资料-多糖含量测定的各种方法优缺点.doc

苯酚-硫酸法测多糖含量
一、原理
多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物。再以比色法测定。
二、试剂
　　1、浓硫酸：分析纯，95.5%
　　2、80%苯酚：80克苯酚（分析纯重蒸馏试剂）加20克水使之溶解，可置冰箱中避光长期储存。
　　3、6%苯酚：临用前以80%苯酚配制。（每次测定均需现配）
　　4、标准葡聚糖（Dextran,瑞典Pharmacia）或分析纯葡萄糖。
　　5、15%三氯乙酸（15%TCA）：15克TCA加85克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。
　　6、5%三氯乙酸（5%TCA）：25克TCA加475克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。
　　7、6mol/L 氢氧化钠：120克分析纯氢氧化钠溶于500ml水。
8、6mol/L 盐酸
三、操作
　　1、制作标准曲线
准确称取标准葡聚糖（或葡萄糖）20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml，各以蒸馏水补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml，摇匀冷却，室温放置20分钟以后于490nm测光密度，以2.0ml水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。
　　2、样品含量测定
　　1）取样品1克（湿样）加1ml 15%TCA溶液研磨，再加少许5％TCA溶液研磨，倒上清液于10毫升离心管中，再加少许5％TCA溶液研磨，倒上清液，重复3次。最后一次将残渣一起到入离心管。注意：总的溶液不要超出10毫升。（既不要超出离心管的容量）。
　　2）离心，转速3000转/分钟，共三次。第一次15分钟，取上清液。后两次各5分钟取上清液到25毫升锥形比色管中。最后滤液保持18毫升左右。
　　3）水浴，在向比色管中加入2毫升6mol/L 盐酸之后摇匀，在96℃水浴锅中水浴2小时。
　　4）定容取样。水浴后，用流水冷却后加入2毫升6mol/L 氢氧化钠摇匀。定容至25毫升的容量瓶中。吸取0.2 ml的样品液，以蒸馏补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却室温放置20分钟以后于490nm测光密度。每次测定取双样对照。以标准曲线计算多糖含量。
四、注意
1、此法简单、快速、灵敏、重复性好，对每种糖仅制作一条标准曲线，颜色持久。
2、制作标准线宜用相应的标准多糖，如用葡萄糖，应以校正系数0.9校正μg数。
3、对杂多糖，分析结果可根据各单糖的组成比及主要组分单糖的标准曲线的校正系数加以校正计算。
4、测定时根据光密度值确定取样的量。光密度值最好在0.1~0.3之间。比如：小于0.1之下可以考虑取样品时取2克，仍取0.2ml样品液，如大于0.3可以减半取0.1ml的样品液测定，即可无碍。

蒽酮-硫酸比色法测定多糖含量
 一、实验原理 
糖类在较高温度下可被浓硫酸作用而脱水生成糠醛或羟甲基糖醛后，与蒽酮（C14H10O）脱水缩合，形成糠醛的衍生物呈蓝绿色。该物质在620nm处有最大吸收，在150µg/mL范围内，其颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。该法有很高的灵敏度，糖含量在30µg左右就能进行测定。 
二、试剂器材 
1、蒽酮试剂：精密称取0.1g蒽酮，加80%浓H2SO4100mL使溶解，摇匀。当日配制使用； 
2、葡萄糖标准液：将无水葡萄糖置于五氧化二磷干燥器中12hr后精密称取100mg，用蒸馏水定容至100ml； 
3、其他器材：分析天平、分光光度计、容量瓶（100ml、50ml、10ml）、烧杯、具塞试管、移液器、移液器吸头、涡旋振荡器和废液缸等。
 三、 操作步骤 
1、葡萄糖标准曲线的制作 
取7支具塞试管，按下表数据精密配制一系列不同浓度的葡萄糖溶液，每个浓度做2~3个重复：
管号
0
1
2
3
4
5
6
标准葡萄糖溶液/mL
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
蒸馏水/mL
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
在每支试管中立即加入蒽酮试剂6mL，振荡混匀，各管加完后一起置于沸水浴中加热15min。取出，迅速浸于冰水浴中冷却15min。 
在625nm波长下以第1管为空白，迅速测定其余各管吸光值。 
以标准葡萄糖含量(mg)为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。 
2、样品的测定 
将样品溶液糖浓度调整到测定范围，精确吸取2mL置于干燥洁净试管中，在每支试管中立即加入蒽酮试剂6mL，振荡混匀，各管加完后一起置于沸水浴中加热15min。取出，迅速浸于冰水浴中冷却15min，每个浓度做2~3个重复。 
在625nm波长下迅速测定各管吸光值。根据葡萄糖含量的标准曲线，由样品溶液吸光值计算各样品溶液中糖的浓度，并计算其糖含量。 
四、注意事项 
该法的特点是几乎可测定所有的碳水化合物，不但可测定戊糖与已糖，且可测所有寡糖类和多糖类，包括淀粉、纤维素等（因为反应液中的浓硫酸可把多糖水解成单糖而发生反应），所以用蒽酮法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。 
在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下，用蒽酮法可以一次测出总量，省去许多麻烦，因此，有特殊的应用价值，但在测定水溶性碳水化合物时，则应注意切勿将样品的未溶解残渣加入反应液中，否则会因为细胞壁中的纤维素、半纤维素等与蒽酮试剂发生反应而增加了测定误差。 
不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同，果糖显色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖较浅，五碳糖显色更浅，故测定糖的混合物时，常因不同糖类的比例不同造成误差，但测定单一糖类时则可避免此种误差。

多糖含量的测定
一、原理
分子量大于10,000道尔顿的多糖经80%乙醇沉淀后，加入碱性铜试剂，选择性地从其他高分子物质中沉淀出葡聚糖，沉淀部分与苯酚-H2SO4反应，生成有色物质，在485nm条件下，有色物质的吸光度值与葡聚糖浓度成正比。
二、适用范围
参照AOAC方法。适用于检测含有分子量大于10,000道尔顿葡聚糖的样品。
三、仪器
1、分光光度计
2、离心机
3、旋转混匀器
4、恒温水浴锅
四、试剂
除特殊说明外，实验用水为蒸馏水，试剂为分析纯。
1、80%乙醇：800ml无水乙醇加水200ml。
2、2.5mol/L NaOH溶液：100gNaOH加蒸馏水稀释至1L，加入固体无水硫酸钠至饱和。
3、铜贮存液：称取3.0g CuSO4·5H2O，30.0g柠檬酸钠加水溶解至1L。溶液可贮存2周。
4、铜应用溶液：取铜贮存液50ml，加水50ml混匀后加入无水硫酸钠12.5 g，临用新配。 
5、洗涤液：取水50ml，加入10ml铜应用溶液，10ml 2.5mol/L NaOH溶液，混匀。 
6、1.8mol/L H2SO4：取100ml浓硫酸用水稀释至1L。 
7、20g/L苯酚溶液：称取2.0g苯酚，加水溶解并稀释至100ml，混匀备用。 
8、葡聚糖标准液：称取500mg葡聚糖（分子量500,000D）于称量皿中，105℃干燥4h至恒重，置于装有干燥硅胶的干燥器中冷却。准确称取100mg干燥后的葡聚糖，用水定容至100ml，葡聚糖标准浓度为1.0mg/ml。 
9、葡聚糖标准应用液：吸取葡聚糖标准液10ml，用水稀释10倍，葡聚糖终浓度为0.1mg/ml。
五、操作方法
1、样品处理 
1）样品提取：称取样品1～5g，加水100ml，沸水浴加热2h，冷却至室温，定容至200ml（V1），混匀后过滤，弃初滤液，收集余下滤液。 
2）沉淀高分子物质准确吸取上述滤液100ml（V2），置于烧杯中，加热浓缩至10ml，冷却后，加入无水乙醇40ml，将溶液转至离心管中以3000rpm离心5min，弃上清液，残渣用80%乙醇洗涤3次，残渣供沉淀葡聚糖之用。 
3）沉淀葡聚糖：上述残渣用水溶解，并定容至50ml（V3），混匀后过滤，弃初始滤液后，取滤液2.0ml （V4），加入2.5mol/L NaOH 2.0ml，Cu应用溶液2.0ml，沸水浴中煮沸2mim，冷却后以3000rpm离心5min，弃上清液，残渣用洗涤液洗涤3次，残渣供测定葡聚糖之用。 
4）测定葡聚糖：上述残渣用2.0mL 1.8mol/L H2SO4溶解，用水定容至100mL（V5）。准确吸取2.0ml（V6），置于25ml比色管中，加入1.0ml苯酚溶液，10ml浓硫酸，沸水浴煮沸2分钟，冷却比色。从标准曲线上查得相应含量，计算粗多糖含量。 
2、标准曲线制备
精密吸取葡聚糖标准应用液0.10，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00，1.50，2.00ml（分别相当于葡聚糖0.01，0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.15，0.20mg），补充水至2.0mL，加入苯酚溶液1.0ml，浓硫酸10ml，混匀，沸水浴2分钟，混匀，沸水浴2分钟，冷却后用分光光度计在485nm波长处以试剂空白溶液为参比，测定吸光度值（A），以葡聚糖浓度为横坐标，A为纵坐标绘制标准曲线。
六、计算 
从标准曲线上查得样品相应含量，计算粗多糖含量。 
葡聚糖（%）=c×V5×V3×V1×0.1/V6×V4×V2×m=c×250/m…………… 
公式中：c--从标准曲线上查得样品测定管中葡聚糖含量，mg； 
V1--样品提取时定容体积，ml； 
V2--沉淀高分子物质取液量，ml；
V3--沉淀葡聚糖时定容量，ml； 
V4--沉淀葡聚糖时取液量，ml； 
V5--测定葡聚糖时定容体积，ml； 
V6--样品比色管中取样液体积，ml； 
m--样品称量质量，g； 
0.1--将mg/g换算成g/100g的系数。 
七、注意事项 
1、苯酚-H2SO4溶液可以和多种糖类进行显色反应，常用于总糖的测定。所以测定过程中应注意容器及试剂中其他糖类的干扰。 
2、苯酚-H2SO4溶液和不同类的糖反应，显色的强度略有不同，反映在标准曲线的斜率不同。如果已知样品中糖的结构，应尽量以同类糖的纯品做标准品，或以含有已知浓度的同类产品做对照品进行检测分析；如果样品中糖的类型未知或结构多样，则只能以葡萄糖计或其他糖计报告结果。 
3、试验证明葡萄糖、果糖等单糖，蔗糖、乳糖等双糖、低聚糖--棉子糖，淀粉、糊精等多糖及甜味剂糖精不干扰粗多糖测定。 
4、本方法由北京市卫生防疫站建立，经中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所验证

黑木耳多糖的提取、分离、纯化及初步测定
一、实验目的
1、学习真菌多糖的提取方法
2、掌握测定多糖组成、总糖含量的基本方法
3、掌握柱层析技术
二、实验原理
通过水提法浸提出木耳中的多糖，经过有机溶剂脱脂，Sevage脱蛋白，透析除去无机盐等小分子杂质，经干燥得粗多糖。粗多糖经酸水解后通过纸层析或薄层层析测出多糖的单糖组成。经酚硫酸法测得总糖含量。获得粗多糖经G-100纯化，获得较纯多糖样品，为进一步研究奠定基础。
三、设备及试剂
1、设备：721型分光光度计、回流装置、台式离心机、电热恒温水浴锅、真空干燥箱、恒温磁力搅拌器、柱层析系统、层析缸、布氏漏斗
2、材料：黑木耳，使用前烘干、粉碎，过80目筛，得木耳粉
3、试剂：苯酚、硫酸、无水乙醇、丙酮、乙醚、乙酸、正丁醇、邻苯二甲酸、CPC、P2O5、NaSO4、NaCL、NaOH、BaCO3、石油醚、氯仿、粉末状活性炭、阿拉伯糖、鼠李糖、木糖甘露糖、半乳糖、葡萄糖
四、步骤
1、提取
1）取50g粉末，用石油醚回流脱脂2h，反复两次，抽滤，取残渣。
2）残渣经80%乙醇除去低聚糖后，热水浴浸提4h，重复一次，六层纱布粗滤，抽滤，取滤液。
3）向滤液中加入1%粉末活性炭，磁力搅拌器搅拌15min，抽滤除净活性炭。
4）浓缩至80ml左右，加入糖液总体积的1/4 Sevage试剂（正丁醇:氯仿=1:4），充分搅拌2h，静置，离心，取上清液重复，至无游离蛋白为止。
5）将清液装入透析袋，流水透析过夜。
6）将袋内溶液转移至250ml烧杯中，加入三倍体积95%乙醇沉淀多糖，静置30min。
7）4000rpm离心10min。
8）弃上清液，沉淀依次用无水乙醇、丙酮、氯仿洗涤。
9）将沉淀置于通风橱内挥净有机溶剂。
10）60℃真空干燥过夜，得粗多糖干品。
2、G-100柱纯化
3、酚硫酸法测总糖含量
1）称量提取出来的多糖粗品100mg，定容于1000ml容量瓶。
2）6g苯酚蒸馏水定容于100ml容量瓶中，得6%苯酚。
3）分别取1中母液0.0ml、0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml、0.6ml、0.7ml、0.8ml、0.9ml分别加蒸馏水定容到50ml。
4）分别从3中每管精确取2.0ml溶液，置于有塞试管中，分别加1ml 6%苯酚溶液，再加入5.0ml浓硫酸，从分震荡，置于沸水中加热30min，流动水冷却20min。
5）721分光光度计490nm测OD值，做标准曲线。
6）制得多糖同1-5处理，490nm测OD值，在标准曲线上获得含量，算得百分比。
4、组分分析
1）完全酸水解
取20mg糖样加入1MH2SO4密封，100℃水解8h。用BaCO3中和至pH7.0，离心，取上层清液滤液作纸层析。
2）纸层析
滤纸：新华1号（20×20）
溶剂系统：正丁醇-乙酸-水为:4:5:1（上层）
显色剂：苯胺-邻苯二甲酸正丁醇饱和水溶液
展层时间约为8h，喷雾，100℃，15min显色。

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