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透明质酸的稳定性考察
郭凤仙 郭学平 李国民
透明质酸（Hyaluronic Acid，简称HA）是1934年Mayer发现并命名的。国内外对HA的性质、生物活性、生产工艺、临床应用等方面都进行了广泛深入的研究，目前主要应用于医药和化妆品方面。HA是由糖苷键相连接的氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸的双糖单位重复连接组成的直链聚合物，羧基上的负电荷和较长的可折叠分子链使得分子空间伸展特别大，因此HA溶液具有较高的黏度[1]，分子量越大，黏度越高。HA分子链降解后，主要表现为黏度下降。本实验通过改变HA存放时的温度、酸碱度和离子强度，定期测其运动黏度，对HA的稳定性进行了考察。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
恒温水浴（±0.1°C）；平氏黏度计（毛细管内径为1.0mm±0.05mm）；电热恒温培养箱；电热恒温干燥箱 ；pH计。
HA，山东福瑞达生物化工有限公司生产，批号20000217 、20000219； 0.1mol/L NaOH、0.1mol/L HCl。
1.2 方法
1.2.1 HA运动黏度的测定[2]
精密称取按干品计算的HA粉末0.1g于100ml容量瓶中，用蒸馏水溶解定容至刻度，在25°C恒温水浴中，测定其在平氏黏度计中的流出时间（s），与该黏度计的黏度计常数（mm2/s2）相乘，即得HA的运动黏度，以mm2/s为单位。
1.2.2 温度对HA稳定性的影响
1.2.2.1 温度对固体HA稳定性的影响
将HA配成0.1%(g/ ml)的水溶液，测其运动黏度，作为初始黏度。分别称取HA固体粉末约1g于容量瓶中，置4°C、28°C、40°C、60°C、80°C、100°C下恒温保存。一定时间后分别取出，配成0.1%的水溶液，测定运动黏度。
1.2.2.2 温度对HA溶液稳定性的影响
将HA固体粉末用蒸馏水溶解，配成0.1%的溶液，分装于容量瓶内，在上述温度下恒温保存，定时取样测定运动黏度，方法同上。
1.2.3 酸碱度对HA溶液稳定性的影响
取HA固体粉末1.25g，用0.9%的NaCl配成0.25%HA溶液500ml,调pH为7，测其运动黏度,作为初始黏度。再将HA溶液分装于5个烧杯内，分别用移液管滴加NaOH或HCl试剂，使溶液pH值分别为5、6、7、8、9。五个烧杯于80°C下恒温保存12h后取出,分别调pH值为7.0，补加0.9%的NaCl或蒸馏水使NaCl浓度及HA浓度相同，测其运动黏度。
1.2.4 离子强度对HA溶液运动黏度的影响
取1g HA固体粉末配成0.2%的溶液500ml，再分别配制4、3、2、1、0.4、0.2mol/L的NaCl溶液各50 ml。量取HA溶液50ml 6份分别加入上述6种盐溶液混匀。然后分别测其运动黏度（0.1%HA水溶液运动黏度为空白黏度）。
2 结果
2.1 温度对HA稳定性的影响
结果见图1、图2和图3、图4。

图1 固体HA不同温度保存时运动黏度测定结果

图2 HA溶液不同温度保存时运动黏度的测定结果

图3 HA放置10天时运动黏度与温度的关系

图4 固体HA80°C和100°C保存时运动黏度与时间的关系

2.2 酸碱度对HA溶液稳定性的影响
结果见图5

图5 不同pH值对HA溶液运动黏度的影响
2.3离子强度对HA溶液运动黏度的影响
结果见图6。

图6 不同离子强度对HA溶液运动黏度的影响
3. 讨论
图1、图2和图3、图4表明，温度对HA的稳定性影响很大，HA的存放状态不同，稳定性不同。HA的最佳保存方式为冷藏，溶液状态HA比固体状态HA稳定。这可能与溶液状态下HA与空气中的氧气接触比固体状态下少有关，因溶液状态下HA分子间的空气均被排出。固体HA 40°C保存10天，其运动黏度下降18.4%；而HA溶液 40°C保存一个月运动黏度基本不变。80°C、100°C放置48h，两种状态HA运动黏度下降十分明显，这说明HA在温度较高时不稳定,但HA溶液在80°C加热4h和100°C加热1h, 运动黏度稍有下降，说明HA溶液可进行巴氏消毒。此结果对含HA的医药制剂和化妆品的生产中的灭菌问题，具有重要意义。生产过程中可单独对HA溶液进行巴氏消毒，也可与其他料液混合后或乳化时进行巴氏消毒。以往许多人有一种误解，认为HA溶液不能加热灭菌，否则会导致降解。
图5表明，pH值为6、7、8时运动黏度变化不大，pH为5时运动黏度下降最为明显。pH为7时运动黏度最大。这说明HA 在中性时稳定性最好，所以生产时要求pH值尽量维持在中性状态。pH值分别为5和6的HA溶液在80°C放置12h后重新测pH，pH值均有所升高，这可能是酸破坏HA结构所致，这一点在HA生产中也应注意。
从图6可以看出，0.1%HA溶液当NaCl浓度由0增加到0.1mol/L时，运动黏度从23.5降至2.41，变化显著，当浓度再逐渐增加时，运动黏度基本不变，不再随离子强度的增加而降低。这提示我们在生产或使用HA时，其过程中如有盐生成或需加入盐时应充分考虑离子强度对HA运动黏度所产生的影响。
实验中所选温度根据实验室现有条件而定，实验时为尽量减少称量误差，需一次配好溶液，然后分装，在配制HA溶液时，需加入防腐剂甲醛，其浓度为0.1％，否则溶液在整个实验过程中可能长菌，特别是溶剂为生理盐水时，溶解过程中，溶液如变混，即可能已有菌生成。
考察酸碱度对HA的影响时，最后溶液离子浓度、pH值、HA浓度都调至相同，即各溶液在测定时条件一致，这是为了排除测定时这些因素对HA运动黏度所产生的其它影响。

参考文献
1 王凤山，凌沛学，郭学平，等. 生化药物研究. 北京：人民卫生出版社，1997：266~271
2 国家药典委员会.中华人民共和国药典，北京：化学工业出版社，2000：44~46（附录）

［原文发表于：山东省药学会第五次生化药物学术研讨会论文集，济南，2001，48～52］