奶牛乳腺上皮细胞三维培养的形态学观察100305.doc

奶牛乳腺上皮细胞三维培养的形态观察
王秀美1 考桂兰1 高爱武2* 侯先志1 高民3
（1. 内蒙古农业大学动物科学与医学学院，呼和浩特 010018； 2.内蒙古农业大学食品科学与工程学院，呼和浩特 010018；3. 内蒙古农牧业科学院， 呼和浩特 010010）

摘要：本研究利用原代培养后纯化的奶牛乳腺上皮细胞，以Matrigel为基质胶原，进行奶牛乳腺上皮细胞的三维培养，细胞接种浓度分别为1×104细胞/ml、1×105细胞/ml和1×106细胞/ml。经过16天培养后，用DAPI对细胞染色，利用荧光显微镜观察细胞生长状况。结果表明，当细胞接种浓度为1×104—105细胞/ml时，细胞形成了团块状结构，出现了类似腔状的腺泡形态。
关键词：奶牛乳腺上皮细胞；三维培养；基质

1引言
乳腺组织的上皮细胞能以血液中各种营养物质为原料，合成并分泌乳汁。建立可表达泌乳蛋白的乳腺上皮细胞系，能够极大方便乳腺上皮细胞中乳成分基因表达及调控的研究，为进一步研究各种营养因素对泌乳过程的影响奠定基础。
乳腺上皮细胞在体内存在于三维环境中，细胞外广泛分布着胞外基质（extracellular matrix，ECM），它们主要由细胞分泌的蛋白和多糖构成。胞外基质对细胞形态、生长、凋亡和代谢功能起重要的调控作用，如β-酪蛋白的基因转录就受到激素及细胞与基质相互作用的共同协调[1]。乳腺上皮细胞在体内基质环境中，形成中空腔状的腺泡结构。
常规的体外细胞培养都是单层培养（二维培养），形成贴壁生长的单层细胞形态。研究证明，二维生长的人乳腺上皮细胞不能形成腺泡结构，缺失了对生长因子和催乳激素的响应，并且也检测不到分化所产生的蛋白质，如乳清蛋白和β-酪蛋白。但当它们生长于胞外基质成分中时，就能形成腺泡结构，并对激素信号产生响应[2]。类似的关于胞外基质信号对上皮细胞生理和生化的影响在其它组织的研究中也得到了证实[3,4,5]。此外，单层培养的牛乳腺上皮细胞也不能长时间维持乳蛋白的合成与分泌[6,7,8]。上述结果说明，常规的二维细胞培养不能模拟体内乳腺上皮细胞的腺体结构，因此不能提供理想的体外模型以研究细胞的代谢功能[9]。模拟细胞体内生存状态的三维细胞培养技术成为今后细胞培养技术发展的必然趋势。
本试验以奶牛乳腺上皮细胞为研究对象，对传代培养的奶牛乳腺上皮细胞进行三维培养，并比较二维和三维培养的奶牛乳腺上皮细胞的形态学差异，旨在为后续的乳腺上皮细胞三维培养提供合理依据。

2材料与方法
2.1 试验材料
2.1.1 乳腺组织
选取健康的5-7岁泌乳中国黑白花奶牛的乳腺组织。

2.1.2 试剂及仪器
培养基分别为DMEM/F12（高糖型，Gibco公司）和乳腺上皮专用培养基（Sciencell 公司）；根据试验需要，向其中添加胰岛素转铁蛋白ITS, ），表皮生长因子（EGF）、氢化可的松（Hydrocortisone）、标准胎牛血清（FBS，highcolone公司）和Matrigel（Gibco公司），组成及浓度如表1所示。
Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶（Trypsin）、EDTA为Chembasebio 公司生产。使用时，将Ⅱ型胶原酶用基础培养基溶解，制成终浓度为0.5%的溶液，备用。用于消化细胞的胰蛋白酶溶液和EDTA溶液浓度分别为0.25%和0.02%。
细胞培养用其余试剂购自国产公司。除Matrigel外，所有试剂均采用过滤方式除菌，滤膜孔径为0.22μm。
细胞染色用DAPI为Sigma公司产品，染液按照说明书进行配制，备用。
试验所用其它仪器有荧光倒置相差显微镜（Motic公司）、CO2培养箱（香港力康）、超净工作（江苏苏净）及离心机等。

2.2 试验方法
2.2.1 乳腺组织的取样
于呼和浩特市北亚清真屠宰场选择健康的5-7岁泌乳奶牛，屠宰后立即选取乳腺组织，

表1 用于细胞培养的培养基配方
Table 1 The medium composition for cell culture
培养基组成
生长培养基
终止培养基
分析培养基
DMEM/F12基础培养基
860ml
900ml
—
上皮细胞专用培养基
—
—
98ml
胎牛血清（FBS）
100ml
100ml
—

(终浓度：10%l)
(终浓度：10%l)

生长激素（EGF）
10ml
—
—
(贮液浓度：1μg/ml）
(终浓度：10ng/ml)

胰岛素转铁蛋白（ITS）
10ml
—
—
(贮液浓度：500μg/ml)
(Insulin终浓度：5μg/ml)

氢化可的松（He）
10ml
—
—
(贮液浓度：1mg/ml)
(终浓度：10μg/ml)

双抗（Pen/Strep）
10ml
—
—
(贮液浓度：10000unit/ml)
(终浓度：100unit/ml)

Matrigel
—
—
2ml

(终浓度：2%)

经过75%酒精处理后，用灭菌的手术刀、手术剪和镊子于乳腺组织中上部取样。取样时，剪取约50g腺泡丰富、较少导管和脂肪的乳腺组织，立即投入含3×双抗的灭菌PBS缓冲液中，晃动容器冲洗乳腺组织，然后倒掉缓冲液，加入新的缓冲液，再次对所取乳腺组织进行清洗。重复此操作3—5次，直至PBS缓冲液变清亮，说明样品已清洗干净。然后用无菌手术镊子将样品移入一新的含3×双抗的灭菌PBS缓冲液中，置于冰盒内迅速带回实验室，进行后续实验操作。

2.2.2 奶牛乳腺上皮细胞的原代培养
将带回的乳腺组织用75%酒精浸泡约30s，除去表面细菌，然后用含1×双抗的灭菌PBS缓冲液清洗3次，用灭菌手术剪去除酒精浸泡的表面部分，取内部新鲜组织样品，剔除脂肪和结缔组织，然后剪碎为直径1-2mm的微粒。将剪碎的乳腺组织用1×双抗的灭菌PBS缓冲液清洗2-3次，去除组织中牛奶等杂质，然后取适量移入10ml锥底刻度离心管中，加入3倍体积（v/v）的0.5%的Ⅱ型胶原酶溶液，置于37℃、5%CO2饱和的培养箱中，消化处理1-1.5h，其中每间隔20min取出震荡一次，以使组织块彻底消化为单细胞悬液。
消化好的组织样品用100目（孔径）的灭菌尼龙滤网过滤，收集细胞滤液于10ml锥底刻度离心管中，用1×双抗的灭菌PBS缓冲液稀释至最大刻度处，于128g离心8min，弃去上清液，分别用表1中的生长培养基和乳腺上皮专用培养基悬浮所得细胞沉淀，然后分别接种于25ml一次性细胞培养瓶中，于37℃、5%CO2饱和的培养箱中进行培养，用倒置相差显微镜每2天观察一次细胞生长情况。

2.2.3 奶牛乳腺上皮细胞的分离纯化
由于所取样品为乳腺组织，在原代培养的消化过程中，所得为乳腺上皮细胞和成纤维细胞的混合物，因此在培养过程中需要进行乳腺上皮细胞的分离纯化，以得到纯的乳腺上皮细胞。具体方法如下：待原代培养的细胞生长到80—90%汇合时，用胰蛋白酶/EDTA消化液于37℃下消化细胞，待大部分细胞收缩变圆时，向培养液中加入终止培养基终止消化，然后用弯头吸管轻柔吹打培养液，使细胞全部消化下来，悬浮于培养液中。将消化好的单细胞悬液移入10ml锥底刻度离心管仲，于128g离心8min，使细胞沉淀，然后用PBS缓冲液清洗沉淀一次，上述条件离心，弃去上清液，最后用生长培养基悬浮所得细胞沉淀，用弯头吸管轻柔吹打约50次，制成单细胞悬液。
将单细胞悬液用血球计数板进行细胞计数，以1×105细胞/ml的浓度接种于25ml一次性细胞培养瓶中，置于37℃、5%CO2饱和的培养箱中静置10-15min，以使成纤维细胞贴壁，分离上皮细胞。待静置完成后，取出培养瓶于倒置相差显微镜下观察细胞的贴壁情况，将未贴壁的细胞连同培养液一起移入75ml一次性细胞培养瓶中于37℃、5%CO2饱和的培养箱中传代培养，每天观察一次细胞生长情况。已贴壁细胞多为成纤维细胞，弃去不要。待传代培养的细胞生长到80—90%汇合时，重复上述操作4-5次，直至观察到汇合的细胞90%以上为上皮细胞为止，说明得到纯化的上皮细胞，可以用于后续的试验操作。
本研究中，采用两种不同的培养基进行原代培养（DMEM/F12和乳腺上皮细胞专用培养基），在试验中只对DMEM/F12培养的上皮细胞进行分离纯化，乳腺上皮细胞专用培养基培养的细胞直接进行传代培养，采用第2代培养细胞即可进行后续试验。

2.2.4 奶牛乳腺上皮细胞的三维培养
奶牛乳腺上皮细胞的三维培养参照Debnath等（2003）的方法进行[10]。
（1）三维培养基质胶原的准备
将Matrigel 按说明书要求进行处理，然后用移液器将Matrigel加入96孔细胞培养板内，每孔加入50μl，上述操作均在冰上进行。然后将96孔板置于37℃约30min使胶凝固，取出备用。
（2）上皮细胞的准备
将纯化的奶牛乳腺上皮细胞（DMEM/F12培养基和乳腺上皮专用培养基培养）进行消化，方法同上，再制取单细胞悬液，采用分析培养基对细胞进行稀释。然后进行细胞计数，分别制成1×104细胞/ml、1×105细胞/ml和1×106细胞/ml的细胞悬液，备用。
（3）上皮细胞的接种
将上述已知浓度的上皮细胞悬液接种于包被了Matrigel的96孔板中，每孔加样量为160μl，每个浓度接种6孔（其中两种培养基所培养细胞各接种3孔），作为重复样品。然后将96孔板置于37℃、5%CO2饱和的培养箱中进行培养，开始培养时为第0天，每4天换液一次，换液所用培养基也为分析培养基，同时用倒置相差显微镜观察细胞生长状况，第16天结束培养。

2.2.5 三维培养奶牛乳腺上皮细胞的荧光染色及观察
将培养结束后的96孔板取出，用DAPI直接在孔板内进行染色，于荧光显微镜下观察乳腺上皮细胞三维生长的状况。
3 结果与分析
3.1 奶牛乳腺上皮细胞的原代培养
奶牛乳腺上皮细胞的原代培养结果见图1。图1中A和B分别为采用DMEM/F12和乳腺上皮细胞专用培养基进行原代培养的结果。

A DMEM/F12培养基
A DMEM/F12 medium
B 乳腺上皮专用培养基
B mammary epithelial cell medium

图1 奶牛乳腺上皮细胞原代培养结果
Figure 1 Bovine mammary epithelial cells in primary culture

由培养结果可知，对于DMEM/F12培养基，细胞形态主要为成纤维细胞，中间伴随着少量的乳腺上皮细胞。成纤维细胞形成多极或双极形态，而上皮细胞形成铺路石样的形态。因此，在此培养条件下，混合生长的细胞需要进行纯化才可以获得较纯的满足试验要求的乳腺上皮细胞。而乳腺上皮专用培养基培养的细胞90%以上为上皮形态的细胞，说明乳腺上皮专用培养基限制了成纤维细胞的生长，只适合上皮细胞生长，纯度可以满足后续试验需要。
且两种培养基对细胞的生长速度也有不同影响，采用DMEM/F12培养基进行奶牛乳腺上皮细胞的原代培养，细胞生长较快，大约在培养的5-6天达到约90%汇合，可以进行传代培养。而采用乳腺上皮专用培养基进行原代培养时，细胞生长速度较前者慢，约在7-8天才达到约70%汇合，说明乳腺上皮专用培养基在抑制成纤维细胞生长的同时，使上皮细胞的生长也受到一定程度的限制。这种现象可能与培养基的组成有关，我们在采用DMEM/F12培养基进行培养时，向培养体系中加入了10%的胎牛血清，以促进细胞的贴壁和生长。而乳腺上皮专用培养基属于无血清培养基，失去了血清中某些蛋白和因子对细胞的保护、促进作用[11]，可能影响了细胞的生长速度。

3.2 奶牛乳腺上皮细胞的分离纯化
试验结果见图2。
图2为经过4代纯化培养的奶牛乳腺上皮细胞，培养基为DMEM/F12。通过分离纯化后，乳腺上皮细胞的比例约占到总细胞数的90%以上，可以满足后续的试验要求。在对乳

图2 分离纯化后的奶牛乳腺上皮细胞
Figure 2 The purified bovine mammary epithelial cells

腺上皮细胞分离纯化时，我们采用差速贴壁法进行。即利用成纤维细胞和上皮细胞的贴壁时间不同，成纤维细胞先于上皮细胞贴壁的特点，使消化后的混合细胞悬液，在37℃停留15-30min，使大部分成纤维细胞贴壁。而此时上皮细胞仍然悬浮于培养基中，将这些含有大
量上皮细胞的培养液另外进行培养，就实现了上皮细胞与成纤维细胞的部分分离。本研究的结果显示，在经过4次差速贴壁的纯化后，可以达到纯化上皮细胞的目的。相关资料报道，上皮细胞与成纤维细胞的分离纯化需要经过5-7代的传代，本试验传代次数较之减少，可能与培养基配方及动物品种差异等因素有关。

3.3 奶牛乳腺上皮细胞三维培养的形态观察
试验结果见图3、图4。

A 细胞接种密度1×104细胞/ml
A The cells plated at 1×104 /ml
B 细胞接种密度1×106细胞/ml
B The cells plated at 1×105 /ml
C 细胞接种密度1×106细胞/ml
C The cells plated at 1×106 /ml

图3 奶牛乳腺上皮细胞三维培养结果（培养第8天）
Figure 3 Bovine mammary epithelial cells in three-dimensional culture(the 8th day,)

图3为培养第8天时倒置相差显微镜观察结果，其中A、B和C分别为不同细胞接种浓度的细胞生长形态。其中，细胞接种浓度为1×104细胞/ml和1×105细胞/ml时，培养于Matrigel上的乳腺上皮细胞形成了与单层培养明显不同的形态。单层培养的乳腺上皮细胞呈现出快速增殖的特性，培养3天（DMEM/F12）或4天（乳腺上皮专用培养基）后就达到约100%汇合，而且形成了典型的铺路石样的上皮细胞形态（见图2）。而三维培养的乳腺上皮细胞则形成了许多团块状的结构，这种结构与相关文献报道的三维细胞培养结果相似[10,12]，类似于体内正常的腺泡结构。
图4为培养结束，用DAPI染色后于荧光显微镜下观察的结果。在显微镜下可观察到乳腺上皮细胞聚集在一起形成团块，且内层的细胞有凋亡现象，说明乳腺上皮细胞开始出现极化，形成具有中空腔状的腺泡结构。本试验中经过16天的培养，形成了较为完整的腺泡结

D 细胞接种密度1×106细胞/ml
D The cells plated at 1×106 /ml
C 细胞接种密度1×105细胞/ml
C The cells plated at 1×105 /ml
A 细胞接种密度1×104细胞/ml
A The cells plated at 1×104 /ml
B 细胞接种密度1×105细胞/ml
B The cells plated at 1×105 /ml

图4 奶牛乳腺上皮细胞三维培养荧光显微镜观察结果（培养第16天）
Fifure 4 Bovine mammary epithelial cells in three-dimensional culture under fluorescence microscope(the 16th day)

构。但当细胞接种浓度达到1×106细胞/ml时，细胞层叠堆积在一起，生长密度非常大，在显微镜下观察不到单个细胞的生长形态。这一结果说明不同的细胞接种浓度对于三维条件下细胞的生长影响较大，摸索较为适宜的细胞接种浓度对乳腺上皮细胞三维培养体系的建立是比较关键的一步。本研究结果显示，当细胞接种浓度为104—105细胞/ml，可以得到较为理想的三维培养结果。

4 讨论
4.1 不同培养基对奶牛乳腺上皮细胞生长的影响
多年来，Eagle’s低限量培养基（MEM）已成为所有培养基中常用的一种，Dulbecco改良的MEM培养基（DMEM）是为小鼠成纤维细胞设计的，F12是为在低血清浓度下克隆CHO细胞而设计的。F12的营养浓度低，适合于克隆化培养，而DMEM营养成分浓度高，适合于高细胞密度、大量繁殖的培养情况。因此，经过改良配制的DMEM/F12融合了F12营养成分多样而DMEM营养浓度高的特点，得到广泛使用，可以满足许多不同类型细胞的生长需求[11]。
血清中含有各种生长因子，可以促进细胞的繁殖及贴壁。其中，血清中的血小板生长因子（PDGF）是具有有丝分裂原活性的多肽类物质，可能是血清中的主要生长因子，能够刺激成纤维细胞的生长[11]。用DMEM/F12培养基并添加血清进行培养时，可能更多地促进成纤维细胞的生长，抑制乳腺上皮细胞的生长，本试验中在原代培养中出现的成纤维细胞生长较多，乳腺上皮细胞生长不足的现象也说明了这点。我们采用的乳腺上皮专用培养基是一种商业化的用于乳腺上皮细胞生长的选择性无血清培养基，其最主要的优点就是可以有效抑制成纤维细胞的过度生长，促乳腺上皮细胞的生长[11]。因此，试验中采用乳腺上皮专用培养基进行奶牛乳腺上皮细胞的培养时，得到了纯度较高且细胞密度较大的细胞数量，完全可以满足后续的试验要求。但乳腺上皮专用培养基价格较为昂贵，如果大量使用，会增加试验费用，而采用DMEM/F12培养基，经过5-7代纯化后，也可得到纯度较高的奶牛乳腺上皮细胞，同时费用较前者低3-4倍。综合比较，乳腺上皮专用培养基培养时间短，细胞活力高，变异较小，具有较大的优势。

4.2 奶牛乳腺上皮细胞三维培养体系的建立
细胞在胞外基质成分的作用下，形成特定的类似于体内的三维腺泡结构，区别于二维培养上皮细胞的典型铺路石样形态，而且细胞也具有了合成和分泌酪蛋白的能力[13,14,15,16,1]。因此，我们可以利用这样的三维细胞培养体系，有效研究营养物质供给对乳腺上皮细胞内乳蛋白及乳脂肪合成的影响。乳腺上皮细胞三维培养体系的建立，受到多种因素的影响，如不同的培养基质、细胞接种密度、培养方式及培养时间等。
体内乳腺上皮细胞周围的基质膜主要是由一些基质胶原组成的，如层粘连蛋白、整联蛋白及胶原等。目前体外培养中最常用的外源性基质胶原是来自小鼠肉瘤的Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)，它是一种基质混合物，包含有许多基质成分，如胶原、层粘连蛋白、触觉蛋白及其它重要的生长因子[17]，并已实现商品化生产，其商品名为Matrigel。虽然Matrigel含有乳腺上皮细胞生长所需要的许多基质成分，但其直接分离自生物组织，对不同物种细胞生长可能会造成一定影响，而且昂贵的价格也限制了其应用范围。因此，一些研究者采用Ⅰ型胶原或鼠尾胶原进行三维培养的尝试，而且许多人工合成的生物质材料如聚丙烯酰胺凝胶等也被用于细胞三维培养的研究[19]。本研究使用Matrigel作为奶牛乳腺上皮细胞三维培养的基质胶原，培养效果较为理想，但Matrigel价格较高，不适合于大量细胞的三维培养，在今后的研究中可以尝试其它基质材料的应用。
对三维培养来说，不同的研究者采用的细胞接种数量差别较大[19,10,14]，且不同的细胞其接种密度也有不同的要求[19]，这可能与细胞的种类及在基质胶原中的培养方式有关。在进行三维培养时，应考虑不同细胞的生长特性，选择合适的细胞接种密度，以达到细胞三维生长的最佳状态。例如，正常的人乳腺上皮细胞与恶性乳腺肿瘤细胞在EHS中的接种密度就有较大差别，正常细胞要大于恶性肿瘤细胞[19]。在模拟体内环境的过程中，必须考虑细胞与细胞、细胞与基质之间的相互作用，包括细胞之间通过一些特异的基质成分如层粘连蛋白等传递信号，以使乳腺上皮细胞能够表达特定的蛋白或分泌产物[20]。当细胞接种密度太低时，细胞没有足够的数量，可能会导致细胞间缺乏应有的相互协同作用，不利于细胞的生长和分化，从而不能形成有效的具有分泌功能的培养体系。但细胞接种数量太多时，又会使细胞在培养基质内层层叠加，影响细胞的生长速度，形成大小不一的细胞，不利于单个细胞的分析和形成分泌功能稳定的培养体系。本研究选择三种不同的细胞接种浓度，当细胞接种浓度为104—105细胞/ml，能够获得较为理想的三维培养结果。
本研究采用的培养方式为基质胶原顶部培养（on-top culture），不同于传统的植入式三维培养（3D embedded culture）。植入式培养中，细胞随机分布于基质胶原内，导致细胞过多叠加，影响细胞的生长[18]，且细胞完全处于胶原内生长，受到胶原阻力较大，细胞生长困难，生长状态不好，因此需要接种的细胞数量很大。此外，用于三维培养的基质胶原如Matrigel 等均价格昂贵，采用植入式培养，会消耗大量Matrigel，不适合于大量细胞的三维培养[10,17]。而顶部培养恰好弥补了植入式培养的不足，不但节约基质胶原的用量，而且细胞在生长过程中部分伸展进入胶原内，部分向上伸展生长，阻力较小，更利于细胞腺泡结构的形成。
三维培养中，培养时间对乳腺上皮细胞三维结构的形成也是较为关键的影响因素[10,12]。由于每个极化的腺泡结构都是由一个上皮细胞分化而来的[12]，因此，在培养期间，细胞需要经过一系列的增殖和形态变化，然后形成由一层极化的上皮细胞围绕着一个中空腔的腺泡结构。这种腺泡结构的形成需要一定的时间，一般在培养的0-5天，细胞不断增殖，形成许多细胞聚集的细胞团块；5-8天内细胞团块外层与基质胶原接触的细胞发生极化，而团块内部的细胞由于缺乏与基质胶原的接触而不发生极化，因而逐渐凋亡并最终死亡。在这一期间开始出现腺泡结构，并在之后的7-8天内不断完善，培养到大约第16天时，完整的乳腺上皮细胞的三维腺泡结构就形成了[12]。本研究虽然没有检测培养期间奶牛乳腺上皮细胞的形态变化，但在16天的培养之后，出现了类似的腺泡结构。有研究者的报道中培养时间较短[21,1]，可能与细胞的种类、培养方式及接种密度的不同有关。

5 结论
本研究采用纯化的奶牛乳腺上皮细胞，以Matrigel为培养基质，进行奶牛乳腺上皮细胞的三维培养。经过16天的培养，当细胞接种密度为1×104—105细胞/ml时，观察到具有中空腔状结构的乳腺腺泡形态。这一结果表明利用合适的培养基质，可以建立能够模拟体内结构的奶牛乳腺上皮三维培养体系。

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THE THREE-DIMENSIONAL CULTURES OF BOVINE MAMMARY EPITHELIAL CELLS
Wang Xiumei1, Kao Guilan1, Gao Aiwu2*, Hou Xianzhi1, Gao min3
(1 College of animal science and medicine, 2 College of food science and engineering , Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot China 010018; 3 Inner Mongolia Academy of Agriculture and Animal Husbandry, Hohhot China 010010)
Abstract: The three-dimensional cultures of bovine mammary epithelial cells were conducted with Matrigel. The density of the cells plated in cell culture plates were respectively 1×104cells/ml , 1×105cells/ml and 1×106cells/ml. After 16 days culture, the cell were stainned with DAPI and the cell morphology were detected by fluorescence microscope. The results suggested that the cells underwent series growth and formed acinar structures described as mammospheres.
Key Words: bovine mammary epithelial cell, three-dimensional culture, matrix

作者简介：
王秀美，女，蒙古族，1983年11月生。内蒙古农业大学动物科学与医学学院动物营养与饲料科学专业硕士研究生。主要从事奶牛营养调控与分子营养学领域的研究工作。

通讯作者：
高爱武，女，汉族，1969年7月生。内蒙古农业大学食品科学与工程学院教师，副教授，博士。主要从事食品营养与生物技术领域的教学与研究工作。

项目经费来源：
农业部“奶牛产业技术体系”项目子课题，项目编号：nycytx-02-05