tricine胶注意事项和要点.doc

对于小分子量的蛋白：可以考虑一下Tricine-SDS-PAGE，即用三羟甲基甘氨酸（tricine）代替甘氨酸作为终止离子。Tricine-SDS-PAGE可以有效地分离1-100 kDa的蛋白样品：下面推荐两个Tricine-SDS-PAGE电泳的protocol，供参考。推荐I首先是Nature Protocol上的一篇专门介绍Tricine-SDS-PAGE的文章，作者是该领域的专家Schgger。Nature Protocols 1, - 16 - 22 (2006) Published online: 12 May 2006 | Corrected online: 10 August 2006 | doi:10.1038/nprot.2006.4Tricine-SDS-PAGE要与小蛋白打很多交道的同志们可以仔细研读一下这篇文章，总结整理出适合你的具体方案。推荐II只是想看看Tricine胶的分离效果，偶尔一试，可以参考下面这个具体的protocol。Tricine胶的配方阴极、阳极缓冲液的配方介绍：常规的Tris-SDS-PAGE电泳的只能分辨大分子物质的，而对了相对分子量小的，尤其是10kD以下的蛋白分辨率极低。本人用Tris-SDS-PAGE做一个20KD以下的蛋白结果不是很理想，而且重现性差，因为在这种不连续的缓冲系统中，低分子量的常常堆积在浓缩胶中。而Tricine-SDS-PAGE 可以很好的分离30KD以下的蛋白，而且本人还发现它同样对大蛋白也适用，我用它做过45KD，90KD，120KD左右的蛋白，而且每次上样3uL的Marker跑出来的10条带清清楚楚，几乎是平行的跑下来，常规的Tris-SDS-PAGE加了10uL的效果也没它好，有时越大下面越不清楚，也越窄。如果，有战友做小蛋白的话不妨试试看，下面是实验配方和步骤。一、缓冲液的配置：1.正极缓冲液anode buffer（2X）：0.1M Tris(pH 8.9):12.114g加H20定容至500ml, 4保存。2.负极缓冲液 cathode buffer (1X):0.1M Tris +0.1M Tricine+0.1%SDS 不用调pH：6.057gTris+8.96gTricine+0.5g SDS 加H20定容至500ml, 4保存。3. 凝胶缓冲液 gel buffer(G-B, 3X):36.342gTris+0.3gSDS加H20定容至100ml H20,HCL调pH=8.45,过滤4保存。4. AB-3 储存液(49.5%T,3%Cmixture):24g丙烯酰胺+0.75g甲叉双丙烯酰胺 加H20定容至50ml,过滤4保存。 5AB-6储存液(49.5%T,6%Cmixture):23.25g丙烯酰胺+1.5g甲叉双丙烯酰胺 加H20定容至50ml,过滤4保存。二、具体的步骤：1.按如下配方制备分离胶和积层胶： 4 % 积层胶(3ml) 10%分离胶(8ml)AB-3(mL) 0.25 - AB-6(mL) - 1.6 3gel buffer(mL) 0.75 2.67 甘油(mL) - 0.63 H20(mL) 2 3.1 10% APS(uL) 22.5 40 TEMED(uL) 2.25 4 先注入分离胶，待分离胶凝固后（0.5-1小时），注入积层胶。待积层胶凝固后（0.5-1小时）。2. 上样电泳:总蛋白取25uL,细胞组分蛋白根据BCA定量后取75ug,加入6SDS上样缓冲液煮沸5 分钟，12000rpm离心2分钟，取上清进行蛋白电泳。准备电泳时，在电泳槽底部加入正极缓冲液，将制好的胶连同其装置放入电泳槽内，在两块胶之间注入负极缓冲液，用30V的电压预电泳10分钟，然后上样。当染料从积层胶进入分离胶后，电压加到90V,继续电泳直到溴酚蓝抵达分离胶底部，断开电源停止电泳。整个电泳过程在冰上或4进行。3 转膜和抗体孵育1）电泳近结束时，将裁好的与凝胶尺寸相当的PVDF膜先用甲醇浸透活化后，用去离子水漂洗，然后浸泡在转移缓冲液中。另外，裁剪六张尺寸一致的滤纸连同海绵垫一起置于转移缓冲液中浸泡。2）电泳结束后，小心取出凝胶，浸泡于转移缓冲液中，在转移缓冲液中安装转移装置，从负极到正极按如下顺序装置：海绵垫、三层滤纸、凝胶、PVDF膜、三层滤纸、海绵垫。注意清除各层之间的气泡。转移装置放在搅拌器上并冰浴。连接好电源后，调整电压100V，湿转1-1.5小时。3）转膜结束后，用TBST缓冲液漂洗PVDF膜2次，每次5分钟，之后加入20mL封闭液完全浸泡膜，室温平摇2小时。4）根据预染Marker显示的分子量，在相应的范围内，将含有目的蛋白的区域剪下，放入预先准备好的含一抗的封闭液中，用塑料袋封好，4缓慢侧摇过夜。5）取出PVDF膜浸入TBST缓冲液，平摇洗膜三次，每次10分钟。6）在封闭液中按1：1000020000比例加入辣根过氧化物酶标记的二抗，将膜置于其中，室温侧摇0.5-1小时。7）取出PVDF膜浸入TBST缓冲液，平摇洗膜四次，每次10分钟。4.化学发光显色：1）在暗室中，取等量的Stable Peroxide Solution和Luminiol/Enhancer Solution混匀后，将PVDF膜浸泡其中，轻轻晃动，直至可以看到荧光，一般35分钟。2）将膜取出，用滤纸吸干多余的液体，放入塑料保护膜中。3）将封好的膜放入暗盒中，加入X光片，根据荧光的强弱，曝光5秒1分钟不等。4）取出X光片，放入显影液中，直至条带出现，这时可以根据条带的效果，再次调整曝光的时间。5）将显影后的X光片用自来水清洗后，放入定影液中定影510分钟，再用自来水后晾干、拍照。tricine sds page电泳原理： 电泳是电泳涂料在阴阳两极，施加于电压作用下，带电荷之涂料离子移动到阴极， 并与阴极表面所产生之碱性作用形成不溶解物，沉积于工件表面。 它包括四个过程： 1 ）电解（分解） 在阴极反应最初为电解反应，生成氢气及氢氧根离子 OH ，此反应造成阴极面形成 一高碱性边界层，当阳离子与氢氧根作用成为不溶于水的物质，涂膜沉积，方程式 为： H2OOH+H 2 ）电泳动（泳动、迁移） 阳离子树脂及 H+ 在电场作用下，向阴极移动，而阴离子向阳极移动过程。 3 ）电沉积（析出） 在被涂工件表面，阳离子树脂与阴极表面碱性作用，中和而析出不沉积物，沉 积于被涂工件上。 4 ）电渗（脱水） 涂料固体与工件表面上的涂膜为半透明性的，具有多数毛细孔，水被从阴极涂 膜中排渗出来，在电场作用下，引起涂膜脱水，而涂膜则吸附于工件表面，而 完成整个电泳过程。 电泳表面处理工艺的特点： 电泳漆膜具有涂层丰满、均匀、平整、光滑的优点，电泳漆膜的硬度、附着力、 耐腐、冲击性能、渗透性能明显优于其它涂装工艺。 TricineSDS-PAGE实用方案Tricine-SDS-PAGE是用于分离分子量在1-10kD的肽类用的。一、 试剂配配制：1 Low Bis acrylamide（49.5% T, 3% C）Acylamide 48.0gBis 1.5gWater make up to 100ml2. High Bis acrylamide (49.5% T, 6% C)Acrylamide 46.5gBis 3.0gWater make up to100ml3. Gel Buffer (3M Tris/cl, PH8.45, 0.3% SDS)SDS 0.3gTris 36.4gWater make up to 100mlPH to 8.45 with HCL注: 3M Tris 配制时不容易溶解,因此配制时我配制了2M Tris,配方如下:Tris 36.4gSDS 0.3gWater make up to 150ml4. Anode (Lower) buffer 阳极缓冲液 (0.2M Tris/cl, PH8.9)Tris 12.11gWater make up to 500mlPH to 8.9 with HCL5. Cathode (Upper) buffer 阴极缓冲液 (0.1M Tris/cl, 0.1M Tricine, 0.1% SDS, PH 8.25)Tris 6.06gTricine 8.96gSDS 0.5gWater make up to 500ml注:不用调PH值6. 4Tricine SDS Sample buffer 4上样缓冲液(Final concentration: 0.05M Tris/cl, 4% SDS, 12% glycerol, 200mM DTT, 0.01% Commasie G 250)8Tris.cl/SDS PH 6.8 2mlGlycerol 4.8mlSDS 1.6gCommasie Blue G 250 4mgWater make up to 10ml注:8Tris.cl/SDS PH 6.8配方Tris 6.05gSDS 0.4gWater make up to 100mlPH to 6.8 with HCL二、 胶的配制1. 16.5% T 6% C separating gel 30ml49.5% T 6% C 10mlGel buffer 15mlGlycerol 3.2mlWater 1.8ml2. 10% T 3% C spacer gel 30ml49.5% T 3% C 6.1mlGel buffer 15mlWater 8.9ml3. 4% T 3% C stacking gel 12.5ml49.5% T 3% C 1mlGel buffer 4.65mlWater 6.85ml注: 用Bio-Rad系统, 0.75mm的胶,separating gel 配3ml, 加2.5ml; Spacer gel 配1ml,加0.7ml; Stacking gel 配1.25ml. 灌胶前临时加10%AP（过硫酸铵）和TEMED.胶配制的通用配方: 三、电泳参数及染色脱色1. 用Bio-Rad mini 电泳装置进行电泳. 30V 电泳1hr, 100V至电泳结束2. 固定, 染色及脱色: 小分子量肽类在SDS-PAGE胶中容易扩散,因此电泳结束后, 有时需要固定20min (固定液: 0.5% 戊二醛, 30% 乙醇), 再进行染色20-30min (染色液: 50% 甲醇, 10% 乙醇, 0.2% G-250), 在脱色液 (45% 甲醇, 10% 冰醋酸)脱色20-30min; 脱色完毕,把胶放在水中或10%甘油中.四、电泳示例照片Tricine-SDS-PAGE电泳分析小分子多肽、摘要：研究旨在解决常规SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)对一些小分子多肽进行电泳分析过程中极易扩散丢失，常无着色带显示等问题。实验采用不同类型胶来电泳分析低分子量多肽，比较Tficine-SDS-PAGE电泳分析小分子多肽时的聚丙烯酰胺浓度和交联度，为小分子多肽的分析与鉴定提供快速准确的条件。关键词：Tricine-SDS-PAGE；小分子多肽；蛋白质常规Tris甘氨酸SDS-PAGE电泳分析分辨大分子物质的相对分子质量范围在10200 kDa，对于相对分子质量小于10 kDa的多肽分辨率低u J。Swank 等在含有SDS的凝胶中加人8 molLI1的脲，但分离效果不甚理想，且重现性较差。Lanzillo等发现在 Laemmli系统和仅在样品和电极缓冲液中有SDS的不连续缓冲系统中，低分子量多肽常常堆积在浓缩胶中【2l，之后Scba r等【3又进行了系统地研究和探索，能够分离较大相对分子质量范围内的蛋白质。随着生物技术的飞速发展和基因工程药物的大量涌现，具有高生物活性的小分子多肽的分离、纯化和鉴定技术极为重要。本文报道采用TrisTricine缓冲体系，对SDS-PAGE方法的各个环节进行了改进，在较低的丙烯酰胺浓度下取得了较理想的结果。 1 材料和方法1 试剂和仪器SDS为华美生物工程公司产品；丙烯酰胺(分析纯)为上海绿鸟科技发展有限公司产品；NN甲叉双丙烯酰胺(分析纯)为Fluka公司产品；Tris为 PI咖e 公司产品；Tricine、TEMED、过硫酸铵均为上海生工AMRKSCO分装产品；脲(分析纯)为无锡市民丰试剂厂产品；肽分子量标准的分子量范围1 060 26 6OO为美国Sigma公司产品。EPS604稳压稳流电泳仪(南京科宝仪器研究所)；小型垂直电泳附件模具为北京六一仪器厂生产。 12 方法 121 电泳贮存液的配制见表1和表2。