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实验十三 螺旋体检测

一、临床意义
1、螺旋体(Spirochaeta)广泛分布在自然界和动物体内，分5个属：包柔氏螺旋体属（Borrelia），又名疏螺旋体属，密螺旋体属（Treponema），钩端螺旋体属（Leptospira），脊螺旋体属（Cristispira），螺旋体属（Spirochaeta）。前三属中有引起人患回归热、梅毒、钩端螺旋体病的致病菌，后二属不致病。
梅毒螺旋体（Treponema Pallidun）是人类梅毒的病原体，主要经性接触直接传染，也可通过接触污染物、手术、输血等途径传染。患梅毒的孕妇可通过胎盘感染胎儿，致胎儿流产、早产或患先天性梅毒。
人体感染梅毒螺旋体后，体内可产生多种抗体（抗类脂质抗体、抗梅毒螺旋体抗体等），其中一类是特异性制动抗体，为lgM，当有补体存在和厌氧条件下，对活螺旋体的动力有抑制作用，并可将螺旋体杀死或溶解，对机体的再感染有保护作用；另一类是反应素，为lgA与lgM的混合物，可与正常生物组织中的类脂抗原发生非特异性结合，对人体无保护作用。用血清学试验检测这些抗体，对诊断梅毒有意义。但梅毒血清学试验阳性，只能提示有反应素或抗梅毒螺旋体抗体存在，不能作为患者感染梅毒螺旋体的绝对依据，阴性结果也不能排除梅毒螺旋体感染，检测结果应结合临床综合分析。
用活的或死的梅毒螺旋体或其他成分作为抗原检查抗梅毒螺旋体抗体 这种方法敏感性及特异性都高，用于证实试验，尤其适用晚期梅毒。但血和脑脊液行RPR试验均为阴性者，由于这类方法检测的是抗梅毒螺旋体IgG抗体 即使患者已经经过充分的治疗 IgG抗体仍保持阳性，所以不能用以观察疗效、复发及再感染。 ①荧光密螺旋体抗体吸收试验(FTA-ABS试验)：用间接免疫荧光法检查血清中抗梅毒螺旋体抗体 ②梅毒螺旋体抗体微量血凝试验(MHA-TP)：用梅毒螺旋体提取物致敏的红细胞微量血凝分析法检查相应的抗梅毒螺旋体抗体 其滴度在1∶80以上则可判定为抗体阳性 此试验的特异性与敏感性均高 而且方法比FTA-ABS试验简便 故应用广泛 ③梅毒螺旋体制动试验(TPI)：活的梅毒螺旋体加入患者血清 在补体参与下 梅毒螺旋体活动可受到抑制
临床上主要采用RPR和TPHA 两种方法检测，RPR的敏感性和特异性均低于TPHA检测。这主要是由于RPR是非特异性试验，受某些自身抗体免疫疾病和传染病的影响，常常会出现假阳性. 同时，RPR试验对一期梅毒早期、治疗后梅毒及潜伏性梅毒往往出现假阴性 ，因此它的敏感性和特异性有一定的局限性，且肉眼判断易受检验者主观因素的影响。而TPHA检测特异性强，灵敏度高，并可实现自动化、标准化，适应大量标本的检测。

梅毒是由梅毒螺旋体引起的慢性感染性疾病。梅毒螺旋体可以通过接吻、哺乳、性接 触、胎盘或接触有传染性的患者的日常用品等方式而传染。在性传播疾病中，梅毒的患者 数相对较低，但由于其病程长，危害性大，早期检出具有一定的意义。获得性梅毒分三期： 第一期（初期）梅毒，下疳分泌物中有大量螺旋体，传染性极强；第二期梅毒，梅毒疹及淋巴 结中有大量螺旋体；第三期（晚期）梅毒，病灶中螺旋体数量很少。梅毒螺旋体在体外不易 培养，至今尚不能在无生命的培养基上生长，也不能用常规方法染色，可通过直接镜检和血 清中抗体进行实验室检测。实验室常用的检测方法有：梅毒螺旋体暗视野显微镜检查法， 非密螺旋体抗原试验（初筛试验）和梅毒螺旋体抗原试验（确证试验）等，不同的感染阶段应 选用不同的检测方法。

2、钩端螺旋体病是由钩端螺旋体所致的一种自然疫源性疾病。钩端螺旋体在自然界广泛存在，尤其是在降雨量多的热带国家，它可在淡水、潮湿的土壤、植物和淤泥存活很久，可感染人类、野生动物和家畜（尤其是啮齿目动物）。动物受感染后，大多无症状而呈带菌状态，但钩体可以在肾中长期存在并繁殖，从尿中排菌，污染水源、食物和土壤。人类若接触被钩体污染的水源、食物、土壤，钩体可经皮肤破损处、黏膜表面（譬如眼睛或鼻子）进入人体，引起钩体病，大雨后的洪水有助将细菌在周围环境传播，但一般不会在人与人之间传播。
　　疾病潜伏期是2天到4个星期。病情可持续几天到3个星期或更久。征状包括发高烧、严重头痛、冷颤、肌肉疼痛和呕吐，亦可能出现黄疸(眼球和皮肤呈黄色)、红眼、肚痛、腹泻或出疹。如果病人不及早接受治理，可能会出现肾脏损伤、脑膜炎、肝脏功能衰竭和呼吸困难；有些罕见的例子更会导致死亡。

二、螺旋体的检验程序

（一）梅毒螺旋体检验程序

渗出液、皮疹、淋巴结或组织穿刺液等

直接镜检 镀银染色检查 血清学检查

暗视野检查

图13-1 梅毒螺旋体检验程序

（二）钩端螺旋体检验程序

血液、尿液、脑脊液等

直接镜检 分离培养 动物接种（豚鼠） 血清学检查
观察发病情况

暗视野检查 镀银染色检查 抽心血 显微镜凝集试验等

暗视野检查

图13-2 钩端螺旋体检验程序

三、试验目的要求（题前空二格，五号宋体加粗）

1．熟悉梅毒螺旋体、钩端螺旋体的形态特征、暗视野及其染色检查方法。
2．掌握梅毒螺旋体的血清学筛选和证实试验的原理、方法、临床意义。
3．熟悉钩端螺旋体的培养特性、分离培养方法。
4．了解钩端螺旋体显微镜凝集试验原理、方法、结果判定。

四、器材与试剂（题前空二格，五号宋体加粗）
1．培养基：柯氏（Korthof）培养基、含100～400μg/ml 5-氟尿嘧啶（5-Fu）的柯氏培养基等。
2．试剂：与上述菌种同型的钩体抗血清。RPR试剂盒、FTA-ABS试剂盒、ELISA试剂盒等。冯泰那（fantana）镀银染色液，负染色液(2%刚果红、1%盐酸酒精)。
3．其他：暗视野显微镜、无菌吸管、荧光显微镜、水浴箱、载玻片等。载玻片、牙签、生理盐水、暗视野显微镜等。暗视野显微镜、试管、吸管、滴管、载玻片、盖玻片、生理盐水、火柴、酒精灯、接种环、记号笔、吸水纸、擦镜纸、二甲苯、香柏油等。
4．已知血清型的钩瑞螺旋体液体培养物。

五、步骤与方法（题前空二格，五号宋体加粗）（标题层次详见编写须知）

（一）采集标本：
1、Ⅰ期梅毒患者取硬下疳溃疡渗出液，Ⅱ期梅毒取梅毒疹渗出液或局部淋巴结抽出液，用于直接镜检。
2、疑似钩体患者血，尿标本；发病10日内取血液，2周后取尿液，有脑膜刺激症状者取脑脊液。
3、采集病人静脉血液，分离血清进行血清学诊断

（二）染色及形态观察
螺旋体细长、柔软、弯曲呈螺旋状的运动活泼的单细胞原核生物。全长3～500微米，具有细菌细胞的所有内部结构。由核区和细胞质构成原生质圆柱体，柱体外缠绕着一根或多根轴丝。轴丝的一端附着在原生质圆柱体近末端的盘状物上，原生质圆柱体和轴丝都包以外包被，轴丝相互交叠并向非固着端伸展，超过原生质圆柱体，类似外部的鞭毛，但具外包被。
在生物学上的位置介于细菌与原虫之间。它与细菌的相似之处是：具有与细菌相似的细胞壁，内含脂多糖和胞壁酸，以二分裂方式繁殖，无定型核（属原核型细胞），对抗生素敏感；与原虫的相似之处有：体态柔软，胞壁与胞膜之间绕有弹性轴丝，借助它的屈曲和收缩能活泼运动，易被胆汁或胆盐溶解。在分类学上由于更接近于细菌而归属在细菌的范畴。
用暗视野显微镜观察含活菌的新鲜标本，可看到运动活泼的螺旋体。运动有三种类型：绕螺旋体的长轴迅速转动、细胞屈曲运动以及沿着螺旋形或盘旋的线路移动。横断分裂繁殖；化能异养；好氧、兼性厌氧或厌氧；自由生活、共栖或寄生。
1、梅毒螺旋体形态观察：
（1）原理：依据梅毒螺旋体的生物学基本特征。梅毒螺旋体（Treponema Pallidun）是梅毒的病原体，因其透明，不易着色，故又称苍白螺旋体。
梅毒螺旋体细长，5～15×0.1～0.2um，形似细密的弹簧，螺旋弯曲规则，平均8～14个，两端尖直。电镜下显示梅毒螺旋体结构复杂，从外向内分为：外膜（主要由蛋白质、糖及类脂组成）、轴丝（主要由蛋白质组成）、圆柱形菌体（包括细胞壁、细胞膜及胞浆内容物）；一般染料不易着色。梅毒螺旋体有生活发育周期，分为颗粒期、球形体期及螺旋体期，平均约30小时增殖一代，发育周期与所致疾病周期、隐伏发作及慢性病程有关。
未经染色的梅毒螺旋体在普通光学显微镜下不易看清，如将显微镜换装上特制的暗视野集光器，该集光器中央不透光，光线只能从周围边缘斜射出来，由反光镜庋射的光线不能直接上升进入镜筒，故背景黑暗无光，但斜射到菌体上的光线由于散射作用进入物镜，即在暗视野显微镜下，黑暗的视野上可看到具有螺旋状及特征性运动方式发光的螺旋体。

（2）方法 取渗出液涂片后直接于暗视野显微镜下观察，或采取初期及二期梅毒硬性下疳、梅毒疹的渗出物等用暗视野或墨汁显影，如查见有运动活泼的密螺旋体即可诊断；或镀银染色镜检。
①暗视野显微镜观察法
1）制作玻片：先在玻片上加无菌盐水1滴，用无菌盐水棉球擦净病变部位，用钝刀刮破病损处表面组织（避免出血），再用棉球擦干挤压周围组织使组织液渗出，用毛细管吸取下疳的渗出液，将组织渗出液与玻片上无菌盐水混合，加盖玻片后镜检。取自皮疹、淋巴结或组织穿刺液等也可用于检查，但阳性率较低。
2)打开暗视野显微镜，在聚光器上加一滴蒸馏水（湿式）。
3)将玻片置于载物台上。
4)上升聚光器使蒸馏水接触玻片的底部，先用低倍镜调焦，再用高倍物镜观察。
②冯泰那镀银染色法：取玻片于中央加生理盐水1滴，用牙签取样本少许与盐水混匀做涂片；待涂片干燥后滴加固定液，固定1分钟后，用水冲洗；滴加媒染剂加热至有蒸汽出现，作用0.5分钟，水洗；加硝酸银染液，微加温，染色约0.5分钟，水洗，待干镜检。
③刚果红染色法（负染色法）：置2%刚果红水溶液一小滴于载玻片上，用牙签取样本与之混匀，涂布成均匀厚片，待干，以1%盐酸酒精洗涤，待其自然干后镜检。

（3）结果判定
在暗视野显微镜下，如有发光的典型螺旋状螺旋体及特征性运动方式（旋转运动、伸身移行、弯曲前行）为阳性结果。直接镜检适用于初期梅毒的检查，如见形态特征典型，有特殊运动方式的密螺旋体，结合临床症状及病史，可初步报告：“找到弹簧状螺旋体（疑为梅毒螺旋体）”。直接涂片镜检可见梅毒螺旋体移行、屈伸、翻滚等运动方式。
镀银染色可见背景呈淡黄褐色，梅毒螺旋体呈棕褐色，菌体小而纤细，中间略粗，两端尖直，有8～14个规则的、紧密缠绕的螺旋。
经冯泰那镀银染色，形态为疏螺旋体，即在油镜下梅毒螺旋体呈棕褐色或棕黑色，菌体直硬、两端尖直，螺旋较细密而规则。经刚果红染色法，螺旋体无色，背景为蓝色。螺旋体显微镜下形态见表13-1。

2、钩端螺旋体形态观察：
（1）原理：依据钩端螺旋体的生物学基本特征。渡银染色的钩端螺旋体镜下背景呈淡黄褐色，钩端螺旋体经渡银染色后呈棕褐色，菌体如小珍珠般连接成的细链，一端或两端弯曲如钩状，使菌体呈S或C形。在黑暗的背景中可见钩体闪烁发光，一端或两端弯曲成钩状，运动活泼，呈现翻转、滚动等运动特征。
（2）方法
①钩端螺旋体暗视野显微镜观察
1)取钩钩端螺旋体培养物制成压滴标本。
2)在暗视野聚光器上滴加镜油，将标本片置载物台上，上升聚光器使镜油与标本片紧密接触。先用低倍镜对光，至能清楚观察到标本中的物体为止。然后在标本上滴加镜油。用油镜观察。
②钩端螺旋体fantana镀银染色检查
1)取清洁玻片一张，加钩端螺旋体培养物一滴。
2)待涂片自然干燥后滴加固定液，固定1min，用无水乙醇冲洗。
3)滴加媒染剂，加温至有蒸汽冒出，作用30s，水洗。
4)加硝酸银染液，微加温，染色约30s，水洗，待干镜检。
③钩端螺旋体负染色法（刚果红法）检查取20%刚果红水溶液一滴于载玻片上，加钩端螺旋体培养物与之混匀，涂布成均匀厚片，待干，以1%盐酸酒精洗涤冲洗至蓝色，待其自然干后镜检。
（3）结果观察
①镀银染色结果的形态特征：镜下背景为淡黄褐色，钩端螺旋体呈棕褐色或棕黑色，一端或两端呈钩状弯曲，呈S或C形，细密的螺旋看不清楚。
②暗视野显微镜观察结果 在黑的背景上，可见钩体像一串发亮的微细珠粒，一端或两端弯曲成钩状，有时菌体屈曲呈“S或C”等字型，以长轴为中心，做回旋运动，或以波浪式朝直端方向前进。
③负染色法（刚果红法）结果 油镜下钩端螺旋体无色，背景蓝色。

表13-1 螺旋体显微镜下形态

冯泰纳镀银染色
吉姆萨染色
暗视野显微镜观察
钩端螺旋体
镜下背景为淡黄褐色至棕黑色，菌体为棕褐色，一端或两端呈钩状弯曲，珍珠点状连接成S或C形螺旋体，螺旋不太清楚，表体整齐，粗细均匀

取钩端螺旋体培养物制成压滴标本，在黑暗的背景上可见钩体闪烁发光，一端或两端弯曲成钩状，运动活泼，出现翻转、滚动等运动。
梅毒螺旋体
与钩端螺旋体呈色相似。其特征为小而纤细，两端尖直，有8～12个规则弯曲且缠绕紧密。

回归热螺旋体

螺旋体为紫红色或红色，纤细柔软，有4～8个稀疏而不规则弯曲。

（三）分离培养
1981年，Fieldsteel等采用棉尾兔单层上皮细胞，在微氧条件下培养成功，在人工培养基上尚不能培养。
梅毒螺旋体一般不进行培养，钩端螺旋体分离培养方法如下：
（1）血液标本的培养 采集可疑钩端螺旋体病人发病第一周内的静脉血液2～3ml，取血液标本0.25～0.5ml接种于5ml的柯氏（ Korthof）液体培养基中，血液量与培养液的比例以1: 10～1：20为宜。
（2）尿液标本的培养 采集可疑钩端螺旋体病人发病第一周后（发病2～5周内）的尿样（无菌尿或中段尿），立即接种或者经低温离心（10℃、4000r/min离心30min）后，取沉淀物接种于5-Fu的柯氏液体培养基（培养基中的5-Fu可抑制尿液中的杂菌）。
3）培养：每份标本应接种2～3管平行样，将培养基置28℃恒温箱培养1～2周。

(4)结果观察：从分离培养的第三天起，每天或每隔3～5天，用暗视野显微镜检查一次；大部分阳性标本可在7～14天有生长表现（一般在培养的第7～10天为繁殖高峰）。
如果培养基液面部分呈现出半透明、云雾状混浊，轻轻摇动可见絮状物泛起，则疑为钩端螺旋体生长，可进一步进行鉴定；若培养四周无钩体生长，则为阴性。

（四）血清学检验
1、梅毒螺旋体的血清学诊断
（1）原理 梅素螺旋体有三类抗原成份。一是螺旋体表面特异性抗原：刺激机体产生特异的凝集抗体及密螺旋体制动或溶解抗体，后者加补体可溶解螺旋体。二是螺旋体内类属抗原：可产生补体结合抗体，与非病原性螺旋体有交叉反应。三是螺旋体与宿主组织磷脂形成的复合抗原：当螺旋体侵入组织后，组织中的磷脂可粘附在螺旋体上，形成复合抗原，此种复合抗原可刺激机体产生抗磷脂的自身免疫抗体，称为反应素（Aegagin），可与牛心肌或其他正常动物心肌提取的类脂质抗原起沉淀反应（康氏试验）或补体结合反应（华氏试验）。其中，第一类是特异性抗体（抗TP抗体），后两类为抗类脂质的非特异性抗体。
（2）方法
①快速血浆反应素环状卡片试验（RPR）：是利用吸附于活性炭颗粒上的类脂质抗原（由从牛心肌中提取的心磷脂、胆固醇和卵磷脂组成的RPR抗原，与梅毒螺旋体有共同抗原），可与患者血清中的反应素结合，出现凝集现象。（当血清在RPR卡片的圆圈中混合，如出现碳粒凝集说明是阳性血清）。
此类试验采用的抗原是非特异性类脂质，检测成本低，简易快速，不需显微镜，可进行半定量检测，易于观察结果，适合于大量人群的血清筛选。但敏感性、特异性较差，有时会出现生物学假阳性和假阴性反应，容易造成漏检和误检，所以不用于一期梅毒、先天性梅毒、神经梅毒的诊断。目前，国内常用RPR和TRUST这两种试验。根据情况选用其中一个进行梅毒螺旋体抗体筛选试验。
1）取待检血浆或血清、阳性控制血清、阴性控制血清各50μl，分别加入到卡片的三个圆圈内，并使血清扩散到整个圆圈内。（每张卡片应有10个或12个反应圈）
2）在每份血清上滴加1滴RPR抗原。
3）旋动卡片8min（约100r/min），立即观察结果。
4）在RPR白色卡片上观察有无黑色凝集颗粒或絮片。无凝集为阴性结果（阴性血清反应圈内不出现黑色碳颗粒凝集），出现明显黑色凝集颗粒或絮片为阳性（阳性血清反应圈内可出现明显黑色凝集碳颗粒或絮片）。
定性试验呈阳性的标本，如需要可将血清作1:2～1:32等6个稀释度的倍比稀释，然后按上述定性试验方法再做半定量试验，再记录出现阳性（+）反应的最高血清稀释倍数，即抗体效价。

②甲苯胺红不加热血清试验( TRUST)：是将从牛心肌中提取的心磷脂、胆固醇、卵磷脂组成的性病研究室抗原重悬于含有特制的甲苯胺红溶液制成，可与血清中的抗类脂质抗体反应素结合，出现肉眼可见的凝集块。该试验为筛选试验。
操作方法：按试剂盒说明书进行。
（1）取待检血清、阳性控制血清、阴性控制血清各50μl，加入试验卡的圆圈内，并扩散到整个圈内。
（2）在每份血清上滴加1滴抗原试剂。
（3）旋转摇动8min，速度约lOOr/min，立即用肉眼观察结果。
（4）甲苯胺红不加热血清试验结果 在试验卡上，阴性质控血清反应圈内不出现红色凝集，呈均匀分散状态。阳性质控血清反应圈内可出现明显红色颗粒凝集成快。参照质控血清即可判断患者血清的试验结果。
如果试验为阳性，可在试验卡上将血清作1:2～1:32等6个稀释度，然后按上述试验方法再做半定量试验。
这两种试验（RPR和TRUST）是非螺旋体抗原试验。是用正常牛心肌的心类脂（Cardiolipin）作为抗原，检测病人血清中的反应素。国际上常用性病研究实验室（UDRL）的玻片试验法；该法是一种简单的玻片沉淀试验，试剂及对照已标准化。另外，还可用不加热血清反应素试验（USR），其抗原是UDRL抗原的改良，敏感性和特异性与UDRL相似。反应素在第一期梅毒病变出现后1～2周就可测出，第二期阳性率几乎达100，第三期阳性率较低。虽敏感性较高，但所用抗原是非特异性类脂抗原，除梅毒病以外，其他螺旋体病（雅司、回归热）、麻风、红斑狼疮、非典型肺炎、类风湿关节炎、肝硬化等亦可查出反应素，称梅毒血清生物学假阳性。检测的抗体时应排除假阳性反应，结合病史，临床表现及多次的试验结果进行分析。
为进一步确证梅毒的感染，需做如下血清学检验。即以梅毒螺旋体为抗原，以检测血清中的特异性抗体，该试验特异性高，目前常用下述两种方法。一种是梅毒螺旋体明胶颗粒凝集试验（TPPA）、一种是荧光密螺旋体抗体吸收试验（FTA～ABS），其敏感性和特异性均高，常用于梅毒的早期诊断。
③明胶颗粒凝集试验（TPPA）：
(1)原理 将梅毒螺旋体Nichols株的精制菌体成分包被于人工载体明胶颗粒上，这种致敏的颗粒一旦与被检查样品中的抗梅毒抗体相遇时，即可产生肉眼可见的凝集颗粒（particle agglutination test ,PA法）。由此可以检测人血清或血浆中的梅毒螺旋体特异性抗体，并且可用来测定抗体效价。
(2)方法 按试剂盒说明书进行。定性试验只做4孔，半定量试验做10孔（表13-2）。
1）用微量加样器加标本稀释液至反应板。
2）用微量加样器加待检血清至第1孔，混匀后进行倍比稀释。
3）用试剂盒内专用滴管于第3孔加未致敏粒子25μl，第4孔至最后一孔加致敏粒子25μl。
4）将反应板置震荡器震荡30s，或用手轻轻拍打混匀。
5）加盖后于室温(18～25℃)水平静置，2h～4h后观察结果。
表13-2 TPPA试验操作程序表
孔号_ _ __1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
标本稀释液（μl） 100 25 25 25 25 25 25 25 25 25
待检血清（μl） 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25弃25
标本稀释倍数 1:5 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560
未致敏粒子(μl) 25
致敏粒子（μl） 25 25 25 25 25 25 25
标本最终稀释度 1:40 l:80 1:160 1:320 l:640 1:1280 1:2560 1:5120
6）明胶颗粒凝集试验结果 血清在1：80以上稀释度与致敏颗粒发生凝集反应（++～++++）与未致敏颗粒（第3孔）不发生凝集反应者为阳性反应；血清与致敏颗粒和未致敏颗粒均不发生凝集反应者为阴性反应。
-（不凝集）：明胶颗粒集中在孔中央，呈纽扣状，边缘光滑；
±（可疑）：明胶颗粒浓集呈边缘光滑、圆整的小圆环：
+（凝集）：明胶颗粒形成较大的环状凝集，外周边缘不光滑：
++～++++（强凝集）：明胶颗粒覆盖在整个孔底，呈多形性膜状，边缘粗糙。
阳性结果判定：第三孔为阴性（-）、第四孔为阳性(+～++++)时，以显示反应为阳性(+)时的血清最高稀释倍数作为抗体效价。
阴性结果判定：无论第三孔呈现何种反应，只要第四孔的反应显示为阴性（-），最终判断即为阴性。
可疑：第三孔为阴性（-）、第四孔为可疑(±)时，最终判断为可疑。结果为可疑时，需要用FTA—ABS等其他方法进一步复检。
④荧光密螺旋体抗体吸收试验（FTA-ABS）：此法是间接荧光抗体法，将待检血清先用非致病性密螺旋体进行吸收，除去能与梅毒螺旋体发生非特异性结合的抗体成分。经吸收处理的血清，在玻片上与梅毒螺旋体抗原结合，再加入荧光素标记的抗人IgG抗体，于荧光显微镜下观察，若有发荧光的螺旋体即为阳性。
方法：
1）制备抗原片 用Nichols株梅毒螺旋体（每高倍镜视野20条）抗原悬液，在玻片上涂数个直径为5mm的菌膜，待干后用甲醛（醇）固定。
2）待检血清预处理：待检血清先经56℃30min灭活，取50μl血清与200μl吸附剂（Reiter株非致病性密螺旋体）混匀，37℃作用30min，以充分吸除非特异性抗体。
3）荧光染色 吸附后的待检血清用PBS液作1:20～1:320的倍比稀释，将已稀释的血清分别滴加于抗原片上，置于湿盒内37℃作用30min，然后将玻片在PBS液中浸洗，换液3次，每次5min，吸水纸吸干。于各抗原反应片上滴加荧光素标记的羊抗人IgG抗体，置湿盒内37℃作用30min，再用PBS液洗片（方法如前），待玻片干后用甘油缓冲液封片。
试验同时，应设阳性、阴性及非特异性血清对照。阴性标准血清无荧光菌体或偶见荧光菌体出现；阳性对照可见多数（高倍视野15条）荧光菌体出现。并以此为参照作出待检标本的判定。
4）观察结果 将染色片置于荧光显微镜下，荧光密螺旋体抗体吸收试验（FTA-ABS）参照阳性标准血清的荧光强度判定结果。每高倍镜视野若半数（10条左右）出现荧光，则为++；多于半数（15条左右）出现荧光，则为+++；全部（约20条）出现强荧光，则为++++。“可疑”结果参照非特异性血清的荧光强度判定为++或+，阴性结果参照阴性对照血清判定为-或+。凡++～++++者，可确证为梅毒螺旋体感染。
⑤酶联免疫吸附试验（ELISA）：采用双抗原夹心法。将高度纯化的TP抗原包被反应板之后加入待测血清，若待测血清中存在TP抗体，则与TP抗原特异性结合。再加入酶标记的高纯度TP抗原，即在固相载体上形成“TP抗原-抗TP抗体-酶标记TP抗原”夹心复合物，当加入酶底物后，可呈现颜色反应。颜色深浅与血清中抗TP抗体成正比。
方法：
1）分别取待测血清、阴性及阳性对照血清各50μl，加于反应板相应凹孔中；每孔再加入酶标记TP抗原各50μl。混匀，放37℃30min。
2）取出反应板，弃尽孔中液体。用洗涤液洗板6次，拍干液体。
3）与每孔加酶底物各100μl，放37℃15min后，加终止液50μl。
4）用酶联仪于450nm波长处读取吸光度值（A），以空白校零。分别测定阴性、阳性对照及待测血清的A值。
结果 酶联免疫吸附试验（ELISA） 待测血清A值≥CO值，为阳性；待测血清A值＜CO值，为阴性。CO=0.20 + 阴性对照平均A值。阴性对照A值应≤0.12，阳性对照A值应≥0.30；阴性对照＜0.03时按0.03计算。
⑥梅毒螺旋体制运试验（TPI）：用来检测血清中是否存在抑制螺旋体活动的特异性抗体。用活梅毒螺旋体（Nichol株）加病人新鲜血清，35℃培养16小时，同法作正常血清对照，然后用暗视野显微镜观察活动的螺旋体数目，如试验标本活动的螺旋体数目小于或等于对照血清标本内的40%，即为阳性。
2、钩端螺旋体血清学检验
（1）原理：钩端螺旋体可与同型免疫血清结合产生凝集现象。当血清高倍稀释时，镜下可见钩体呈蜘蛛样凝集（数根钩体的一端钩连在一起，另一端呈放射状散开）；当血清作低倍稀释时，血清中的补体可导致凝集的钩体溶解破坏（血清中的补体使凝集的菌体在数分钟内发生溶解），因而镜下见钩体呈残絮状、颗粒状、蝌蚪状。本试验既可鉴定钩体的型别，又可用于测定病人血清中特异性抗体的效价。
（2）方法 微孔板法显微镜凝集试验
1）稀释血清：用生理盐水将病人血清稀释为1:50、1:100、1:150、1:200、1:400、1:800等，依次加入微孔板每排的1～6孔，100μl/孔，第7孔加100μl生理盐水作为对照；所设稀释血清排数依标准株钩体型的数目而定。
2）加抗原：于每排各孔内分别加入一种已知不同型别的钩体培养液，100μl/孔。混匀后置37℃作用2h。
3）结果判断 反应结束后，取出微孔板，用毛细管取各孔中悬液1滴于洁净载玻片上，覆以盖玻片，在暗视野显微镜下观察，以凝集情况与游离活动钩体的比例来判定结果。
-：钩体正常分散存在，完全无凝集现象，与对照孔相同。
+：25%左右的钩体凝集呈蜘蛛状，75%的钩体游离且运动活泼。
++：50%左右的钩体凝集呈蜘蛛状，余50%的钩体游离且运动活泼。
+++：75%左右的钩体凝集或被溶解，呈蜘蛛状、蝌蚪状或块状，其余钩体游离分散。
++++：几乎全部钩体溶解成蜘蛛状或折光率较高的团块及点状，偶见极少活钩体游离。
血清效价按最终血清稀释度计算。以出现++现象的最高血清稀释度为该血清的凝集效价。凝集效价在1:300以上有诊断价值。根据待检菌与相应型别血清发生凝集反应效价则可判定待检菌的型别显微镜凝集试验方法见表13-3
表13-3 显微镜凝集试验方法

1
2
3
4
5
6
7
血清稀释度
1﹕50
1﹕100
1﹕150
1﹕200
1﹕400
1﹕800
对照
被检血清（μl）
100
100
100
100
100
100
—
生理盐水（μl）
—
—
—
—
—
—
100
钩体培养液（μl）
100
100
100
100
100
100
100
血清最终稀释度
1﹕100
1﹕200
1﹕300
1﹕400
1﹕800
1﹕1600
—
37℃作用2h，暗视野显微镜观察结果
假定结果
4+
4+
3+
3+
2+
+
-

（六）注意事项与小结
1、使用暗视野显微镜观察时，需注意：①载玻片和盖玻片应清净无污，载玻片宜薄，不超过1.2mm；②聚光器的高度应适当，以背景较暗物象清晰为好；③观察完毕后将集光器上的镜油拭净；④进行镀银染色时，银染温度不宜太高，时间不宜太长，否则会影响染色结果；⑤应多取组织液提高阳性率，但要尽量避免出血；⑥取材后应立即观察，以免影响螺旋体的运动活力；⑦注意观察梅毒螺旋体的形态及特有的运动姿态，以鉴别其他螺旋体；⑧暗视野未发现梅毒螺旋体，不能排除梅毒感染，应稍后复查或做血清学检查；⑨此法主要适用于初期梅毒的检查，因患者下疳分泌物中有大量螺旋体。
2、RPR和TRUST试剂盒勿冰冻，于2～8℃保存，使用前恢复至室温；RPR抗原用时应充分摇匀后垂直滴加；在规定时间内及时观察结果。本试验仅为过筛试验，阴性结果不能排除梅毒感染，阳性结果需进一步做抗梅毒螺旋体抗体试验确认。
3、FTA-ABS荧光染色洗片时，每浸洗1次后，必须换液；每次试验均应同时设阳性、阴性及非特异性血清对照。
4、ELISA血清标本应新鲜、无污染；加入试剂力求准确，一般用微量加样器加样；反应板洗涤必须充分、彻底，以免影响判定结果；结果测定应以酶联仪读数为准。
5、试验所用标本、试剂及废弃物应按生物危险品进行处理。
6、由于各种梅毒血清学检测方法，并非都能在梅毒的不同病期检测出抗类脂质抗体或抗梅毒螺旋体抗体，为提高检出率，最好每次用2种以上的方法。
7、甲苯胺红不加热血清试验是非特异性抗原试验，故试验阳性时，应注意排除生理性（孕妇可有0. 4%假阳性）和急、慢性生物学性假阳性的可能，如自身免疫病（麻风、红斑狼疮、类风湿患者等）会出现假阳性。另外，某些急性发病后（风疹、水痘、肺炎等）以及免疫接种，也可出现暂时性假阳性。一般来说患者血清滴度在1：8以上是梅毒的可能性大，低于1：8时，应考虑到上述疾病的可能，并应用特异性试验加以证实。
9、梅毒螺旋体明胶颗粒凝集试验尽管敏感性高、特异性强，是梅毒诊断较好的确证试验，但据统计，也可有1%生物学假阳性存在，如红斑狼疮、传染性单核细胞增多症、麻风患者等的特异性试验有的也可呈阳性，诊断时要结合临床病史。（1）IPPA反应板要清洁干净，孔内无异物，以避免假阳性。要用U形板，不能用V形板；（2）试验温度适宜15～25℃；(3)试剂盒不可置0℃以下以防止冻结，不同批号试剂间不可混合使用；（4）如未致敏细胞出现凝集反应，应做重吸收试验或改用其他确诊试验方法；（5）TPPA试验阳性患者，由于记忆细胞抗体复制能力强，特异性试验敏感性高，即使经抗梅毒治疗也终生阳性，因此不能作为治疗效果观察的指标；但根据临床观察，早期梅毒患者血清如TPPA试验为弱阳性反应，随时间延长可能转阴；（6）特异性试验对一期梅毒可比非特异性试验早1周出现。梅毒过程中最初出现的是IgM抗体，梅毒感染后第2周即可从血清验阳性，则可作梅毒诊断依据，必要时做定量试验。经有效治疗后特异抗体滴度也可不同程度下降，但转阴机会甚少。
10、试验操作时严格按说明书进行。试剂盒从冰箱中取出后需先在室温平衡，试验应在23～29℃条件下进行。不同批试剂组分不得混用。待检血清要新鲜、无污染。每次实验都需要做阳性和阴性对照。试剂盒应按含有传染性材料对待。
11、钩端螺旋体传染能力强，检验时应严格遵守消毒隔离原则，防止实验室感染。
12、分离培养时，若连续培养40天仍未发现生长，方可报告阴性。①患者发病7～10日内取血液，两周后取尿液，有脑膜刺激症状者取脑脊液；②钩端螺旋体生长缓慢，其生长过程中需要注意不被杂菌污染；③钩端螺旋体对理化因素的抵抗力较其他致病螺旋体强，在湿土或水中可存活数周或数月，故其分离培养过程中需要严格无菌操作，防止对环境的污染。
13、血液培养时，为避免血液中抗体等因素的抑制作用，多采用小剂量接种。但接种量越小，阳性培养率越低，一般血液与培养液的比例以1︰10～1︰20为宜。
14、钩端螺旋体显微镜凝集试验特异性较高，能区分群、型，但钩端螺旋体型群较多，各地流行株不止一种也不尽相同，因此，在作为流行病学调查时，常用非致病的水生双曲钩端螺旋体帕托克株作为广谱抗原测定抗体进行初筛，然后对阳性者再用当地流行菌株进一步确定群、型。
15、进行钩端螺旋体分离培养鉴定时，要根据患者发病时间采集不同类型的标本，发病1周内采集血液标本，发病2周要用尿标本，否则会影响检测结果，出现假阴性。

（刘永华）