胁迫的能力却增强。干旱可导致玉米成熟叶片中SAI活性提高，但CWI活性不受影响，而且 SAI活性的提高仅是其中一个SAI基因(Inr2)表达增强的结果(Pelleschiet al.,1999)。另一方面，干旱也可能导致Inr2 表达受到抑制，Anderson 等(2002)认为干旱抑制Inr2基因的表达可能是导致玉米子房早期败育的原因。低温胁迫可引起马铃薯叶和茎中转化酶基因在转录后加工中剪切位点发生改变，而导致第二外显子(即最小的外显子，9 bp)被剪除(Bournay et al.,1996)。2.4 酸性转化酶的活性受激素的调节在一些植物或器官中，生长素(Morrisand Arthur,1984)赤霉素(Wu et al.,1993)细胞分裂素(Ehness and Roitsch,1997;Asthiret al.,1998)和脱落酸(Palejwala et al.,1989;Tsay and Wu,1990;Asthir et al.,1998)都促进酸性转化酶活性的提高。但这些激素是直接调节酸性转化酶基因的表达，还是通过刺激细胞增生而为蔗糖创造一个新的库，目前尚不清楚。在红叶藜(Chenopodium rubrum)培养细胞中，激动素可诱导CWI的mRNA的增加，同时葡萄糖载体的mRNA也增加(Ehnessand Roitsch,1997)。我们的研究表明，脱落酸可以显著地激活发育中、后期的苹果果实和发育各个时期的葡萄果实的 SAI 和 CWI，且激活作用具有温育时间、脱落酸剂量、介质pH和活体组织的依赖性；但酶数量的定量和定性分析显示了脱落酸对苹果果实酸性转1332005潘秋红等:植物酸性转化酶基因及其表达调控化酶的激活与酶数量无关，是一种翻译后的调节机制，而对葡萄果实酸性转化酶的调节却 是 通 过 增 加 其 基 因 的 表 达 量 来 实 现 的。3 酸性转化酶活性的调节3.1 酸性转化酶活性受反应产物的调节在高等植物中，通常葡萄糖和果糖对转化酶都有抑制作用。一般葡萄糖的抑制为竞争性的(Zrenner et al.,1995)，而果糖的抑制有两种类型：一种为典型的竞争性抑制(线性)，如蓖麻、大麦和金莲花(Isla et al.,1998)等植物的转化酶；另一种为复杂的竞争性抑制，如马铃薯块茎(Isla et al.,1991)、稻(Islaet al.,1995)、番木瓜(Lopez et al.,1988)和甘蔗叶鞘(Sampietro et al.,1980)等的转化酶。Isla等(1998)认为果糖对转化酶抑制的动力学差异可能是结构上的差异，而非活性部位化学基团的差异。当然不同植物转化酶受产物抑制程度有所不同，如大麦受抑制的程度明显小于黑麦。此外，有报道指出在绣球花中，果糖为转化酶的非竞争性抑制剂。3.2 酸性转化酶活性受内源蛋白抑制因子的调节内源蛋白抑制因子的调节是植物酸性转化酶翻译后调节的一个重要方面，受到很大关注。蛋白抑制因子(proteinous inhibitor,INH)存在于植物发育的特定阶段，它在植物中并非广泛存在，其作用似乎只限于酸性转化酶(Bracho and Whitaker,1990)。Schwimmer等(1961)首次报道了在马铃薯块茎中存在内源蛋白抑制因子。接着 Pressey 等(1966,1967)将其纯化并分析了部分特性，发现INH在-巯基乙醇和半胱氨酸存在下会变性，表明二硫桥对其执行抑制活性是必需的。Weil 等(1994)从烟草悬浮培养的细胞中纯化CWI时，发现纯化的蛋白有很强的免疫信号，但转化酶活性却很低。后来将该溶液经过 ConA-Sepharose 亲和层析，分离出一条 17 kD 多肽之后，CWI 活性显著升高。表明了在梯度洗脱过程中，P17 与 CWI 共纯化，也说明P17是一种非糖蛋白，可用ConA-Sepharose 层析将 P17 与 CWI 分开。进一步测得 CWI 的 pI 9.5、p17 的 pI 6.2，认为它们以强的离子键相结合，在一定程度上，可抵御热和SDS处理。当部分纯化的P17加到完整的烟草悬浮培养的细胞中时，发现有抑制效应发生，说明INH可在细胞壁上自由移动到达 CWI，并与之结合(Sander et al.,1996)。pH、蔗糖浓度和二价金属离子可影响INH 与 CWI 的结合，INH CWI 复合物是酸性稳定型的，最高抑制作用在 pH 4.5，当pH 6.5以上时，INH对CWI的抑制消失。蔗糖可保护 CWI 免于与 INH 结合(Anderson etal.,1980;Sander et al.,1996)，但蔗糖的保护作用是有饱和性的。当蔗糖浓度达到 3mmol.L-1时，只减少 P17 最大抑制的 70%，浓度继续增大并不能提高保护效应。在 P17存在时，转化酶对蔗糖的Km为1.2 mmol.L-1，而在P17不存在时，Km为0.8 mmol.L-1，两者相近，因而推测只有“空闲”的酶才会受 INH 的攻击。2 mmol.L-1的 Ca2+、Mg2+或Zn2+可明显地减轻P17对CWI的抑制作用(Weil et al.,1994)。从 Western blot 分析，INH 不能降解CWI，也不是 CWI 的降解产物，它与 CWI共表达。INH是否也与SAI共定位？Pressey(1994)发现烟草CWI的INH与番茄SAI的INH的 N-末端序列很相似，但抑制机制明显不同，INH对SAI的抑制作用常是很迅速的(1 分钟)，且没有底物保护作用；而烟草中CWI与INH结合在3060分钟之后，有底物保护效应。在活体中，番茄 SAI 的 pI 5.5，带少量电荷，而烟草 CWI 的 pI 9.5，带强正 潘秋红(2003)果实酸性转化酶的研究.博士论文,中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京13422(2)电荷；亲和力也不同，CWI 对蔗糖为 0.8mmol.L-1，SAI 对蔗糖为 9.5 mmol.L-1，故没有充分证据表明SAI与INH共定位，可能SAI与INH的结合是体外人为造成的。Isla等(1992)制备了马铃薯块茎的亚细胞组分，发现INH只存在于部分消化的细胞壁中。Sander等(1996)进一步证实，蔗糖只保护CWI免受INH 的抑制，而对 SAI 不起作用。所以，大多数人认为，内源 INH 只存在于细胞壁中。有人用纯化的 P17 制备多克隆抗体，进行免疫组织化学分析，发现 P17 不仅存在于质外空间，也存在于高尔基体和内质网上。这种与CWI共定位的INH的存在有何生理意义？目前尚不明确。Krausgrill 等(1996,1998)认为，P17 是 CWI 的调节性开关，当碳源有限时，CWI的活性被 P17 所掩盖，避免了蔗糖的质外体水解，蔗糖被完整组织吸收而进入胞质，由胞质中的蔗糖合成酶水解，产生的UDPG用于生物合成，产生的果糖用于呼吸作用；只有当蔗糖过量时，CWI才活化，催化蔗糖不可逆水解形成己糖，进入细胞用于贮存。此外，P17 只结合于“空闲”的CWI，P17有类似分子伴侣的功能，保护“空闲”的CWI免遭降解。Greiner等(1998)从烟草悬浮培养的细胞中分离到了这种 P17部分序列的 cDNA克隆，分别与拟南芥和柑橘中已表达序列的标记克隆相比较，发现与该基因相关的蛋白也存在于其他植物中；该基因编码的蛋白可抑制烟草、红叶藜的CWI和番茄果实的 SAI，但对酵母转化酶不起作用，且只有在同源的系统(烟草)中，才有底物保护效应。在烟草的不同部位发育过程中，Northern blot 分析表明，这两种蛋白的表达并不是一直都是同步的。现在，表达正向INH和反向INH的mRNA的转基因烟草已经产生(Sander et al.,1996)，将用于研究，以进一步阐明 INH 的生理意义。4 展望转化酶是蔗糖代谢的关键酶，参与蔗糖的分解，在植物体内具有重要的生理作用。近十几年来，植物转化酶基因的克隆、基因及其蛋白的结构和基因的表达调控的研究有了长足的进展。然而有一些根本的问题尚未解决，例如编码DNP三肽的内含子的进化和调节意义是什么？在什么情况下蔗糖水解产物可以调节转化酶基因的表达和酶活性？糖诱导酸性转化酶基因表达的分子机制是什么？糖信号如何传递？是否涉及蛋白磷酸化/去磷酸化？是否还有其他的代谢物或效应分子参与了基因的表达调节？基因活性对受伤和病原侵染响应的生理意义是什么？已知基因的顺式元件/反式作用因子是否参与了胁迫信号转导？激素对酸性转化酶活性调节的分子机制是什么？转化酶蛋白抑制因子的作用是什么？等等，这些问题还有待进行深入的研究。参 考 文 献王永章,张大鹏(2002)葡萄糖和果糖诱导了苹果果实酸性转化酶翻译后的抑制性调节.中国科学(C辑),45:309-321Anderson MN,Asch F,Wu Y,Jensen CR,Naested H,Mogensen VO,Koch KE(2002)Soluble invertaseexpression is an early target of drought stress dur-ing the 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