DNA凝胶电泳常用试剂配制.doc

DNA的凝胶电泳
1.琼脂糖凝胶电泳

含不同量琼脂糖的凝胶的分离范围
凝胶中的琼脂糖含量〔％（w/v）〕
线状DNA分子的有效分离范围（kb）
0.3
5－60
0.6
1－20
0.7
0.8－10
0.9
0.5－7
1.2
0.4－6
1.5
0.2－3
2.0
0.1－2

常用电泳缓冲液

缓冲液
使用液
浓储存液（每升）
Tris-乙酸（TAE）
1×:0.04mol/L Tris－乙酸
0.001mol/L EDTA
50×:242g Tris碱
57.1ml冰乙酸
100ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)
Tris-磷酸（TPE）
1×:0.09mol/L Tris-磷酸
0.002mol/L EDTA
10×:108g Tris碱
15.5ml 85％磷酸（1.679g/ml）
40ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)
Tris-硼酸（TBE）a
0.5×:0.045 mol/L Tris-硼酸
0.001mol/L EDTA
5×:54g Tris碱
27.5g硼酸
20ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)
碱性缓冲液b
1×:50mmol/L NaOH
1mmol/L EDTA
1×:5ml 10mol/L NaOH
2ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)
a．TBE浓溶液长时间存放后会形成沉淀物，为避免这一问题，可在室温下用玻璃瓶保存5×溶液，出现沉淀后则予以废弃。
以往都以1×TBE作为使用液（即1：5稀释浓贮存液）进行琼脂糖凝胶电泳。但0.5×的使用液已具备足够的缓冲容量。目前几乎所有的琼脂糖凝胶电泳都以1：10稀释的贮存液作为使用液。
进行聚丙烯酰胺凝胶电泳使用的1×TBE，是琼脂糖凝胶电泳时使用液浓度的2倍。聚丙烯酰胺凝胶垂直槽的缓冲液槽较小，故通过缓冲液的电流通量通常较大，需要使用1×TBE以提供足够的缓冲容量。
b. 碱性电泳缓冲液应现用现配。

凝胶加样缓冲液

缓冲液类型
6×缓冲液
贮存温度
Ⅰ
0.25％溴酚蓝
0.25％二甲苯青FF
40%(w/v)蔗糖水溶液
4℃

Ⅱ
0.25％溴酚蓝
0.25％二甲苯青FF
15％聚蔗糖（Ficoll）（400型；Pharmacia）水溶液
室温

Ⅲ
0.25％溴酚蓝
0.25％二甲苯青FF
30％甘油水溶液
4℃

Ⅳ
0.25％溴酚蓝
40%(w/v)蔗糖水溶液
4℃

Ⅴ
碱性加样缓冲液
300mmol/L NaOH
6mmol/L EDTA
18%聚蔗糖（Ficoll）（400型；Pharmacia）水溶液
0.15%溴甲酚绿
0.25％二甲苯青FF
4℃
使用以上凝胶加样缓冲液的目的有三：增大样品浓度，以确保DNA均匀进入样品孔内；使样品呈现颜色，从而使加样操作更为便利；含有在电场中能以可预知速率向阳极泳动的染料。溴酚蓝在琼脂糖凝胶中泳动的速率约为二甲苯青FF的2.2倍，而与琼脂糖浓度无关。以0.5×TBE作电泳液时，溴酚蓝在琼脂糖中的泳动速率约与长300bp的双链DNA相同，而二甲苯青FF的泳动则与长4kb的双链线状DNA相同。在琼脂糖浓度为0.5－1.4％的范围内，这些对应关系受凝胶浓度变化的影响并不显著。
选用哪一种加样染料纯属个人喜恶。但是，对于碱性凝胶应当使用溴甲酚绿作为示踪染料，因为在碱性pH条件下其显色较溴酚蓝更为鲜明。

2.聚丙烯酰胺凝胶电泳

DNA 在聚丙烯酰胺凝胶中的有效分离范围
丙烯酰胺〔％（w/v）〕a
有效分离范围（bp）
二甲苯青FFb
溴酚蓝b
3.5
1000－2000
460
100
5.0
80－500
260
65
8.0
60－400
160
45
12.0
40－200
70
20
15.0
25－150
60
15
20.0
6－100
45
12
a. N,N’-亚甲基双丙烯酰胺占丙烯酰胺浓度的1/3.
b. 给出的数字是迁移率与染料相同的双链DNA片断的粗略大小（核苷酸对）
30％丙烯酰胺：
丙烯酰胺 29g
N,N’-亚甲基双丙烯酰胺 1g
加水至100ml
将溶液加热至37℃使化学药品溶解
小心：丙烯酰胺是强烈的神经毒素，可经皮肤吸收。丙烯酰胺的作用具有累积性。称取粉末状丙烯酰胺及亚甲双丙烯酰胺时必须带手套和面具。取用含上述化学药品的溶液也要戴手套。尽管可以认为聚丙烯酰胺无毒，但鉴于其中可能含有少量未聚合的丙烯酰胺，故仍应小心处理。
10％过硫酸铵
过硫酸铵 1g
加水至10ml
可在4℃保存数周。

制备聚丙烯酰胺凝胶所用试剂的体积（总体积100ml）
试剂
制备不同浓度（％凝胶所用试剂的毫升数
3.5％
5.0％
8.0％
12.0％
20.0％
30％丙烯酰胺
11.6
16.6
26.6
40.0
66.6
水
67.7
62.7
52.7
39.3
12.7
5×TBE
20.0
20.0
20.0
20.0
20.0
10%过硫酸铵
0.7
0.7
0.7
0.7
0.7
每100ml丙烯酰胺凝胶溶液加35ulTEMED（N,N,N’,N’-四甲基乙二胺），旋动容器混匀。

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聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作步骤及试剂配方
聚丙烯酰胺凝胶电泳作为检测DNA序列差异的有效手段，变性凝胶电泳在我室广泛使用，但是也有其使用范围。在我室还有一种常用的非变性凝胶电泳技术，简称SSCP（Single Strand Conformation Polymorphism，单链构象多态性）。
原理：在SSCP测定中，双链DNA（dsDNA）被变性成为单链DNA（ssDNA），每一条单链DNA都基于它们的内部序列而呈现出一种独有的折叠构象，即使同样长度的DNA单链因其碱基顺序不同、甚至单个碱基的不同会形成不同的构象。这些单链DNA在非变性条件下，用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，单链DNA的迁移率和带型，都取决于其折叠构象和电泳时的温度。 
SSCP与变性凝胶电泳基本一致，不同之处有以下几点：
a． SSCP使用非变性凝胶进行电泳，即在凝胶配制中不加入变性剂。我室常用8%非变性胶（丙烯酰胺 80g，N- N，-亚甲双丙烯酰胺 2.76 g，10×TBE 50ml，加水定容到1L）
b． 工作环境，由于SSCP受温度影响，所以在电泳过程中应防止温度的升高，所以电泳环境为电压400V，电流50mA，单板电泳功率为9W，不用预热。缓冲液最好用新配制的。
c． 由于电泳功率较低，所以电泳时间较长，通常需要10小时以上，因此一般电泳需要过夜。室温在25。C以下。
1. 聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳适宜分离鉴定低分子量的蛋白质，小于1kb的DNA片段和DNA序列。分析装载的样品容量大，可回收，DNA纯度高。在催化剂TEMED（N-N-N，- N，-四甲基乙二胺）和过硫酸胺的作用下，丙烯酰胺聚合成长链，聚丙烯酰胺链在交联剂，N- N，-亚甲双丙烯酰胺的参与下，聚丙烯酰胺链与链之间交叉联结形成凝胶。
1.1 配制30%丙烯酰胺：丙烯酰胺29g
                     N- N，-亚甲双丙烯酰胺    1g
                     加水至100ML，40C棕色瓶可保存二月
1.2 配制5×TBE缓冲液：
                       TRIS碱      54克
                       硼酸        27.5克
                       EDTA       3.72克
                      加水至1L
1.3 制备聚丙烯酰胺凝胶所用试剂体积

试剂
制备不同浓度（%）凝胶所用试剂体积（ml）
3.5
5.0
8.0
12.0
20.0
30%丙烯酰胺
11.6
16.6
26.6
40.0
66.6
水
67.7
62.7
52.7
39.3
12.7
5×TBE
20.0
20.0
20.0
20.0
20.0
10%过硫酸铵
0.7
0.7
0.7
0.7
0.7
1.4 DNA在聚丙烯酰胺凝胶中有效分离范围

丙烯酰胺（%）
有效分离范围（bp）
二甲苯氰FF
溴酚蓝
3.5
1000-2000
460
100
5.0
80-500
260
65
8.0
60-400
160
45
12.0
40-200
70
20
15.0
25-150
60
15
20.0
6-100
45
12
2. 聚丙烯酰胺凝胶电泳具体步骤
2.1从NaOH池中捞出浸泡的玻璃板，取出上面的残胶
2.2 把玻璃板拿到流动水处洗刷干净
2.3 洗干净的玻璃板至于玻璃板架上晾干
2.4 用乙醇擦洗玻璃板
2.5 带凹口的背板涂上硅化剂，面板则涂上粘合剂，防止电泳完毕发生撕胶和脱胶的可能（涂摸要均匀）
2.6 面板在下，背板在上。两侧用塑料板密封，并用夹子夹好。底部调节使之水平
2.7 将加入催化剂后的凝胶沿凹口均匀倒下，插入适当的封条。勿使封条下留下气泡。用夹子夹紧封条部位
2.8 室温聚合30分钟，小心取出凹口处封条，用水冲洗加样孔（否则封条所残留的丙烯酰胺在加样孔聚合产生不规则表面，引起DNA带变形）
2.9 将凝胶固定在电泳槽里。带凹口背板朝里，面向缓冲液槽
2.10 用0. 5×TBE灌满电泳槽的缓冲液槽，接上电极，打开电源。调试工作环境为电压2000-2200V，电流150-200mA，单板电泳功率为80W。预热30分钟左右。 
2.11 点样之前需切断电源，用枪将点样孔的气泡及胶吹出，然后插入点样梳，注意不要插得太深，否则点样胶面会变形，影响美观及点样。
2.12枪吸加样品，PCR产物先加loading buffer 10ul ,再变性5分钟左右，接着在冰水中冷却5分钟以上方可点样，点样完毕，电泳开始。
 2.13 电泳至所需位置后，切断电源，拔出导线，回收缓冲液，卸下玻璃板。在工作台上，将背板撬起，放回原处。将面板进行银染
3. 电泳后的银染检测
3.1 原理：
影像产生是由于核酸在胶上所占部位与周围的氧化——还原势不同而产生。银染液中的银离子（Ag+）可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛使Ag+还原成银颗粒，这样核酸电泳带就染成了黑褐色。
3.2 银染
  银染液的配制：称2.5至3.0g AgNO3加1200---1400ml水
  银染:将电泳完的面板首先在银染漂洗盆了漂洗赶紧，使胶面上没有异物。玻璃板反面没有污染物。
      将加入银染液的银染盆放在摇床上后，将面板放入银染1小时左右。
3.3 显影
显影液的配制：NaOH---20g, Na2CO3----0.6g,甲醛4.5ml，加水1200ml
显影：将面板从银染盆里取出，在银染漂洗盆里漂洗，震荡5-6次，取出后使其表面尽量无水，再放入已加入显影液的显影盆里（显影，显影液的配制及甲醛的加入都需要在通风橱的摇床上进行）显影过程大约10到15分钟，以DNA条带清晰可见为准。
将显现完毕的板子在显影漂洗盆里漂洗后，方可读带。
一、电泳试剂：
1、30％聚丙烯酰胺(29:1)
丙稀酰胺29克，Bis1克，水100ml。
2、10％过硫酸胺
过硫酸胺1克，水10ml。
3、TEMED
4、5xTBE
Tris 27克，硼酸13.75克，0.5M EDTA(pH 8.0) 10ml，定容至500ml。
二、银染试剂
1、固定液：100ml无水乙醇，5ml冰醋酸，定容至1000ml。
2、0.2% AgNO3：AgNO3 1克，水500ml。
3、1.5% NaOH：NaOH 7.5克，水500ml。
4、37％甲醛。
三、配胶(6%)：
30％聚丙烯酰胺(29:1) 8ml，5xTBE 8ml，定容至40ml，加10％过硫酸胺 200ul；TEMED 20ul。室温凝固时间>1小时。
四、银染：
1、固定液固定10m。
2、水洗2m x3次。
3、0.2% AgNO3 100ml ＋37％甲醛50ul，混匀，避光染色30～50m。
4、水洗 20秒x2次。
5、1.5% NaOH 100ml，加37％甲醛 0.5ml，混匀，显色3～10m。
6、水洗若干次，终止显色。
电泳时间：150v x 3h，溴酚兰的位置相当于40bp。
银染后胶面积将膨胀10％。
在终止显色过程中，将依惯性继续显色，所以不等显色到位即可进行终止显色。
显色到位后立即拍摄，水浸泡过夜将使背景加深

我国的试剂规格基本上按纯度（杂质含量的多少）划分，共有高纯、光谱纯、基准、分光纯、优级纯、分析和化学纯等7种。国家和主管部门颁布质量指标的主要优级纯、分级纯和化学纯3种。

（1）优级纯（GR：Guaranteed reagent），又称一级品或保证试剂，99.8%，这种试剂纯度最高，杂质含量最低，适合于重要精密的分析工作和科学研究工作，使用绿色瓶签。

（2）分析纯（AR），又称二级试剂，纯度很高，99.7%，略次于优级纯，适合于重要分析及一般研究工作，使用红色瓶签。

（3）化学纯（CP），又称三级试剂，≥ 99.5%，纯度与分析纯相差较大，适用于工矿、学校一般分析工作。使用蓝色（深蓝色）标签。

（4）实验试剂（LR：Laboratory reagent），又称四级试剂。

除了上述四个级别外，目前市场上尚有：
基准试剂（PT：Primary Reagent）：专门作为基准物用，可直接配制标准溶液。

光谱纯试剂（SP：Spectrum pure）：表示光谱纯净。但由于有机物在光谱上显示不出，所以有时主成分达不到99.9%以上，使用时必须注意，特别是作基准物时，必须进行标定。

纯度远高于优级纯的试剂叫做高纯试剂（≥ 99.99%）。

目前，国外试剂厂生产的化学试剂的规格趋向于按用途划分，常见的如下：

生化试剂 （BC：Biochemical）

生物试剂 （BR：Biological reagent）

生物染色剂 （BS：Biological Stain）

络合滴定用 （FCM：For Complexometry）
层析用0S-J1[ j;B2~（F1v7G分析化学,论坛,化学分析,仪器分析,分析测试,色谱,电泳,光谱 （FCP：For chromatography purpose）

荧光分析（FIA）

微生物用（FMB）
显微镜用 （FMP：For microscopic purpose）
合成用-[6]#f!g6M#s.u5）]（FS：For synthesis）
气相色谱0S,~.L1t3k7`-{"E （GC：Gas chromatography）
高压液相色谱 （HPLC：High Pressure Liquid chromatography）
指示剂9K5R-}-s;_9t分析化学,论坛,化学分析,仪器分析,分析测试,色谱,电泳,光谱 （Ind：Indicator）

红外吸收（IR）

液相色谱（LC）

核磁共振（NMR）
有机分析标准6a1Z2m:d*A7K+x分析化学论坛 （OSA：Organic analytical standard）
分析用（PA：Pro analysis）
实习用 （Pract： Practical use）
（\\（T&e- Y5G-N%MPur （Pure purum 纯）
Puriss （Purissmum 特纯）

合成（SYN）
工业用Tech：Techincal grade）
薄层色谱（TLC：Thin Layer chromatography）
分光纯、光学纯、紫析分光光度纯$v7）（UV：Ultra violet pur