分子印迹SPR传感器用于骆驼奶粉中β-乳球蛋白的检测.pdf

文章编号：1008-9357(2023)04-0349-09DOI:10.14133/ki.1008-9357.20230321001分子印迹 SPR 传感器用于骆驼奶粉中-乳球蛋白的检测申永帅，胡子凡，朱良宇，王雨晨，何康，王延梅（中国科学技术大学高分子科学与工程系,合肥230026）摘要：结合模板分子前定位、表面印迹法和后修饰策略，在金（Au）基底上构建了分子印迹表面等离子体共振（SPR）传感器，并将其用于骆驼奶粉中-乳球蛋白（BLG）的检测。首先在聚多巴胺（PDA）修饰的金片（PDA/Au）上，通过巯基封端的聚丙烯酸（PAA-SH）固定模板分子 BLG，以多巴胺为功能单体和交联剂进行印迹；然后在非印迹部分接枝具有抗蛋白质吸附功能的部分水解聚（2-甲基-2-噁唑啉）（PMOXA-EI），洗脱模板后，得到 BLG 分子印迹 SPR 传感器。采用水接触角（WCA）研究了传感器表面亲/疏水的变化，用傅里叶变换红外光谱仪（FT-IR）、原子力显微镜（AFM）、可变角光谱椭偏仪（VASE）对其进行表征。结果表明，该传感器对 0.2110g/mL的 BLG 具有良好的线性关系，检测限为 0.12g/mL，能快速灵敏地检测出骆驼奶粉中 BLG 的质量浓度，回收率为 100.2%100.7%。关键词：-乳球蛋白；多巴胺；分子印迹；SPR 传感器；聚(2-甲基-2-噁唑啉)中图分类号：O64文献标志码：AMolecularly Imprinted SPR Sensor for Detection of-Lactoglobulin inCamel Milk PowderSHENYongshuai,HUZifan,ZHULiangyu,WANGYuchen,HEKang,WANGYanmei（DepartmentofPolymerScienceandEngineering,UniversityofScienceandTechnologyofChina,Hefei230026,China）Abstract:Combinedwithtemplatemolecularpre-positioning,surfaceimprintingmethod,andpost-modificationstrategy,amolecularlyimprintedsurfaceplasmonresonance(SPR)sensorwasconstructedonagoldsubstrateandusedfordetectionof-lactoglobulin(BLG)in camel milk powder.Firstly,the template molecule BLG was fixed by mercapto-terminatedpolyacrylicacid(PAA-SH)onthegoldsubstratewhichwasmodifiedbypolydopamineinadvance.Thenimprintingwasperformedusingdopamineasfunctionalmonomerandcrosslinkingagent.Finally,partiallyhydrolyzedpoly(2-methyl-2-oxazoline)(PMOXA-EI)with anti-protein adsorption function was grafted on the non-imprinted part,and the BLGmolecularly imprinted SPR sensor was prepared after eluting the template.The changes of sensor s surfacehydrophilicity/hydrophobicitywerestudiedbywatercontactangle(WCA)andthecharacterizationofcreatedsensorwasperformed by Fourier transform infrared spectrometer(FT-IR),atomic force microscopy(AFM),and variable angle收稿日期：2023-03-21基金项目：国家自然科学基金(21674102)作者简介：申永帅（1993），男，河北邯郸人，硕士，主要研究方向为分子印迹聚合物涂层。E-mail：通信联系人：王延梅，E-mail：引用格式：申永帅,胡子凡,朱良宇,王雨晨,何康,王延梅.分子印迹 SPR 传感器用于骆驼奶粉中-乳球蛋白的检测 J.功能高分子学报，2023，36（4）：349-357.Citation：SHENYongshuai,HUZifan,ZHULiangyu,WANGYuchen,HEKang,WANGYanmei.MolecularlyImprintedSPRSensorforDetectionof-LactoglobulininCamelMilkPowderJ.JournalofFunctionalPolymers,2023,36（4）:349-357.Vol.36No.4功能高分子学报2023年8月JournalofFunctionalPolymers349spectroscopyellipsometry(VASE),respectively.Resultsshowthatthesensorperformsagoodlinearrelationshipintherangeof0.2110g/mLforBLG,andthedetectionoflimitis0.12g/mL.ThesensorcoulddetecttheBLGincamelmilkpowderquicklyandsensitivelywitharecoveryratebetween100.2%and100.7%.Key words:-lactoglobulin；dopamine；molecularimprinting；SPRsensor；poly(2-methyl-2-oxazoline)-乳球蛋白（BLG）是牛奶中的主要过敏原1,2，其质量浓度超过 0.1mg/mL 就会引发过敏反应3。骆驼奶不含 BLG4,5，所以对牛奶过敏人群可将骆驼奶及其制品作为牛奶的主要替代品。然而，由于骆驼奶产量低、价格高6,7，因此在骆驼奶中掺入牛奶的现象时有发生8，这不但影响到其相应的奶制品如骆驼奶粉的质量，同时还会对牛奶过敏人群的健康造成严重威胁9。BLG 可作为检测骆驼奶粉中是否添加牛奶的生物标记物。已报道的 BLG 检测方法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）10、高效液相色谱（HPLC）11和毛细管电泳（CE）4等。然而，上述方法存在样品前处理复杂、分析时间长或试剂昂贵等缺点。因此，开发一种简单、快速且有效的 BLG 检测方法具有重要意义。表面等离子体共振（SPR）技术是一种光学分析技术，它通过被分析物与传感器表面相互作用时折射率的变化12，测量被分析物在传感器表面的质量变化。SPR 传感器因具有测量速率快、灵敏度高、无需标记等优点13已被用于 BLG 的检测。Wu 等14将 BLG 单克隆抗体固定在 SPR 传感器上，使用 SPR 检测与抗体结合的 BLG，然后使用多克隆抗体，通过夹心测定法来提高检测灵敏度，检测限（LOD）为 5.54ng/mL。Ashley 等15将 BLG 多克隆抗体固定在 SPR 传感器表面，利用抗体对 BLG 的抗体亲和力直接检测 BLG，LOD 为 0.164g/mL。然而，SPR 通常需要特定的生物受体（例如抗体）来检测蛋白质，这些受体既昂贵又不稳定16。分子印迹是一种用于制备具有特定结合位点的人工受体技术。在模板存在下，将功能单体和交联剂共聚，在去除模板后得到含有印迹空腔的分子印迹聚合物（MIP）。与天然识别材料（例如抗体和酶）相比，MIP具有良好的稳定性和低成本的优势17。目前，小分子的印迹方法较完善18，蛋白质等大分子的印迹仍充满挑战。蛋白质的大尺寸和灵活构象限制了它们在高度交联的聚合物基质中传质，导致模板蛋白的去除比较困难19。以球形或平面材料为支撑体，在其表面构建印迹涂层的表面印迹法是解决这个问题的有效方法之一20,21。通过表面印迹法得到的印迹空腔位于材料的表面，因此有利于模板蛋白的洗脱及传质，从而提高蛋白质的印迹效率22,23。多巴胺（DA）生物相容性好、聚合方法简单，聚合后结构稳定、黏附性强且含有多种活性基团24,25，是制备低成本表面 MIP 的良好材料。然而，在非印迹空腔区域，聚多巴胺（PDA）表面大量的官能团会使其对蛋白质具有显著的非特异性吸附，从而导致基于 PDA 的 MIP 其特异性和选择性下降。为解决这个问题，采用印迹后修饰策略，即在模板洗脱前用抗蛋白质聚合物修饰 MIP 的非印迹空腔区域以减少 PDA 的非特异性吸附26,27。最近，水溶性聚（2-甲基-2-噁唑啉）（PMOXA）作为抗污涂层引起了关注。PMOXA 的水解可形成主链上带有反应性亚氨基的聚（2-甲基-2-噁唑啉-乙烯亚胺）（PMOXA-EI）。PMOXA-EI 可以通过迈克尔加成反应以非刷状结构接枝到 PDA 上，以抵抗蛋白质在 PDA 涂层上的非特异性吸附28,29，同时，PMOXA-EI 的非刷状结构可以减少接枝聚合物层的厚度，从而降低模板的传质阻力。本文以 BLG 为模板，以 DA 为功能单体和交联剂，通过模板分子前定位、表面印迹法和印迹后修饰策略，在金基底上构建了 BLG 分子印迹 SPR 传感器。研究了分子印迹传感器的选择性、再现性和可重复使用性，并以其对骆驼奶粉中的 BLG 进行了检测，考察了其在实际样品中的适用性。1 实验部分 1.1 原料和试剂丙烯酸（AA）、异丙醇（IPA）：分析纯，国药集团化学试剂有限公司，减压蒸馏提纯；2-甲基-2-噁唑啉（MOXA）：分析纯，Sigma-Aldrich 化学品有限公司，用氢化钙干燥后蒸馏提纯；高碘酸钠（SP）、氢氧化钠、盐酸、乙酸、乙醇胺、乙醇、丙酮、浓硫酸、双氧水、乙腈、乙醚、二水合磷酸二氢钠、十二烷基硫酸钠（SDS）、十二烷基三硫代碳酸酯（DDMAT）、三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；偶氮二异丁腈（AIBN）：分析纯，天津光复精细化工研究所，溶解到乙醇中重结晶进行提纯；BLG：生物纯，上海麦克林350功能高分子学报第36卷生化科技股份有限公司；骆驼奶粉：新疆军农乳业有限公司；DA、三氟甲磺酸甲酯（MeOTf）：分析纯，Sigma-Aldrich 化学品有限公司；-乳白蛋白（ALB）、乳铁蛋白（LF）、血清白蛋白（SA）：生物纯，Sigma-Aldrich 化学品有限公司；溶菌酶（LYZ）：生物纯，Amresco 生化试剂有限公司。1.2 测试与表征核磁共振氢谱仪（1H-NMR）：瑞士 Bruker 公司 AVANCEHD400 型，使用重水作为溶剂。傅里叶变换红外光谱仪（FT-IR）：美国 ThermoFisherScientific 公司 NICOLET6700 型，使用全反射技术对传感器表面进行红外光谱分析，光谱范围为 4000400cm1。原子力显微镜（AFM）：德国 Bruker 公司 DimensionIcon 型，以轻敲模式对传感器表面形貌进行表征。变角光谱椭偏仪：美国 Woollam 公司 M-2000 型，检测传感器表面涂层的厚度。在 3701000nm 的光谱范围内以 2 个不同的入射角（70和 80）测试。用 Cauchy 层模型进行数据拟合，其中金的折射率为 1.5，消光系数为 0。对每个传感器的 3 个不同位置进行厚度测量，取 3 次测试数据的平均值标准偏差。光学接触角和界面张力仪：美国 KINO 公司 SL200KS 型，检测传感器表面的静态水接触角（WCA），每次测试使用 2L 去离子水，测量传感器表面 3 个不同位置的 WCA 值，取 3 次测试数据的平均值标准偏差。表面等离子体共振仪：美国 GE 公司 BioScienceT200 型，通过共振角的变化（R）来定量蛋白质的吸附量，实时研究蛋白质吸附行为，其中，R=10RU 相当于 1cm2芯片表面蛋白质的质量改变约 1.0ng。1.3 实验步骤1.3.1聚合物的制备和缓冲液的配制巯基封端的聚丙烯酸（PAA-SH）的合成28：以 AA 为单体、IPA 为溶剂、AIBN 为引发剂、DDMAT 为链转移剂（n（AA）n（AIBN）n（DDMAT）=6014）进行可逆加成-断裂链转移（RAFT）聚合合成聚丙烯酸（PAA），加入乙醇胺并在室温下反应后得到 PAA-SH。通过1H-NMR 测得 PAA-SH的聚合度为 17。PMOXA-EI 的合成30：以 MOXA 为单体、MeOTf 作为引发剂（n（MOXA）n（MeOTf）=501）进行阳离子开环聚合得到 PMOXA，然后使用浓盐酸对 PMOXA 进行水解得到 PMOXA-EI。通过1H-NMR 测得 PMOXA-EI 的聚合度为 100，水解度为 35%。PBS 缓冲液：称取 3.8953g 二水合磷酸二氢钠并使其完全溶于适量去离子水中，然后使用 1mol/LNaOH 溶液和 1mol/LHCl 溶液调节其 pH 分别至 5.0 和 7.4，最后在 1000mL 容量瓶中定容。Tris 缓冲液：称取 1.2110gTris 并使其完全溶于适量去离子水中，然后使用 1mol/LHCl 溶液调节其 pH至 8.5，最后在 1000mL 容量瓶中定容。1.3.2MIPSPR 传感器的制备首先将金片相继在丙酮、乙醇和水中超声清洗 20min，然后经氮气吹干后浸泡在 Piranha 溶液（浓硫酸和双氧水体积比为 73 的混合溶液）中，于 40 浸泡 12h，接着用去离子水冲洗后再用氮气吹干得到干净的裸金片（Au），最后使用干净裸金片制备 MIPSPR 传感器，制备过程如图 1 所示。DABLGPMOXA-EIPAA-SHDAAuPAA/PDA/AuPDA/BLG/PAA/PDA/AuElutionRebindingMIP-before elutionMIP图1MIPSPR 传感器的制备示意图Fig.1SchematicillustrationforthepreparationofMIPSPRsensor将 Au 置于 4mLDA 的 PBS 溶液（3.3mmol/L，pH=5.0）中，然后加入 0.5mLSP 的 PBS 溶液（18.7mmol/L，pH=5.0），24 下反应 10min 后得到 PDA/Au 涂层片。将 PDA/Au 涂层片加入到 2mLPAA-SH 的 Tris 溶液（0.83mmol/L，pH=8.5）中，在 50 下反应 6h，反应结束后用去离子水冲洗并用氮气干燥涂层片以去除未反应的 PAA-SH，得到 PAA/PDA/Au 涂层片。将 PAA/PDA/Au 涂层片浸泡在 2mLBLG 的 PBS 溶液（0.2mg/mL，pH=5.0）中 30min 得到 BLG/PAA/PDA/Au 涂层片。接着加入 2mLDA 的 PBS 溶液（6.6mmol/L，pH=5.0）和0.5mLSP 的 PBS 溶液（18.7mmol/L，pH=5.0），24 下共沉积 30min 得到 PDA/BLG/PAA/PDA/Au 涂层片。第4期申永帅，等：分子印迹SPR传感器用于骆驼奶粉中-乳球蛋白的检测351之后将 PDA/BLG/PAA/PDA/Au 涂层片在 2mLPMOXA-EI 的 PBS 溶液（0.6mmol/L，pH=7.4）中于 30 下反应 4h得到 MIP-beforeelution 涂层片。最后在室温下使用 SDS 溶液（0.1g/mL）洗脱 6h 得到 MIPSPR 传感器。和上述方法相同，在不加 BLG 的条件下制备了非分子印迹聚合物（NIP）SPR 传感器。1.3.3SPR 定量研究 BLG 吸附实验用 PBS 缓冲液（pH=5.0）冲洗 BioScienceT200 系统 2 次，然后将传感器芯片安装在 SPR 样品架上。用 PBS 溶液（pH=5.0）冲洗传感器芯片表面 50s 以获得基线信号，将 BLG 的PBS 溶液通过芯片表面 300s，使蛋白质在芯片表面吸附。最后用 PBS 溶液通过芯片表面 60s 获得稳定数据。为了消除缓冲液的影响，首先测试了 PBS 溶液在芯片表面的 SPR 共振角的变化量，后续测试的蛋白质吸附数据都是在减去 PBS 溶液影响的共振角变化量后得到的。使用上述 SPR 技术测试了 MIPSPR 传感器芯片对不同质量浓度 BLG（BLG）溶液的吸附量，检测的质量浓度范围为 0.2110g/mL。对每个质量浓度的 BLG 溶液进行 4 次平行测试，最终取 4 次测试数据的平均值标准偏差。拟合了该质量浓度范围内的标准校准曲线。最低检测限 LOD=3.3S/m，其中 S 为 Y 轴截距的标准偏差，m 为标准曲线斜率31。1.3.4选择性实验ALB、LF、SA、LYZ 是骆驼奶粉的主要蛋白成分4,32，因此选择这 4 种蛋白质作为竞争蛋白进行 MIP 和 NIP 传感器的选择性实验。将上述 4 种蛋白质分别溶于 PBS 溶液（pH=5.0）中，质量浓度皆为10g/mL。使用 1.3.3 节的测试方法测试 MIP 传感器对 4 种蛋白质的吸附，每种蛋白质进行 4 次平行测试，最终取 4 次测试数据的平均值。使用印迹因子（IF）和选择系数（k）分别评估 MIP 传感器的特异性和选择性识别能力，计算公式如下：IF=QMIP/QNIP(1)k=Qtemplate/Qcontrol(2)其中，QMIP和 QNIP为同一种蛋白质分别在 MIP 和 NIP 传感器上的共振角变化量（即响应信号值）；Qtemplate和Qcontrol分别为模板蛋白和竞争蛋白在同一传感器上的共振角变化量。1.3.5重复性和再现性实验为了评估 MIP 传感器的重复使用性，使用 10g/mLBLG 的 PBS 溶液在 MIP 传感器上进行吸附测试（实验步骤同 1.3.3 节），然后使用 SDS 溶液（0.1g/mL）流过芯片表面 60s，完成一次吸附-脱附实验。在同一传感器上进行 6 次吸附-脱附实验，进行 4 次平行测试，最终取 4 次平行测试数据的平均值标准偏差。为了验证再现性，采用 1.3.2 节的方法制备了 6 个 MIP 传感器，使用 10g/mLBLG 的 PBS 溶液（pH=5.0）进行吸附测试（实验步骤同 1.3.3 节）。进行 4 次平行测试，最终取 4 次平行测试数据的平均值标准偏差。1.3.6SPR 检测骆驼奶粉中的 BLG 的质量浓度准确称取 250mg 的骆驼奶粉于 7mL 离心管中，加入 5mL的乙酸（50mmol/L），震荡 1min，以 8000r/min 离心 15min 以去除乳脂和酪蛋白，其中上清液为乳清蛋白8,33，取出上清液并用 0.22m 孔径的针孔过滤器过滤，最后用 PBS 溶液（pH=5.0）将上清液稀释 2000 倍获得骆驼奶粉的 PBS 溶液。加标 BLG 骆驼奶粉：准确称取 100mgBLG 粉末和 150mg 的骆驼奶粉，样品处理方式同上，制成 BLG 质量浓度为 10g/mL 的骆驼奶粉的 PBS 溶液（pH=5.0）。使用 PBS 溶液分别稀释至 5g/mL 和 3.33g/mL。每个样品用 SPR 进行 4 次平行测试，最终取 4 次测试数据的平均值。2 结果与讨论 2.1 传感器芯片的表征MIP-beforeelution、MIP 和 NIP 的红外光谱（图 2）在 36002800cm1处的宽波段（OH）和 1549cm1处（NH）存在吸收峰，证明了 PDA 涂层的形成34,35。MIP-beforeelution 在 1647cm1处(C=O)和 1549cm1处(NH)存在尖峰，这些尖峰对应模板分子中氨基酸残基的官能团，表明 MIP-beforeelution 中含有模板分子BLG。相比于 MIP-beforeelution，MIP 在 1647cm1处（C=O 伸缩振动）和 1549cm1处（NH 弯曲振动）的峰面积和峰强明显下降，同时 MIP 和不含模板分子的 NIP 具有相似的红外光谱，这些结果都表明 MIP 中模板352功能高分子学报第36卷分子被成功去除。图 3 是传感器芯片的静态水接触角（图 3（a）和厚度（图 3（b）的变化。Au 经 Piranha 溶液清洗后其 WCA 为 83.5。在 Au 上聚合 PDA 涂层并接枝PAA-SH 后，由于表面亲水基团的存在，WCA 分别降低到 51.4（PDA/Au）和 52.4（PAA/PDA/Au），其厚度从 1.7nm（PDA/Au）增加至 3.2nm（PAA/PDA/Au），这些结果表明 PDA 及 PAA 涂层的成功制备。BLG 通过氢键和静电作用吸附在 PAA 涂层上以后，BLG/PAA/PDA/Au 的表面厚度增加到 8.2nm，并且由于疏水性 BLG 的存在使表面 WCA 增加到 68.1。使用 DA 的聚合进行印迹并接枝 PMOXA-EI 后，厚度进一步增加到 9.6nm（PDA/BLG/PAA/PDA/Au）和10.1nm（MIP-beforeelution），而其 WCA 先降低至 65.0（PDA/BLG/PAA/PDA/Au）再增到 68.4（MIP-beforeelution）。洗脱 BLG 后，WCA 降低了 12，厚度也降至 8.6nm，表明 MIP 中的 BLG 被成功去除，这一结果也可以从红外光谱中模板分子的特征峰变化得到验证。此外，测试了 NIP 洗脱前后的 WCA 和厚度变化，其 WCA从 47.2变为 46.3，厚度从 6.4nm 降到 5.8nm。由于 NIP 表面不存在模板蛋白，因此 NIP 洗脱前后的 WCA 和厚度变化都较小。通过 AFM 研究了传感器芯片的表面形貌，相应的三维图像如图 4 所示。Au 表面光滑，深度为 0.70nm，均方根粗糙度（Rq）为 0.20nm。由于 Au 表面印迹聚合物的形成，MIP 传感器表面的厚度和 Rq分别增加到6.70nm 和 1.67nm。与 MIP 传感器相比，NIP 传感器由于表面没有印迹空腔，因此粗糙度较低，Rq为 1.23nm，4 0003 5003 000Wave number/cm12 5002 0001 5001 0005000MIP-before elutionMIPNIPO-H stretchingN-H bendingC-N StretchingC=O stretching图2MIP-beforeelution、MIP 和 NIP 的红外光谱Fig.2FT-IRspectraofMIP-beforeelution,MIPandNIP100(a)806040200WCA/()PDA/BLG/PAA/PDA/AuBLG/PAA/PDA/AuPAA/PDA/AuPDA/AuAuMIP-before elutionNIP-before elutionMIPNIP12(b)1086420Thickness/nmPDA/BLG/PAA/PDA/AuBLG/PAA/PDA/AuPAA/PDA/AuPDA/AuMIP-before elutionNIP-before elutionMIPNIP图3传感器芯片的（a）WCA 和（b）厚度Fig.3(a)WCAand(b)thicknessofsensorchips6.70.4500500 nm500400400400300300300200200200100100100nmnmnm6.70500500 nm500400400400300300300200200200100100100nmnmnm5.60.5500500 nm500400400400300300300200200200100100100nmnmnm(a)Au(b)MIP(c)NIP图4Au、MIP 和 NIP 传感器芯片的 AFM 图Fig.4AFMimagesofAu,MIPandNIPsensorchips第4期申永帅，等：分子印迹SPR传感器用于骆驼奶粉中-乳球蛋白的检测353深度为 5.80nm。2.2 MIP 传感器对 BLG 的吸附研究MIP 传感器对 0.2110g/mL 的 BLG 溶液的实时检测 SPR 结果如图 5（a）所示，（BLG）和响应信号值的标准校准曲线如图 5（b）所示。从 SPR 吸附曲线可以看出，由于表面印迹技术可以降低模板的传质阻力，因此 MIP 传感器对 BLG 的吸附速率非常快，可以在 5min 内达到吸附平衡。在 MIP 对 BLG 的吸附过程中，随着（BLG）浓度的降低，BLG 进入印迹空腔中的量变少，导致 MIP 传感器上的响应信号随（BLG）的减小而变小。MIP 传感器在 0.2110g/mL 的标准曲线回归方程为 y=139.433x2.927（其中 y 是响应信号值；x 是（BLG），R2=0.99875，LOD 为 0.12g/mL。1 800(a)10 g/mL0.21 g/mL1 6001 4001 2001 0008006004002000151101 151 201 251 301 351 401 451t/sResponse change/RU1 500(b)1 00050005.02.57.510.0(BLG)/(gmL1)Response change/RU图5BLG 在 MIP 传感器上的（a）等温吸附线和（b）标准校准曲线Fig.5(a)Adsorptionisothermsand(b)standardcalibrationcurveofBLGontheMIPsensor 2.3 选择性通过 SPR 测试 MIP 和 NIP 传感器分别对模板蛋白 BLG 和竞争蛋白的响应信号值（Q）以及 IF 和 k，结果如表 1 所示。由表 1 可知，MIP 对 BLG 的 IF 为 3.1，而对 SA、LYZ、ALB 和 LF 的 IF 皆小于 1，对 BLG 较高的 IF 说明 MIP 传感器可以特异性识别 BLG，而不能特异性识别其他蛋白。MIP 对 SA、LYZ、ALB 和 LF 的 k分别为 2.2、5.5、2.6 和 6.9，高 k 值表明 MIP 涂层存在和 BLG 相互匹配的印迹空腔和印迹位点，因此可以对BLG 进行识别，从而具备了良好的选择性。表1生物传感器对 BLG 和竞争蛋白的 Q、IF 和 kTable1Q、IFandkofBLGandcompetingproteinsbybiosensorProteinQMIP/RUQNIP/RUIFkBLG14014583.1SA6476900.92.2LYZ2543630.75.5ALB5275740.92.6LF2032180.96.9 2.4 重复性和再现性为了评估 MIP 传感器的可重复使用性，使用 10g/mL 的 BLG 溶液在同一传感器上进行了 6 次吸附-脱附实验，实验结果如图 6（a）所示。MIP 传感器 6 次测试的平均响应信号值变化较小，相对标准偏差（RSD）为3.62%，表明 MIP 传感器的重复性较好。同时，为了验证 MIP 传感器的再现性，使用 6 个以相同工艺制备的MIP 传感器进行测试，结果如图 6（b）所示，6 个传感器显示了相似的吸附性能，其平均响应信号值的 RSD 为2.98%，说明 MIP 传感器具有良好的再现性。2.5 应用为了验证 MIP 传感器在实际样品分析中的适用性，采用加标回收法检测了骆驼奶粉溶液样品中 BLG 的含量。首先使用 BLG 分子印迹 SPR 传感器检测未加标 BLG 的骆驼奶粉溶液，结果未检出奶粉中含有 BLG。354功能高分子学报第36卷然后对骆驼奶粉溶液进行加标并检测。表 2 是对加标 BLG 的骆驼奶粉的检测结果及其回收率。由表 2 可知，当加标 BLG 质量浓度（SpikedBLG）为 3.33g/mL 时，回收率为 100.6%。当（SpikedBLG）为 5.00、10.00g/mL 时，检测的 BLG 质量浓度（FoundBLG）分别为 5.01、10.07g/mL，与（SpikedBLG）接近，回收率分别为 100.2%和 100.7%，说明 MIP 传感器可以在骆驼奶粉样品中检测 BLG。MIP 传感器可以借助特定的表面印迹空腔与骆驼奶粉样品中的 BLG 相互作用，在非印迹区的 PMOXA-EI 抵抗了蛋白质的吸附，从而具有检测复杂基质中 BLG 的能力。表2骆驼奶粉中 BLG 质量浓度的检测Table2DetectionofBLGmassconcentrationincamelmilkpowder（SpikedBLG）/（gmL1）（FoundBLG）/（gmL1）Recovery/%3.333.350.25100.67.55.005.010.15100.23.010.0010.070.14100.71.4 2.6 与其他检测方法的对比表 3 列出了 CE、HPLC、ELISA 以及本文 SPR 方法对 BLG 检测的线性范围和 LOD。CE 法对 BLG 检测的线性范围为 0.120g/mL，LOD 为 0.05g/mL，但 CE 法需要在毛细管内部修饰昂贵的核酸适配体。HPLC法对 BLG 检测的线性范围较大，但该方法的测试时间通常较长。ELISA 法检测范围宽，LOD 小，然而 ELISA法测得的数据偏差较大，通常被认为是一种半定量分析方法。本文使用的 SPR 法具有较低的 LOD，这为骆驼奶粉中 BLG 的检测提供了简便可行的方法。虽然 SPR 法检测的线性范围较小，但此方法的制备过程简单、测试速率快，且不需要对样品进行预处理。表3与其他检测方法的对比Table3ComparisonwithotherdetectionmethodsDetectionmethodLinearityrange/（gmL1）LOD/（gmL1）ReferenceCE0.1200.0536HPLC12520009037HELISA0.078100.11410SPR0.21100.12Thispaper 3 结论（1）结合模板分子前定位、表面印迹法和印迹后修饰策略，制备了 BLG 分子印迹 SPR 传感器。（2）分子印迹 SPR 传感器在 0.2110g/mL 的 BLG 具有良好的线性关系，对 BLG 的最低检测限为(a)1 6001 4001 2001 0008006004002000123456Number of detectionResponse change/RU(b)1 6001 4001 2001 0008006004002000123456Sensor numberResponse change/RU图6MIP 传感器对 BLG 吸附的重复性和再现性Fig.6RepeatabilityandreproducibilityofBLGadsorptionbyMIPsensor第4期申永帅，等：分子印迹SPR传感器用于骆驼奶粉中-乳球蛋白的检测3550.12g/mL。（3）分子印迹 SPR 传感器对 BLG 可特异性吸附，具有良好的选择性、重复性和再现性。（4）对骆驼奶粉样品中加标 BLG 并进行了检测，回收率为 100.2%100.7%，显示了其应用价值。参考文献：SZEPFALUSIZ,LOIBICHLERC,PICHLERJ,REISENBERGERK,EBNERC,URBANEKR.DirectevidencefortransplacentalallergentransferJ.PediatricResearch，2000，48（3）：404-407.1WALJM.BovinemilkallergenicityJ.AnnalsofAllergy,Asthma&Immunology,2004,93(5Suppl3)：S2-S11.2ALLENKJ,REMINGTONBC,BAUMERTJL,CREVELRW,HOUBENGF,BROOKE-TAYLORS,KRUIZINGAAG,TAYLORSL.Allergenreferencedosesforprecautionarylabeling(VITAL2.0):ClinicalimplicationsJ.JAllergyClinImmunol，2014，133（1）：156-164.3OMARA,HARBOURNEN,ORUNA-CONCHAMJ.QuantificationofmajorcamelmilkproteinsbycapillaryelectrophoresisJ.InternationalDairyJournal，2016，58：31-35.4ZHAODB,BAIYH,NIUYW.CompositionandcharacteristicsofChinesebactriancamelmilkJ.SmallRuminantResearch，2015，127：58-67.5冯雪.我国骆驼奶产业发展前景分析J.现代经济信息，2016（7）：315.FENGX.AnalysisofthedevelopmentprospectofcamelmilkindustryinChinaJ.ModernEconomicInformation，2016（7）：315.6陆东林,徐敏,李景芳,何晓瑞,叶东东.新疆特种乳产业发展现状、问题和对策J.新疆畜牧业，2017（5）：4-7.LUDL,XUM,LIJF,HEXR,YEDD.Developmentstatus,problemsandcountermeasuresofspecialdairyindustryinXinjiangJ.XinjiangAnimalHusbandry，2017（5）：4-7.7李玲玉,王俊,李敏婧,杨迎春,苗静,赵仲凯,杨洁.基于乳清蛋白的骆驼乳中掺假牛乳的检测及热处理对方法的影响J.食品科学，2022，43（10）：329-335.LILY,WANGJ,LIMJ,YANGYC,MIAOJ,ZHAOZK,YANGJ.Detectionofadulteratedcowsmilkinwheyprotein-basedcamelmilkandeffectofheattreatmentonthemethodJ.FoodScience，2022，43（10）：329-335.8KUMARD,VERMAAK,CHATLIMK,SINGHR,KUMARP,MEHTAN,MALAVOP.Camelmilk:AlternativemilkforhumanconsumptionanditshealthbenefitsJ.Nutrition&FoodScience，2016，46（2）：217-227.9ORCAJOJ,LAVILLAM,MARTINEZ-de-MARANONI.SpecificandsensitiveELISAformeasurementoflgE-bindingvariationsofmilkallergen-lactoglobulininprocessedfoodsJ.AnalyticaChimicaActa，2019，1052：163-169.10REN 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