血管组织自发荧光的去除方法及应用.pdf

生堡痘理堂苤查婴!生璺旦筮!鲞筮兰塑g!i!里型!：垒P 巫!Q!：!：!：堕!：堡血管组织自发荧光的去除方法及应用刘春喜李大庆王荣戚立航丁士方张运血管组织尤其是动脉(如主动脉、颈总动脉、肾动脉等)具有丰富的弹性纤维与胶原纤维，后两者有很强的自发荧光，在荧光显微镜下根本不能区分特异荧光与组织自身的自发荧光，显著干扰荧光染色结果的观察，这限制了免疫荧光技术、绿色荧光蛋白(G F P)等荧光报告基因载体在心血管组织的应用。我们采用滂胺天空蓝溶液以消除血管组织的自发荧光，在此基础上可检测荧光报告基因G F P 的分布情况以及进行免疫荧光染色。一、材料与方法1 组织来源：8 周龄A P O E。一小鼠高脂饮食6 个月，左颈总动脉局部转染腺病毒载体，实验组、对照组各1 0 只，分别转染T L R 基因腺病毒(A d T L R)与G F P 报告基因腺病毒(A d G F P)，转染后7d 取材。4 多聚甲醛灌注固定，留取左颈总动脉、主动脉等组织，4 多聚甲醛4。C 后固定过夜，冷冻切片，片厚6 m。2 去除血管的自发荧光：组织切片经蒸馏水湿润，置于0 5 滂胺天空蓝(C h i c a g oS k yB l u e6 B，S i g m a 公司)浸泡1 0m i n，P B S 洗5m i n，荧光显微镜下观察自发荧光的存在情况。对于A d G F P 局部转染组的颈总动脉切片，先去除切片的自发荧光，然后在荧光显微镜下观察G F P 的分布与荧光强度。3 免疫荧光染色：去除自发荧光的冷冻切片，P B S 洗，3m i n，5 正常羊血清封闭2 0m i n；鼠抗0【a c t i n 单克隆抗体(S i g m a 公司，稀释度1：l O O O)4 0 c 过夜；P B S 洗，5m i nX3 次；F I T C 标记的驴抗鼠二抗(J a c s o n 公司，稀释度1：5 0)3 7，3 0m i n，P B S 洗，5r a i n 3 次；D A P I 对比染细胞核，P B S 洗，5m i n 3 次；抗荧光淬灭剂封片，荧光显微镜观察。二、结果未经处理的组织切片在荧光显微镜下观察，其自发蓝色、绿色、红色荧光均明显可见，经滂胺天空蓝处理后，其自发绿色荧光完全消除(图1)。对于A d G F P 局部转染的血管组织，去除其自发绿色荧光后，G F P 本身的绿色荧光清晰可见(图2)。去除自发绿色荧光后的血管切片，采用免疫荧光技术检测平滑肌仅一a c t i n 的表达情况，可见亮绿荧光分布，与血管的红色荧光形成鲜明的对比(图3)。三、讨论自发荧光是指物质未经荧光色素染色，在紫外光或短波作者单位：2 5 0 0 1 2 济南，山东大学齐鲁医院教育部和卫生部心血管重构和功能研究重点实验室通信作者：刘春喜(E m a i l：l i u c h u n x i 一1 9 9 9 1 6 3 c o m)技术交流图1 去除自发荧光前后血管的图像，A、B、C 分别是未经处理血管的蓝色、绿色、红色荧光；D、E、F 分别是经滂胺天空蓝处理后的血管蓝色、绿色、红色荧光图像标尺为1 0 0 r m图2A d G F P 局部转染的血管绿色荧光图像，A：未经处理的血管；B：经滂胺天空蓝处理后的血管标尺为1 0 0 m照射下呈现的荧光。除结缔组织外，自发荧光一般较弱。动物组织中的胶原纤维、弹性纤维有较强的自发荧光，具有很宽的发射光谱，实验室所用荧光显微镜多为宽带滤光片，不能滤掉组织的自发荧光，因此只能采用化学方法除去组织的自发荧光。滂胺天空蓝可以有效消除切片中的自发绿色荧光，而组织的G F P 绿色荧光不受影响，通过观察G F P 的分布与荧光强度，间接体现载体所带目的基因的表达情况。去除自发荧光后的含有G F P 的切片还可以使用非荧光标记的二抗进行万方数据空堡疸堡堂苤查!螋!生兰旦筮!鲞筮兰翅鱼!也旦型!：垒P 巫!螋!：!：!：盟!：堡图3血管d a c t i n 免疫荧光染色，A：D A P I 对比染细胞核；B：a a c t i n 的图像，绿色荧光代表平滑肌细胞；C：血管的红色荧光；D：A、B、C 的叠加图像标尺为l o 岬免疫组织化学染色，以检测某抗原的分布情况。另外，用滂胺天空蓝处理切片后，血管的弹性纤维被染成蓝色，可作为免疫组织化学染色的衬染，清晰地显示血管的轮廓。组织切片经滂胺天空蓝处理后，背景组织细胞呈现很强的红色荧光，所以处理后的切片不宜用红色荧光标记的抗2 7 7 体，但可以用绿色荧光(如F I T C)标记的抗体进行免疫荧光染色，利用组织的红色荧光作对比染色，使得图像对比更加鲜明。另有文献报道，用激光共聚焦显微镜采集图像，采用Q d o t 双共轭与双光子激发扫描的技术可以避免血管切片的自发荧光与多重荧光标记的串扰现象旧J，使用这种技术不用提前去除血管的自发荧光，并能多重荧光标记，值得推广应用。参考文献 1 V i e g a sM S，M a r t i n sT C，S e c oF，e ta 1 A ni m p m v e da n dc o s t e f f e c t i v em e t h o d o l o g yf o r 山er e d u c t i o no fa u t o f l u o r e s c e n c ei nd i r e c ti m m u n o f l u o r e s c e n c es t u d i e so nf o r l n a l i n f i x e dp a r a f l t i n e m b e d d e dt i s s u e s E u rJH i s t o c h e m，2 0 0 7，5 1(1)：5 9-6 6 2 F e r r a r aD E，W e i s sD，C a r n e l lP H，e ta 1 Q u a n t i t a t i v e3 Df l u o r e s c e n c et e c h n i q u ef o rt l l ea n a l y s i so fe nf a c ep r e p a r a t i o n so fa r t e r i a lW a l I su s i n gq u a n t u md o tn a n o e r y s t a l sa n dt w o p h o t o ne x c i t a t i o nl a s e rs c a n n i n gm i c r o s c o p y A mJP h y s i o lR e g u lI n t e 野C o m pP h y s i o l，2 0 0 6，2 9 0(1)：R 1 1 4-R 1 2 3(收稿日期：2 0 0 7-0 8-0 3)(本文编辑：常秀青)欢迎购阅欢迎投稿中华病理学杂志(C h i n e s eJ o u r n a lo fP a t h o l o g y，Z h o n g h i l aB i n g l i x u ez a z l i)，是中国科协主管，中华医学会主办的基础性和高科技学术期刊，我国核心期刊之一；在我国科技期刊中名列前茅。被国内外众多数据库和检索文摘期刊收录，如美国医学索引(M e d l i n e)、美国化学文摘(C A)、俄罗斯文摘杂志(A J)、波兰哥白尼索引(I C)、美国生物学文摘、癌症文献(C a n c e r l i t)、中国期刊全文数据库(C J F D)、中国生物医学文献数据库(C M B)等；2 0 0 1 年入选国家新闻出版署创建的“中国期刊方阵”；在历次国家级评比活动中荣获优秀科技期刊奖：特别荣获2 0 0 2 年新闻出版总署“第二届国家期刊奖提名奖”、2 0 0 5 年“第三届国家期刊奖百种重点期刊奖”和中国科学技术信息所2 0 0 1 年、2 0 0 3 年、2 0 0 4 年和2 0 0 6 年“百种中国杰出学术期刊”称号，2 0 0 7 年获得中国中华医学会系列杂志网上在线订阅通知为加强中华医学会系列杂志整体品牌宣传，扩大中华医学会系列杂志的影响力，做好期刊征订工作，开辟新的发行征订渠道，方便广大读者订阅，中华医学会杂志社在中华医学网上搭建了“中华医学会系列杂志网上在线征订在线支付平台”，现已正式开通。在线订阅不仅改变了原有单一的邮局征订渠道，而且较传统邮局征订具有更大的优势：使期刊征订工作不再是阶段性的，可以实现全年征订；同时网上订阅减少了订阅环节，节约了时间和成本，使杂志订阅更加读者作者编者科协精品科技期刊工程C 类项目。是我国病理学专业的首选期刊。本刊以广大病理医师、基础医学工作者和各临床科室医师为服务对象，报道病理学领域中先进的科研成果和病理诊断经验，反映我国病理学乃至医学领域中的重大进展。现为月刊，每期7 2 页，主要栏目：述评、专家论坛、论著、综述、讲座、技术交流、新技术与病理诊断、学术动态、临床病理讨论、读片讨论、病例报告、专题讨论等，反映了我国病理学发展的新技术、新理念，具有很强的导向性。欢迎广大学者投稿和购阅。本刊地址：1 0 0 7 1 0 北京市东四西大街4 2 号，电话：0 1 0 8 5 1 5 8 2 4 4；传真：0 1 0 8 5 1 5 8 3 7 4E m a i l：c j p a e m a o r g c n。中华医学会杂志社网址w w w m e d l i n e o r g e n。(本刊编辑部)便捷。欢迎广大读者网上在线订阅中华医学会系列杂志，订阅办法：请登陆中华医学网h t t p：w w w。m e d l i n e o r g。c n，点击“在线订阅”也可以登陆h t t p：e b o o k m e d l i n e o r g c n 进行在线订阅和在线支付。网上订阅2 0 0 8 年全年杂志的订户将享受9 折优惠。联系电话：[phone]，传真：[phone]，电子邮件地址：i n f o e m a o r g c n。(中华医学会杂志社市场营销部)万方数据血管组织自发荧光的去除方法及应用血管组织自发荧光的去除方法及应用作者：刘春喜，李大庆，王荣，戚立航，丁士方，张运作者单位：山东大学齐鲁医院教育部和卫生部心血管重构和功能研究重点实验室,济南,250012刊名：中华病理学杂志英文刊名：CHINESE JOURNAL OF PATHOLOGY年，卷(期)：2008,37(4)被引用次数：1次 参考文献(2条)参考文献(2条)1.Viegas MS;Martins TC;Seco F An improved and cost-effective methodology for the reduction ofautofluorescence in direct immunofluorescence studies on formalin-fixed paraffin-embedded tissues外文期刊 2007(01)2.Ferrara DE;Weiss D;Carnell PH Quantitative 3D fluorescence technique for the analysis of en facepreparations of arterial walls using quantum dot nanocrystals and two-photon excitation laserscanning microscopy 2006(01)本文读者也读过(10条)本文读者也读过(10条)1.马凯.纪海霞.严伟.熊颖.张风.刘宁朴.MA Kai.JI Hai-xia.YAN Wei.XIONG Ying.ZHANG Feng.LIU Ning-pu 黄斑营养不良的自发荧光照相观察期刊论文-首都医科大学学报2010,31(1)2.郭彤.张惠蓉 stargardt病与眼底黄色斑点症自发荧光期刊论文-中华眼科杂志2009,45(1)3.王富彬.Fu-Bin Wang 视网膜色素变性晚期自发荧光与中心视力相关性分析期刊论文-国际眼科杂志2009,09(4)4.舒智宇.李平惠 牵牛花综合征合并弱视1例期刊论文-华西医学2006,21(1)5.李鹏婷.施瑜劲.黄恩娥 视锥细胞营养不良2例报告期刊论文-福建医药杂志2006,28(5)6.刘雪清.朱英.古丽努尔托肯 视锥细胞营养不良一例期刊论文-中国实用眼科杂志2008,26(12)7.梁晓东 扩散机制下的异质外延薄膜和弹性导电体的形态失稳及演化学位论文20108.常永业 双眼视网膜视锥细胞视杆细胞营养不良1例期刊论文-中国中医眼科杂志2007,17(5)9.张新媛.Mark Gillies.朱晓青.王鑫.肖媛媛.顼晓琳.申令.高飞.ZHANG Xin-yuan.Mark Gillies.ZHU Xiao-qing.WANG Xin.XIAO Yuan-yuan.XU Xiao-lin.SHEN Ling.GAO Fei 黄斑囊样水肿患者自发荧光与黄斑色素密度的关系期刊论文-眼科2010,19(5)10.肖爱萍.陈惠英.唐云鹏.高烨.XIAO Ai-ping.CHEN Hui-ying.TANG Yun-pen.GAO Ye 部分眼底病眼底自发荧光影像特点初步观察期刊论文-临床眼科杂志2010,18(6)引证文献(1条)引证文献(1条)1.何保丽.马丽花.陈丽玲.刘汝文.杨仁华 应用成人骨髓间充质干细胞建立人-猴肝脏嵌合体期刊论文-中国组织工程研究 2013(45)本文链接：http:/