毛细管电泳在手性化合物分离中的应用.pdf

第16卷第4期 分 析 科 学 学 报2000年8月Vol.16No.4JOURNAL OF ANAL YT ICAL SC IENCEA ug.2000文章编号:100626144(2000)0420328211毛细管电泳在手性化合物分离中的应用林金明保母敏行(东京都立大学工学部应用化学科,日本东京都八王子市)摘要:本文综述了近年来毛细管电泳在手性化合物分离中的应用情况。简要地总结和比较了手性配位体金属络合物、环糊精及其衍生物、开环多糖化合物、冠醚、大环化合物等5种典型的手性分子识别剂在毛细管电泳手性分离中的使用现状。关键词:毛细管电泳;手性分离;手性识别剂;综述中图分类号:O657.8文献标识码:A1手性化合物的重要性手性化合物,顾名思义就是其化合物的结构具有左右手对称的性质。它们的化学、物理性质非常相似,用一般的方法难以得到分离。可是手性化合物的生理和药理活性因其左右旋的不同而差异显著。如人体必需的氨基酸,只有L(S)体氨基酸才能被吸收。近几十年来,手性化合物的药害事故屡见报道,医药品中比较有名的药害是酞咪哆啶酮(Thalidom ide),1957年由联邦德国格吕南特尔(Grunenthal)化学公司首先生产,作为镇静剂应用于临床,此后的几年中,发现许多服用这种药物的早期孕妇,其婴儿有严重的畸形现象,1961年被禁止使用。为了研究该药物左右旋体对妊娠的影响,1979年Blashke等人1把左右旋体分离后,分别投喂妊娠中的小白免,发现(S)异构体具有强烈的致畸作用。这一研究,进一步唤醒了人们对异构体化合物的重视。从化合物的分类来说,手性化合物是由2种分子量相同、分子构造相似而生理活性相异的混合物组成的,如果左右旋成分相同的话,则其中必然含有50%的不纯物。这种说法在医学上越来越得到肯定。但到目前为止,不管是天然药物还是合成医药品,手性异构体的提纯或合成都相当复杂和困难,导致此类药品价格昂贵,药品的许多副作用同时也来自不纯的手性异构体,所以从医药学的应用现状来看,低价、简便的制备和检测法的开发成为医药界迫切需要的任务。手性化合物的制备,大体分为生物法和化学法。生物法可以说是一种酶催化反应。所使用的酶有水解酶、脱氢酶、氧化还原酶、转化酶、手性体化酶和合成酶等等。酶反应的特异性和反应基质的立体特异性使得酶反应法在工业上得到广泛应用。化学法则分得比较细,如手性合成、结晶法、包接化合物的手性分子识别法和色谱分离法等等,有兴趣的读者可以参考日文专著2或英文专著3。相应于手性异构体的制备,手性化合物检测方法的研究成为这一领域不可缺少的部分。一般情况下,有分离检测和非分离检测,如旋光、核磁共收稿日期:200022229通讯联系人:林金明823振、热分析等属于非分离检测法;而目前常用的气相色谱(GC)、液相色谱(LC)和毛细管电泳(CE)等则属于分离检测法。笔者所在的研究室,从20世纪80年代初的GC4-6,90年代前期的LC7-10,到近年来利用CE11-21,一直致力于手性异构体分离法的研究和开发,先后合成和研制了多种GC、LC固定相,提出了分子烙印高分子填充毛细管电色谱分离手性化合物的新方法11-16,深化和拓宽了手性配位体交换2胶束电动毛细管电色谱的研究和应用17-21。CE的简便、高效、试样用量少和几乎没有废液的特点,在药物、临床医学中得到广泛的研究和应用。以关键词Chiralor Enantiomer与Capillary Electrophoresisor Capillary Electrochromatography组合,对美国化学文摘进行检索,仅从1995年到2000年1月7日止,不到5年的时间内就有各种报道682篇,并且这种发展趋势在今后的几年内将有增无减。本文从篇幅的角度考虑,按CE手性化合物分的分子识别剂主要种类对近几年发表的研究报道进行综述与评论。一些更为详细的综述可以参考与这方面有关的专著22,23和相应的综述文章24-26。2手性化合物分离的CE模式按分析对象在溶液中的存在形态,大体可分为两类,试样为带电荷的化合物时,往往采用毛细管区带电泳(CZE);而对不带电荷的中性化合物一般考虑采用胶束电动毛细管电色谱法(M EKC)。CZE最基本的原理是建立在试样的分子量以及它们所带的电荷数之间的差异,使得各自的电泳移动速度不同而达到分离的一种比较简单的分离方法。但是,镜像异构体具有相同的分子量和电荷数,它们的电泳迁移率也相同,采用一般的电泳液无法实现分离目的,有必要在电泳液中添加具有光学活性分子识别试剂,如光学活性金属配位络合物、环糊精(CD)、可溶性冠醚等,能与镜像异构体形成不同稳定性的配合体,从而达到手性分离的目的。M EKC与CZE的不同点在于它所使用的电泳液中含有离子型表面活性剂,表面活性剂的浓度高于其临界浓度时形成胶束,胶束中心的疏水部分可以被视为准固定相,带电或中性样品在水相和准固定相中分配系数间的差异成为这一分离的基本条件,手性异构体分离过程中,往往利用一些具有光学活性的胶束,如环糊精修饰M EKC(CD2M EKC)、微乳化剂(M icroemulsion)EKC(M E2EKCM),蛋白质的亲合作用和一些在水溶液中能离子化的CD衍生物(CD2EKC)等等。除了以上两种模式外,有时为了提高多种混合物的分离效果,需要降低或消除电渗流(EOF),可以采用毛细管凝胶电泳(CGE),CGE是根据凝胶的分子筛作用而使得某些分子量不同的混合物得以分离。一般情况下,填满凝胶的毛细管柱与空心毛细管不同点在于电泳过程中不存在电渗流的影响,从而提高分离能力。采用凝胶填充柱还可使一些具有光学异构体识别能力的分子识别剂,如CD、蛋白质等得以固定化,从而达到光学异构体分离的目的。另一方面,由于CGE过程中不存在电渗流现象,只能应用于离子性化合物的分离,从而大大限制了CGE的应用范围。Guttman等人27在凝胶中添加CD,使得12种丹酰化氨基酸光学异构体得到良好的分离,其中,采用 2CD时分离的效果最好,Cruzado28以及Birnbaum等人29把CD固定化于凝胶上,也使得氨基酸衍生物得到良好的分离。一些比较特殊的CE手性分离方法,如毛细管填充电色谱(CEC)、非水分离等可参考923第4期林金明等:毛细管电泳在手性化合物分离中的应用第16卷Chankvetadze26的综述。3CE手性化合物分离实例3.1金属络合物配位体交换分子识别利用CE进行手性化合物分离分析的第一例就是建立在金属络合物配位体交换原理基础上。在电泳液中加入铜()2L2组氨酸络合物,有效地分离了多种丹酰化氨基酸手性化合物30。在pH 78条件下,带有正电荷的氨基酸2铜()2L2组氨酸三元络合物同时受到向阴极方向移动的电渗流和电泳动力两因素的作用:移动速度快于游离的氨基 酸分子,所以,与铜()2L2组氨酸络合物结合得越牢固的氨基酸,移动的速度越快。左右旋体氨基酸与铜()2L2组氨酸形成两种稳定性略有差异的三元络合物(L2氨基酸2铜()2L2组氨酸和D2氨基酸2铜()2L2组氨酸),它们的电泳移动速度也略有不同,从而达到D体和L体分离的目的。Gozel等人31在以上研究的基础上,利用铜()2天冬酰胺络合物作为手性分子识别剂,成功地分离了9对丹酰化氨基酸。Schm id等人32,33利用脯氨酸衍生物2铜()络 合 物 作 为 识 别 剂,分 离 了 氨 基 酸、二 肽32和13种 拟 交 感 神 经 药(Sympathom imetics)33。利用金属络合物配位体交换分子识别法对于单一对的异构体分离,简单方便,并且有良好的分离效果,但是用于分离不同种类异构体的混合物时,分析的效果就显得不够理想。在此情况下加入阴离子表面活性SDS,往往使得混合物分离效果得到很大的改善。另外从原理上来说,配位体交换法可用于分离氨基酸、醇酸、氨基醇、二元胺和部分小肽类等能与金属离子形成络合物的手性异构体,可是到目前为止,能够用于CE分离的手性络合物只有铜()和钴()的氨基酸配合物,有关这方面的研究还相当少,表1列出了有关的大部分报道。近23年来,笔者等人结合M EKC和配位体交换法,成功地分离了既具有位置异构又含有镜像异构的苯丙氨酸氟化衍生物以及色氨酸羟基、烷基化衍生物17,18,39,同时发现两种镜像体的出峰顺序受到表面活性浓度的影响,研究和探讨了这一出峰顺序变化的原因19,21,39,并利用这一现象测定了表面活性剂SDS形成胶束的临界浓度20。从表1可以看出,除了氨基酸化合物能被分离外,部分羟基类化合物也能得到较好的分离,相信发现适当的手性配位络合剂和中心金属离子,这种方法有得到进一步发展的可能。当然,结合添加一种或数种其它分子识别剂,也可能使分析对象得以扩大。3.2CD及其衍生物CD及其衍生物在手性化合物分离研究中一直相当活跃。CD的分子构造直观地说象个塑料桶,桶的内部为疏水性空间,可以接受各种不同的物质并形成包接化合物,由于不同物质的疏水性和空间结构上的差异,使得它们与CD形成包接物的稳定性也不同。CD这一特性广泛地应用于分子识别,并且具有良好的手性异构体的分离识别能力。CE过程中,由于CD分子或者它们的衍生物溶于水而不带电荷,它们的移动不受电泳的影响而随电渗流移动,与CD相包接的化合物则同时受到电泳和电渗流两种力量的影响,而试样分子在游离条件下,按自身的移动度移动。手性化合物的左右旋体与CD形成包接物稳定性的微小差异,导致它们的移动速度不同,从而达到分离的目的。除了常用的 2CD,2CD和 2CD外,Hydroxypropyl22CD(HP22CD),HP2 2CD,2,62o2D imethyl22CD(DM22033第4期分 析 科 学 学 报第16卷Table 1Chiralmetal complexes for enantioseparation in capillary electrophoresisM etal ionL igandBufferSampleRef.Cu()L2Histidine5 mmol?L L2Histidine2.5 mmol?L CuSO410 mmol?L NH4OAC(pH 78)Dansylam inoacids30Cu()A spartame5.0 mmol?L A spartame2.5 mmol?L CuSO410 mmol?L NH4OAC(pH 7.07.5)18 Dansylam inoacids31Cu()N,N2Dodecyl2L2A la5 mmol?L N,N2Dodecyl2A la25 mmol?LCuSO420 mmol?L SDS10 mmol?L NaOAC10%(V?V)glycerolDansylam inoacids34Cu()L2(+)2Tartrate15 mmol?LL2(+)2Tartaric acidTris buffer?(pH 5.25)()Co(en)22L2am ino acid()Co(en)33+35Cu()L2ProlineL2hydroxyproline16 mmol?LL2Proline?8 mmol?L Cu()12 mmol?LL2OH2Proline?6 mmol?L Cu()(pH 4.4)2Hydroxyacids36Cu()N,N2Di2decyl2D2alanine4 mmol?L N,N2Di2decyl2D2alanine2 mmol?L Cu(OAc)250mmol?LSDS?20mmol?LNH4OAc5%Glycerol(pH 7)11Dansylam inoacids37Cu()L242Hydroxyproline80 mmol?LL242Hydroxyproline40 mmol?L Cu()15 mmol?L SDSNH3(pH 4.0)U nderivatized am inoacids38Cu()L242Hydroproline50 mmol?LL242Hydroproline25 mmol?L CuSO410 mmol?L SDS(pH 4.0)Phenylalnine,reversalofm igration order39Cu()N2(22Hydroxyoctyl)2L242Hydroxyproline,N2(22hydroxypropyl)2L242hydroxyproline510 mmol?L CuS41020 mmol?L ligand solutionAm ino acids,Dipeptides,Sympathom imetics403233CD),DM2 2CD等等中性CD衍生物也得到广泛的应用和研究41,42。我们在几年前应用CGE法,在不受EOF影响的条件下,比较了几种不同CD对分离丹酰氨基酸手性异构体的效果11,使用三甲基22CD(TM22CD)时,获得较高的分离度并成功地建立了丹酰亮氨酸等手性化合物的定量分离分析方法。以上这些CD的衍生物都不带电荷,在分离过程中不受泳动力的影响,无法单独用于分离中性化合物。近年来,随着CD合成技术的提高,可以在CD环的某一特定位置联上如氨基、磷酸基、磺酸基、羧基等具有离子化特性的功133第4期林金明等:毛细管电泳在手性化合物分离中的应用第16卷能团,这些CD衍生物不但能溶于水而且在一定的pH条件下以离子形态存在,它们在普通的CZE条件下,既可分离带有电荷的手性化合物43,44,也可分离非离子性的化合物45-47。最近Corradini等8合成了一种CD冠醚衍生物,这种化合物形同一顶帽子,可溶于水,应用于丹酰化氨基酸手性化合物分离,获得良好结果。CD衍生物的合成及其在CD中的应用研究仍然受到人们的注目,现有报道的CD衍生物有上百种,可以根据样品的电荷特性和电泳液的酸度来选择合适的CD衍生物,这也是CE在手性化合物分离分析中的得到迅速普及的主要原因之一。有关这一工作已有许多综述报道49-56,并且每篇综述都引用多篇参考文献,所以在此我们不再对CD研究作深入的评价。概括地说,这是一类极为成功的分子识别剂,目前还没有其它识别剂的性能能超过CD及其衍生物。尽管CD在CE中的应用研究似乎十分成熟,但是它的研究报道还是逐年增加,甚至很难用很短的篇幅对近12年的文献作全面的综述。相信在今后数年内CD及其衍生物仍将是CE手性化合物分离分析的主要研究方向。3.3CD以外的糖类化合物这一类分子识别剂大部分来源于天然植物,如麦芽糖糊精(M altodextrin),它是淀粉经过酶或酸加水分解后生成具有2个单元以上的麦芽糖长链聚合体,与环糊精的构造不同点在于它们是D2葡萄糖的 2(1,4)结合并且具有旋转构造。正是由于麦芽糖糊精的旋转构造,使得它对手性异构体有一定的选择性。由D2葡萄糖的 2D21,6结合为主体的葡聚糖,其聚合度与 2CD相同(n=7),这一开环低聚糖也属于这一类化合物。Soini等人57-59比较了应用CD,葡聚糖,低聚糖分离N aproxen、Ketoprofen等消炎药,发现单独采用CD时能较好地分离这一类的化合物,但采用麦芽糖糊精也同样获得良好的分离。N ishi等人60-62还报道了葡聚糖的衍生物,硫酸葡聚糖在CE分离中应用的可能性。这一化合物在水溶液中带有电荷,能够满意地分离多种不带电荷的手性化合物。他们还比较了几种不同聚合度(n=27)的麦芽糖糊精在临床分析中应用情况,发现麦芽糖糊精的聚合度对分离的效果影响比较显著,这一结果与 2、2、2CD的特性有很大的相似点。Phinney等人63还用植物果胶作为分子识别剂,分离了多种具有手性异构的抗组胺药和抗疟药。还有一些肝素(Heparin)64,65、氨基半乳糖66-71等在水溶液中可离子化的多糖衍生物也有效地被应用于CE分离,使得CZE同时分离离子性和非离子性手性化合物成为可能。这一类型的天然化合物来源丰富并且大部分可溶于水,寻找和发现可用于CE分离的品种相对比较容易,所以近年来得到较快的发展53,71。3.4冠醚化合物冠醚化合物能与K+、N a+、NH+4等阳离子形成稳定的络合物,在过去的30多年中被广泛应用于金属离子的选择性研究。但在CE领域里,应用冠醚作为手性分子识别剂的研究报道相对较少,其主要原因一是大部分的冠醚化合物不溶或难溶于水,难以应用于水溶液体系的CE分析;二是大部分冠醚分子的构造为平面结构,对手性分子的识别效果往往难以令人满意。除这两点之外,可溶性冠醚的价格也比CD高。尽管冠醚的种类众多,但目前能应用于CE手性化合物分离的只有182冠262四碳酸(18C6H4)。Kuhn等人72,73首次应用18C6H4作为手性识别剂,在pH 2.2条件下,分离了数种氨基酸化合物,他们发现了D2氨基酸和L2氨基酸的出峰顺序与使用 2CD时相同,并且分析时间短,分离效果也优233第4期分 析 科 学 学 报第16卷于 2CD。Kuhn等人74-76还研究了18C6H4的手性识别机理。Schm id和Gubitz77用18C6H4分离由两个亮氨酸组成的小肽(DL2L eucyl2DL2L eucine)时,发现18C6H4浓度对分离有较大的影响。笔者等人12采用CD和18C6H4混合识别剂,成功地分离了既具有位置异构又含有手性异构的氟化苯丙氨酸,同样发现酸度的影响非常明显。这可能是因为18C6H4含有4个羧基,是一种弱酸性化合物,受电泳液酸碱性作用比较敏感。利用18C6H4同时还受到试样结构的限制,只有部分含有氨基的试样才能有效地与冠醚环形成络合物,所以目前所报道的所有分析对象都是含氮化合物。V erleysen等人78比较了用磺酰化HS2 2CD,HS2 2CD和18C6H4分离部分氨基酸及其衍生物,发现用HS2 2CD或 2CD作为识别剂时,异构体的出峰顺序与18C6H4相反。N ishi等人79用冠醚作为分子识别剂,比较了CE和HPLC对胺类化合物的分离效果,一些分子量在1 000左右的甲氨基化合物用HPLC无法获得满意的结果,而用CE分离效果良好。Kuhn80还针对冠醚在CE手性分析的研究与应用作了详细的综述和评论。如果能够开发新型且使用面广的CE手性化合物分离用的冠醚,将对手性化合物分子识别起到重要的贡献。3.5大环化合物大环化合物应用于CE手性化合物的分离是近年新出现的一个分支,许多环状化合物似乎都有异构体识别能力,大大增加了分子识别剂的可选择类型。这里举几种典型的大环状抗生素试剂,V ancomycin,R istocetin A,Teicoplanin和R ifamycin B等在CE手性化合物分离分析中的应用情况。这些化合物的结构中含有多种功能团,如羟基、氨基、多环等,这些功能团以及环状分子中的光学异构部位的原子对于分子间的相互作用和手性分子识别都具有重要的作用。V ancomycin分子中含有多个可离子化的功能团,分别有2.9,7.2,8.6,9.6,10.5和11.7等6级的pK值81,其等电点7.582,可溶于水和二甲基甲酰胺、二甲亚砜等极性有机溶剂,其3个较高的pK值可能是来源于苯酚环的影响。V ancomycin在水和有机溶剂中的可溶性,作为CE的手性识别剂有着它的特殊优点。A rm strong等人83报道了用V ancomycin成功地分离了100多种的酸性手性化合物,其中包括多种氮衍生化氨基酸和含有羧基功能团的药物等等。他们84还报道了用R istocetin A作为识别剂分离酸性手性化合物的研究,这一大环化合物与V ancomycin的结构和分子识别特性有许多相似点,但是有些能用R istocetin A分离的试样,如苯乙醇酸、22甲氧基苯乙醇酸、2苯乙酸等用V ancomycin作为识别剂时无法得到满意的结果。Teicoplanin也属糖肽抗生素大环化合物中的一种,可溶于水,含有一个自由氨基、一个自由羧基、其等电点为3.885。它的结构与V ancoymcin、R istocetin A都有一定的相同点,但主要的不同在于含有D2葡糖基和D2甘露糖、以及1个脂肪酸残基。处于分子同一尾部的葡糖氨基和脂肪酸残基倾向于相互结合形成一个亲水性的分子末端,所以在水溶液中,Teicoplanin具有表面活性剂的特性,高于一定浓度自聚形成胶束,其临界浓度受到pH的影响比较显著,在pH 7.2和8.0的磷酸缓冲溶液(50 mmol?L)中,形成胶束的临界浓度分别为0.210和0.840mmol?L。所以这一化合物被认为是具有手性识别的表面活性剂而被应用于手性化合物的CE分析85,86,成为分子识别表面活性剂的一个典型例子。近年来,大环化合物的多功能性和水中可溶性,作为CE手性化合物分离的分子识别剂受到人们的重视87,表2按分子识别剂的种类列出去年发表的部分研究报道。333第4期林金明等:毛细管电泳在手性化合物分离中的应用第16卷Table 2L ist of some chiral compounds resolved into enantiomers using various chiral selectorChiral selectorChiral compoundsCE modeRef.Carboxymethyl22CDTramadolo2demethyltramadolN2demethyltramadolo2demethyl2N2dem thytramadolCZE88Bimethyl22CDIsomeric tripeptidesCZE89TerbutalineCZE90Haloperidol and its chiralmetabolitesCZE9122Hydroxypropyl22CD2Hydroxy acidsCZE92A romatic am ino acidsCZE93Sulfonated2CD,Carbamate chiralsurfactantsA tenolol,benzoin,hydrobenzoin,ketam ine,laudanosine,nefopam,propranololCZE94Silica2hydroxypropyl22CDSynephrine,phenylephrineCEC9518C6H4 and carboxymethyl22CD2and2aspartylpeptidesandtheirenantiomersCZE96Silica gel modified by poly2N2acryloyl2L2phenylalanineethylester or cellulose tris(3,52dimethylphenylcarbamate)2Blocker,benzodiazepines,diuretica,etc.CEC97M altodextrinsPentazocineCZE98Polymeric dipeptied surfactants1,12bi222Naphthol1,12bi222Naphthyl22,22diylCZE9918C6H4Am ino acidsCZE100Quinine or terbutyl carbamoylated quinineN2Protected am ino acidsNon2aqueousCZE101Silica2quinine carbamateN2Derivatized am ino acidsCEC102M acrocyclic antibioticA 35512BDansyl am ino acidsCZE103Bovine serum album inDL2a2am ino2b2 42(1,22dihydro222oxo2quinoline9propionic acidCZE104Humanserumalbum in,bovineserumalbum inOfloxacin,verapam il,propranololCZE105Avidin,avidin2biotin complex,StreptavidinAcidic racematesAffinity CE106VancomycinFMOC2am ino acidsCZE107Vancomycin and2CDA ryloxypropionicandaryloxyphenoxypropionic acid herbicidesCZE108Silica2vancomycinThalidom idCEC109TeicoplaninM ino and mandelic acid derivativesCZE110Tryptophan and dinitrobenzoyl leucineCEC1112Hydroxy acidsCZE112Ristocetin ANonsteroidalantiinflammatories,dansylam inoacids,dinitrophenyl2derivatized am ino acids,etc.CE(Countercurrent)113Restocetin A,vancomycin,teicoplaninN2blocked am ino acids,antiinflammatoryCZE114Pentosan polysulfateTwenty2eight racematesCZE115Molecularly imprinted polymer22Hydroxy232(isopropylam ino)2propoxyCEC116Cetyltrimethylammoniumbrom ide,lysozymeAm inoacids,mephenytoin,alkylsubstituted benzenesOpen tubularCEC117433第4期分 析 科 学 学 报第16卷4结束语正如以上所述,CE分析具有简单、迅速等特点,只要在电泳液中添加适当的手性分子识别剂,就能获得满意的分离分析结果,近年来CE在光学异构体分离分析的研究与应用中得到迅速的发展,许多报道还显示了CE的分离效果优于HPLC法。所以我们有理由相信,在今后的较长一段时期内,随着高灵敏度CE检测方法的不断出现,CE的应用范围还将逐步扩大。参考文献:1Blaschke G,Kraft H P,Fickentscher K,Kohler F.A 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T.ChromatographiaJ,1998,47:625.17Chen Z,L in J M,U chiyama K,Hobo T.J.Chromatogr.A J,1998,813:369.18Chen Z,L in J M,U chiyama K,Hobo T.ChromatographiaJ,1999,49:436.19Chen Z,L in J M,U chiyama K,Hobo T.J.M icrocolumn SepJ.,1999,11:534.20Chen Z,L in J M,U chiyama K,Hobo T.A nal.Chi m.A ctaJ,2000,403:173.21Chen Z,L in J M,U chiyama K,Hobo T.A nal.SciJ.,2000,16:131.22RoganM M,A ltria K D(Ed.).Introduction to the Theory and Applications of Chiral CapillaryElectrophoresisM.Beckmann,Fullerton,CA,1993.23 Chankvetadze B.Capillary Electrophoresis in Chiral A nalysis M.John W iley&Sons,Chichester,England,1997.24Zhong Y,Zhu X,Xu X,L in B.Fenxi HuaxueJ,1999,27:219.25Soo E C,Salmon A B,Lough W J.Chem.IndJ.(London),1999,(6):220.26ChankvetadzeB.T rendsA nal.Chem J.,1999,18:485.27Guttman A,Paulus P,Cohen A S,GribergN,KargerB L.J.ChromatogrJ.,1988,448:41.28Cruzado ID,V igh G.J.ChromatogrJ.,1992,608:421.29Birnhaum S,N ilsson S.A nal.Chem J.,1992,64:2872.30Gassmann E,Kuo J E,Zare R 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urie I S,Klein R F X,Dal Cason T A et al.A nal.Chem J.,1994,66:4019.44Tait R J,Thompson D O,Stella V J,Stobagh J F,A nal.Chem J.,1994,66:4013.45W ang F,KhalediM G.A nal.Chem J.,1996,68:3460.46W ang F,KhalediM G.J.Chromatogr.B J,1999,731:187.47V argasM G,Heyden Y V,M aftouh M,M assart D L.J.Chromatogr.A J,1999,855:681.48Corradini R,Buccella G,Galaverna G et al.Tetrahedron L ettJ.,1999,40:3025.49N ishi H,Terabe S.J.Chromatogr.A J,1995,694:245.50N ishi H.J.Chromatogr.A J,1995,735:57.51Fanali S.J.Chromatogr.A J,1996,735:77.52ChankvetadzeB,Endresz G,Blaschke G.Chem.Soc.RevJ.,1996,25:141.53Fanali S.J.Chromatogr.A J,1997,792:227.54L urie I S.J.Chromatogr.A J,1997,792:297.55ChankvetadzeB.J.Chromatogr.A J,1997,792:269.56L arsen K L,Zi mmermannW.J.Chromatogr.A J,1999,836:3.57Soini H,Steffanson M.,R iekkolaM2L,NovotnyM V.A nal.Chem J.,1994,66:3477.58N ishi H,Izumoto S,N akamura K,N akaiH,Sato T.ChromatographiaJ,1996,42:617.59DHulst A,V erbeke N.J.Chromatogr.A J,1992,608:275.60N ishi H,N akamura K,N akaiH,Sato T,Terabe S.ElectrophoresisJ,1994,15:1335.61N ishi H,N akamura K,N akaiH,Sato T.A nal.Chem J.,1995,67:2334.62N