肉鸡沙门氏菌的分离鉴定及药敏试验_王傲雪 (1).pdf

肉鸡沙门氏菌的分离鉴定及药敏试验王傲雪，张凌云，张桉潮，李昆鹏，张秀丽，梁晚枫，张林波（延边大学，吉林延吉 ；吉林农业大学，吉林长春 ；吉林正大实业有限公司，吉林长春 ；中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 ）摘要：为了解吉林省某地鸡源性沙门氏菌的感染及耐药情况，对该地个肉鸡场 份病鸡组织样品进行细菌分离，并进行了血凝试验、致病性试验和药敏试验。分离得到 株沙门氏菌，经血凝鉴定有 株呈阳性，其中株呈强阳性并均能使雏鸡致死。药敏试验结果显示，该株沙门氏菌对头孢噻肟较为敏感；对氨苄西林、替米考星、林可霉素、阿奇霉素和头孢拉定表现出极高的耐药性，耐药率高达 ；诺氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、强力霉素和氯霉素种临床用药与痢菌净不具有协同或累加作用。试验结果表明，沙门氏菌是危害该地肉鸡养殖场的主要病原菌之一，且耐药性十分严重。关键词：沙门氏菌；分离鉴定；药敏试验中图分类号：文献标识码：文章编号：（）禽沙门氏菌病（）是由种或多种沙门氏菌引起的禽类急性或慢性传染病的总称，已被国际兽疫局列为 类传染病（廖成水等，）。沙门氏菌是影响食品安全的致病菌之一，广泛存在于自然界和温血动物体内，是一种重要的人兽共患性病原菌。随着中国集约化养鸡业的发展，病毒性传染病依靠良好的疫苗和完善的免疫程序基本得到控制，而细菌性传染病日趋严重，难以防制，使得极易形成耐药性的沙门氏菌的流行愈演愈烈（申之义等，）。虽然抗生素的应用对控制和预防沙门氏菌病发挥了巨大的作用，然而随着抗菌药物的滥用及不当使用，沙门氏菌病的耐药性日趋严重，加强对该菌耐药性的监测力度和耐药机制的研究迫在眉睫（邓树轩等，）。鉴于此，作者对吉林省某地鸡源沙门氏菌病进行了病原菌的分离、鉴定及药敏试验，为临床兽医选择和使用抗菌药物提供参考。材料与方法 材料 病料来源 年月 年月收集的 份来自吉林省某地个规模鸡场疑似患沙门氏菌病的病料。培养基 营养琼脂培养基、营养琼脂培养基和三糖铁琼脂（）均购自青岛某技术有收稿日期：作者简介：王傲雪（），女，吉林人，硕士生，研究方向：鸡病研究与防治。通信作者：张林波（），男，吉林人，博士生导师，教授，从事免疫学研究。：限公司。沙门氏菌属诊断血清沙门氏菌群“”多价诊断血清购于中国生物技术集团公司兰州生物制品研究所，批号：。试验药物头孢噻肟、头孢唑啉、头孢拉定、庆大霉素、恩诺沙星、强力霉素、奥复星和卡那霉素种药敏纸片均购自杭州微生物试剂有限公司，批号 ；硫酸庆大霉素、阿莫西林、头孢曲松、诺氟沙星、痢菌净、阿米卡星、泰勒菌素、阿奇霉素、壮观霉素、新霉素、左旋氧氟沙星、林可霉素、呋喃唑酮、泰妙菌素、替米考星、复方新诺明、沙拉沙星、磷霉素、黏杆菌素、青霉素、氯霉素、阿奇霉素、甲硝唑、环丙沙星、氨苄西林、左旋氧氟沙星及培氟沙星 种药敏纸片按 纸片法抗菌药物敏感试验标准生物制药实验室自制，密封低温保存备用；青霉素钾购自江苏南农高科动物药业有限公司。试验动物日龄健康 雏鸡由德惠市种鸡场提供。方法 病料采集病料来源于发病地区，病鸡临床症状表现为精神萎顿，畏寒不愿走动，同时腹泻排白色浆糊状稀便，泄殖腔周围羽毛污染，将其处死并剖检取其肺脏、心脏、肝脏、脾脏和肠，于 保存备用。沙门氏菌的分离鉴定在实验室无菌条件下将病料组织划线接种于 营养琼脂培养基和 营养琼脂培养基，置 培养 后观察，挑取直径约 的小菌落进行革兰氏染色，革兰氏阴性、大多单个存在或有少量成对排列的小中国畜牧兽医 年第 卷第期疾病防治杆菌为可疑落菌，按照 等（）的介绍对其纯化扩增，并将革兰氏阴性短杆菌分离菌株接种于 中。血清型鉴定挑取三糖铁培养物中呈阳性的菌落进行沙门氏菌 多价“”诊断血清玻片凝集试验，并设生理盐水为对照。玻片凝集试验用于筛选常见的菌体 群抗原，其方法为：在平板上，将琼脂培养的细菌与少量生理盐水混匀，与一滴沙门氏菌多价“”抗血清混合，摇晃并观察凝集情况（赵兴绪等，）。致病性试验取株接种于营养培养液，置 恒温摇床培养，取菌液滴口日龄健康雏鸡各只，每只；另设对照鸡只，滴口营养培养液。将各组雏鸡隔离饲养，观察发病及死亡情况（郑启宏等，）。对死亡雏鸡进行剖检，观察病理学变化。药敏试验采用世界卫生组织（）推荐的 纸片法进行药敏试验（倪宏波等，）。挑取单个菌落，分别接种于营养培养液中，培养；用无菌生理盐水稀释制成 麦氏标准的菌悬液，吸取适量菌液于营养琼脂平板内，在其表面均匀涂布，盖上平板，于室温放置数分钟，用无菌小镊子夹取各种药敏纸片，平贴于琼脂表面，然后倒置于 培养 。平板取出后，观察在药敏纸片周围有无抑菌圈形成，测量其直径（）大小。结果判定标准 为高度敏感；为中度敏感；为耐药（罗玲等，）。最小抑菌浓度的测定选取临床常用种抗生素，采用试管倍稀释法测定单价药的最小抑菌浓度（）。棋盘法联合药敏试验首先向 孔板的每一孔中加肉汤培养基。根据最小抑菌浓度值尽量将痢菌净 浓度孔出现在第或孔，计算好后再配制痢菌净溶液。在每一行的第孔中加 抗生素溶液，混合后吸出 加入下一列中，用同样方法稀释至第 列，弃去，第 列作为生长对照。诺氟沙星用灭菌小青瓶先倍比稀释至所需第行浓度，然后加 到 孔板中的前行，第行作空白对照。将菌液用营养肉汤稀释至 ，每孔加菌液 ，于 恒温箱中培养 ，记录结果。联合药敏试验 指数 指数（甲药联合时的 甲药单独时的 ）（乙药联合时的 乙药单独时的 ）。指数，协同作用；指数，相加（累加）作用；指数，无关作用；指数，颉颃作用。结果与分析 病理变化剖检的病死鸡呈现不同程度的病理变化，主要表现为纤维素渗出性心包炎、肝周炎，肝脏呈土黄色，肾脏肿大。分离结果在 琼脂平板上呈圆形、灰绿色并中心有黑色的菌落，在 琼脂平板上呈无色透明或有黑色中心的小菌落；选取单个菌落涂片，革兰氏染色之后，在油镜下观察，可发现大量短小、两端钝圆、单个存在的革兰氏阴性小杆菌；接种于 表现为产酸、斜面变红、底层反应呈阳性并产硫化氢，结果显示该分离菌疑似为沙门氏菌。将分离到的 个菌株与沙门氏菌多价血清进行玻片凝集试验，结果发现有 个菌株呈阳性，其中有株强阳性，分别命名为、和。致病性试验结果将血清鉴定呈强阳性的株沙门氏菌接种于雏鸡，死亡结果见表。由表可知，雏鸡在接种分离菌后开始死亡，死亡高峰在左右。病雏鸡临床表现：发病急者，无症状迅速死亡；发病缓慢者表现精神沉郁，两翼下垂，缩颈闭眼昏睡，不愿走动，挤在一起，病初食欲减少，最终归于死亡。剖检结果显示，病死鸡肝脏呈土黄色，肠出血，肾脏肿大。表株沙门氏菌接种雏鸡死亡结果组别雏鸡数（只）死亡率（）（）（对照组（）（）（）药敏试验结果株沙门氏菌进行药敏试验的结果表明，沙门氏菌菌株对头孢噻肟较为敏感；对氨苄西林、替米考星、林可霉素、阿奇霉素、头孢拉定等具有较高的耐药性；而对头孢唑啉、头孢拉定、强力霉素等具有不同程度的耐药性（表）。疾病防治中国畜牧兽医 年第 卷第期表株沙门氏菌药敏试验结果药物药物含量（片）抑菌圈直径（）及结果 头孢噻肟 耐药 敏感 敏感 敏感耐药头孢唑啉 耐药 敏感耐药 中敏耐药头孢拉定 耐药 中敏耐药 耐药耐药庆大霉素 耐药 敏感耐药耐药耐药恩诺沙星 耐药 敏感耐药耐药耐药强力霉素 中敏耐药 敏感耐药耐药氧氟沙星 耐药 敏感耐药耐药 中敏卡那霉素 耐药 敏感耐药耐药耐药硫酸庆大霉素 耐药 敏感耐药耐药耐药阿莫西林 耐药 敏感耐药耐药耐药头孢曲松 耐药 敏感 中敏 敏感耐药诺氟沙星 耐药 敏感耐药耐药耐药痢菌净 耐药 敏感耐药 敏感耐药泰勒菌素 耐药 中敏耐药耐药耐药恩诺沙星 耐药 敏感耐药耐药耐药阿奇霉素 耐药耐药耐药耐药耐药壮观霉素 耐药 敏感耐药耐药耐药新霉素 耐药 敏感耐药耐药耐药左旋氧氟沙星 耐药 敏感耐药耐药耐药林可霉素 耐药耐药耐药耐药耐药呋喃唑酮 耐药耐药耐药耐药耐药泰妙菌素 耐药耐药耐药耐药耐药替米考星 耐药耐药耐药耐药耐药复方新诺明 耐药耐药耐药 敏感耐药沙拉沙星 耐药 敏感耐药耐药耐药磷霉素 耐药 敏感耐药耐药耐药多黏菌素 耐药耐药耐药耐药耐药青霉素 耐药耐药耐药耐药耐药氯霉素 中敏 中敏 中敏耐药 敏感甲硝唑 耐药耐药耐药耐药耐药环丙沙星 耐药 敏感耐药耐药耐药氨苄西林 耐药耐药耐药耐药耐药培氟沙星 耐药 敏感耐药耐药耐药阿米卡星 耐药 敏感耐药耐药耐药 鸡源沙门氏菌对种抗菌药物的最小抑菌浓度种抗生素单价药对分离的沙门氏菌的最小抑菌浓度测定结果见表。由表可知，分离的沙门氏菌除了对痢菌净和恩诺沙星较敏感外，对其余种抗生素均表现出较强的耐药性。表株沙门氏菌对种抗菌药物的 （）药物 单硫酸卡那霉素环丙沙星 氯霉素 强力霉素 诺氟沙星 庆大霉素痢菌净 恩诺沙星 注：“”表示无抑菌作用。中国畜牧兽医 年第 卷第期疾病防治 联合药敏试验结果种抗生素与痢菌净对株鸡源沙门氏菌联合药敏试验结果见表。由表可知，痢菌净与其他种当前临床所用药物不具有协同或累加作用，且大部分表现出无关或颉颃作用。表药物联合试验药物 协同累加无关颉颃痢菌净与诺氟沙星 痢菌净与恩诺沙星 痢菌净与环丙沙星 痢菌净与氯霉素 痢菌净与强力霉素 注：为协同作用；为累加作用；为无关作用；为颉颃作用。讨论本次试验对分离鉴定得到的株沙门氏菌进行药敏试验，结果表明，除对头孢噻肟具有高度敏感及对头孢曲松、奥复星、强力霉素和氯霉素中度敏感外，对大部分兽医临床用药都具有不同程度的耐药性。多年来一直用于治疗沙门氏菌病的青霉素、氨苄西林、强力霉素和复方新诺明等抗生素均呈现不同程度的耐药性，不应继续使用，这与 等（）报道的结果基本一致。分离菌株对卡那霉素、恩 诺 沙星 和诺 氟 沙星 低度 敏 感，与杨晓 辉等（）报道的不一致；对头孢噻肟较为敏感，而对氨苄西林耐药，与亢继俊等（）报道不同，这可能与各地区流行菌株不同和抗菌药物的使用不同有关。而对于禁止使用的氯霉素中度敏感，说明加强兽药管理对于减少耐药性产生具有一定意义。本试验结果表明，该地鸡沙门氏菌的耐药性很严重，其中 仅对强力霉素和氯霉素中度敏感；仅对奥复星和氯霉素敏感；、和 则对头孢曲松和头孢噻肟具有较高的敏感性。联合用药的目的在于扩大抗菌谱、减少用药量、增强疗效、降低或避免毒副作用及减少或延缓耐药性的产生，由表可知，诺氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、强力霉素和氯霉素种当前临床用药与痢菌净不具有协同或累加作用，建议不要将其配伍使用。因此，作者建议临床治疗沙门氏菌病时应根据本地区药敏结果合理选用抗生素。在饲养过程中限制滥用抗生素，减轻对细菌的选择性压力，延缓细菌产生耐药性的进程，同时采取交叉用药、轮换用药，以降低细菌产生耐药性几率。耐药菌株的出现将使临床治疗变得更加棘手，而过度用药则增加了生产成本，还会导致药物在禽肉产品中的大量残留，严重威胁着人类的健康。所以，进行地方性沙门氏菌分离鉴定，既可为免疫预防沙门氏菌病筛选出用以制作菌苗的地方性免疫原性优良的菌株，也可跟踪其变化趋势，为生物制药实验室对沙门氏菌耐药机理的研究奠定基础。参考文献亢继俊，宁官保，牛艺儒 麻鸡白痢沙门氏菌的分离鉴定和中药对其耐药性的消除作用中国兽药杂志，（）：邓树轩，程安春，汪铭书，等 沙门氏菌耐药机制研究进展 安徽农业科学，（）：申之义，李利萍，张庆华，等内蒙古地区鸡沙门氏菌病流行病学调查中国兽医杂志，（）：杨晓辉，杨增岐陕西关中地区鸡白痢现状调查动物医学进展，（）：罗玲，艾地云，杨峻，等鹌鹑沙门菌的分离鉴定动物医学进展，（）：郑启宏，朱兴贵，王红戟鸡沙门氏菌的分离与鉴定中国畜禽种业，：赵兴绪，王雯慧，伏小平，等畜禽疾病诊断指南北京：中国农业出版社，倪宏波，何宏轩，乔军预防兽医学检验技术吉林：吉林人民出版社，黄福标，卢冰霞，刘磊，等屠宰猪肠道沙门氏菌的分离鉴定、耐药性分析及致病性试验中国畜牧兽医，（）：廖成水，程相朝，吴庭才，等河南省鸡源沙门氏菌新近流行株的分离鉴定及其耐药性分析 第四届第十次全国学术研讨会暨动物微生态企业发展战略论坛（下册）中国畜牧兽医学会动物微生态学分会，（）：，（）：疾病防治中国畜牧兽医 年第 卷第期口蹄疫疫苗研究进展张元沛，李彦芹，王玲玲，高运东，仲跻峰（山东奥克斯生物技术有限公司，山东济南 ；山东省农业科学院奶牛研究中心，山东济南 ）摘要：口蹄疫是一种高度接触性和经济毁灭性传染病，疫苗接种是防控该病的主要措施。随着科学技术的进步，口蹄疫疫苗的研制在不断改进和发展，作者对口蹄疫疫苗的研究进展进行了综述。关键词：口蹄疫；疫苗；进展中图分类号：文献标识码：文章编号：（）口蹄疫（，）是一种高度接触性和经济毁灭性传染病，危害猪、牛、羊、鹿等包括野生动物在内的 多种偶蹄动物。自第一次在美国暴发以来，已经在全世界范围内多次暴发，的暴发虽不是毁灭性的，但它不但造成幼小动物死亡、成年动物生产能力及体重下降等，而且严重影响各国之间动物产品的贸易，因此，常被称为“政治病”和“经济病”。是由口蹄疫病毒（，）引 起的，目前已知的 有个血清型，包括、修回日期：作者简介：张元沛（），男，山东人，助理畜牧师，研究方向：遗传育种。通信作者：仲跻峰，研究员，从事动物遗传育种研究。：基金项目：国家奶牛产业技术体系建设专项经费（）。、和 ，个血清型之间无交叉免疫保护（殷震等，）。自 世纪以来，疫苗免疫已成为口蹄疫防控的最主要的手段。随着现代生物学技术的发展，口蹄疫疫苗的研制也在不断改进，从传统疫苗向新型疫苗发展，以期为 的防控提供一种安全有效的疫苗。文章对口蹄疫疫苗研究进展进行了综述。常规疫苗 弱毒疫苗弱毒疫苗是把原始毒经过生物媒介（如豚鼠乳鼠、乳兔、鸡胚、细胞等）驯化或人工诱变的途径获得减毒（致弱）毒株，加入一定的保护剂和佐剂制成的病毒制剂。年 发现接种于成年鼠脑内的病毒毒力致弱。此后，人们陆续在豚鼠、鸡胚及乳兔中获得致弱毒株，然而，年欧洲口蹄疫防治委员会停止了弱毒疫苗在欧洲的研究，并 规定停止使用弱毒疫苗（王明俊等，）。虽然櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅 ，（，；，；，；，）：，：；中国畜牧兽医 年第 卷第期疾病防治