藻类叶绿素a的测定.doc

藻类叶绿素a的测定
一、实验名称
藻类叶绿素a的测定
二、实验目的——(水)环境化学中叶绿素a测定意义
在地表水环境的富营养化的研究中，叶绿素a是表征浮游植物生物量的最常用的指标之一。同时，叶绿素a也是用来衡量水体水质，评价水体富营养化水平的标准之一。
三、 实验原理叶绿素介绍
叶绿素是植物进行光合作用的主要脂溶性色素，它在光合作用的光吸收中起核心作用。所有光合器官中都含有叶绿素。叶绿素a和b都溶于乙醇、乙醚、丙酮等，难溶于石油醚，有旋光，主要吸收橙红光和蓝光。因此，这两种光对光合作用最有效。当植物细胞死亡后，叶绿素即游离出来，游离叶绿素不很稳定，光、热、酸、碱、氧、氧化剂等都会使其分解。在酸性条件下，叶绿素中的镁原子很容易被其他酸代替，绿色消失而变黄，叶绿素生成绿褐色的脱镁叶绿素，加热时反应加速。
叶绿素的实验室测量方法有分光光度法、荧光法、色谱法，其中以传统的分光光度法应用最为广泛。根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长下测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。
根据朗伯-比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即：A =α•C•L
式中：α为比例常数。当溶液浓度以百分比浓度为单位，液层厚度为1cm时，α为该物质的吸光系数。各有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和，这就是吸光度的加和性。
（1）单色法
已知叶绿素a的80％丙酮提取液在红光区的最大吸收峰分别为663nm，已知在波长663nm下，叶绿素a在该溶液中的比吸收系数分别为82.04，因此CA=A663/82，可以计算出叶绿素a的含量(mg/L)。
（2）三色法
已知叶绿素a、b的80％丙酮提取液在红光区的最大吸收峰分别为663nm 和645nm，且两吸收曲线相交于652nm 处。因此测定提取液在645nm、663nm、652nm 波长下的吸光值，根据经验公式便可分别计算出叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素的含量。
已知在波长663nm下，叶绿素a、b在该溶液中的比吸收系数分别为82.04 和9.27，在波长645nm下分别为16.75和45.60，可根据加和性原则列出以下关系式：
A663=82.04Ca +9.27Cb………………(1)
A645=16.75Ca+45.6Cb………………(2)
式中A663、A664分别为波长663nm和645nm处测定叶绿素溶液的吸光度值；Ca、Cb分别为叶绿素a、b的浓度(g/L)。
解联立方程(1)、(2)可得以下方程：
Ca=0.0127A663-0.00269A645…………(3)
Cb=0.0229A645-0.00468A663…………(4)
如把叶绿素含量单位由g/L改为mg/L，(3)、(4)式则可改写为：
Ca(mg/L)=12.7A663-2.69A645…………(5)
Cb(mg/L)=22.9A645-4.68A663…………(6)
叶绿素总量CT(mg/L)=Ca+Cb=20.2A645+8.02A663……(7)
叶绿素总量也可根据下式求导
A652=34.5×CT
由于652nm为叶绿素a与b在红光区吸收光谱曲线的交叉点(等吸收点)，两者有相同的比吸收系数(均为34.5)，因此也可以在此波长下测定一次吸光度(A652)求出叶绿素总量：
CT(g/L)=A652/34.5
CT(mg/L)=A652×1000/34.5………(8)
因此，可利用(5)、(6)式可分别计算叶绿素a与b含量，利用(7)式或(8)式可计算叶绿素总量。
从上可见，叶绿素提取后测定又可以分为两种：单色法(663nm)与三色法(645nm、663nm、652nm)。具体使用单色法还是三色法将依据测定对象而定。
在标准方法、超声波法、反复冻融法、延时提取法、热丙酮法、丙酮加热法、热乙醇法、混合溶剂法等多种常见浮游植物叶绿素a测定方法中，针对实验室培养的微囊藻（Microcystis aeruginosa）水华样品为研究对象进行的叶绿素a含量测定。不管是从叶绿素a提取的完全性、测定数据的稳定性、试验操作的简便性考虑等方面来看，包括国家标准方法在内的大多数方法，存在操作耗时长、过程复杂、叶绿素提取不完全的缺点；而以丙酮加热法测量叶绿素a的提取效率高、数据稳定性好，操作耗时短、简便，可推荐作为一种常用的浮游植物叶绿素a的测量方法，尤其是应急监测或大批量水环境样品测定时更显现优势(表1)。
表1 不同提取方法实验耗时情况
测定方法
标准方法
延时提取法
热丙酮法
反复冻融法
超声提取法
丙酮加热法
热乙醇法
混合溶剂法
ρ/(µg·L-1)
0.974
1.011
1.216
1.435
1.517
1.635
1.026
1.397
标准方差
0.149
0.163
0.157
0.064
0.253
0.072
0.077
0.126
变异系数
15.7
16.0
14.7
3.91
16.5
3.26
5.24
9.42
实验耗时/h
8-8.5
7-7.5
9-9.5
24
21
1.5-2
8-9
8-9
丙酮加热法测定的注意事项：随着水浴加热过程温度的升高，丙酮的萃取能力得到增强，而且提取过程耗时短、操作简单，样品基本没有损失。但在实验过程中，加热的时间与温度控制很重要，且需要采取避光措施。温度过高、有光照条件以及加热时间过长，均可能破坏叶绿素a的稳定性。
四、材料、仪器设备及试剂
材料：待测浮游藻；本实验采用蓝藻——产毒铜绿微囊藻（左）与绿藻——蛋白核小球藻（右）。

仪器设备：5mL或1mL移液枪、5mL或1mL枪头、10mL离心管、离心机、锡箔纸、水浴锅、温度计、10mL刻度试管、比色皿、分光光度计。
试剂：80％丙酮。
五、实验步骤
实验一、
确定藻密度的蓝藻藻液。用移液枪吸取2mL蓝藻液置于10mL离心管中，于12000rpm离心5min，用移液枪吸去上清液。藻饼于2mL 80%丙酮中重悬浮，后用锡箔纸完全包裹10mL离心管，并置于光线较暗处55ºC水浴放置30min，后于12000rpm离心5min，吸出上清液转移至10mL刻度试管中，并用80%丙酮定容于5mL，测定663nm处的光吸收值，测定结果按照CA=OD663/82，计算出叶绿素的含量(mg/L)。
实验二、
确定藻密度的绿藻藻液。用移液枪吸取2mL绿藻液置于10mL离心管中，于12000rpm离心5min，用移液枪吸去上清液。藻饼于2mL 80%丙酮中重悬浮，后用锡箔纸完全包裹10mL离心管，并置于光线较暗处55ºC水浴放置60min，后于12000rpm离心5min，吸出上清液转移至10mL刻度试管中，并用80%丙酮定容于5mL，测定663nm处的光吸收值，测定结果按照CA=A663/82，计算出叶绿素a的含量(mg/L)。
用移液枪吸取2mL绿藻液置于10mL离心管中，于12000rpm离心5min，用移液枪吸去上清液。藻饼于2mL 80%丙酮中重悬浮，后用锡箔纸完全包裹10mL离心管，并置于光线较暗处55ºC水浴放置30min，后于12000rpm离心5min，吸出上清液转移至10mL刻度试管中，并用80%丙酮定容于5mL，测定663nm、645nm、652nm处的光吸收值，测定结果按照三色法公式，可计算出叶绿素a、叶绿素b与总叶绿素的含量(mg/L)。
根据下式，计算出原藻液中各叶绿素的含量(mg/L)：

根据下式，计算出不同藻液中单个细胞各叶绿素的含量(g/个细胞)：

六、实验数据处理
在不同波长下分别测蓝藻和绿藻的吸光度，数据记录如下表：

663nm
645nm
652nm
蓝藻
0.772
—
—
绿藻
0.052
0.029
0.039
对蓝藻的叶绿素计算用公式CA=OD663/82，计算结果见下表45.6
对绿藻的叶绿素a、叶绿素b与总叶绿素分别用公式：
Ca(mg/L)=12.7A663-2.69A645
Cb(mg/L)=22.9A645-4.68A663
CT(mg/L)=A652×1000/34.5
计算结果如下表：

叶绿素a（mg/L）
叶绿素b（mg/L）
总叶绿素（mg/L）
蓝藻
0.0094
—
0.0094
绿藻（三色法）
0.5824
0.4207
1.0031
绿藻（单色法）
0.6341
0.6360
1.2701
根据下式，计算出原蓝藻和绿藻溶液中各叶绿素的含量(mg/L)：

结果见下表：

叶绿素a（mg/L）
叶绿素b（mg/L）
总叶绿素（mg/L）
蓝藻
0.0235
—
0.0235
绿藻
1.4560
1.0518
2.5078
根据下式，计算出蓝藻和绿藻中单个细胞各叶绿素的含量(g/个细胞)：

蓝藻藻液密度为3.3x107个/mL，即每毫升蓝藻藻液中含有3.3x107个蓝藻细胞。

绿藻藻液密度为8.4x107个/mL，即每毫升绿藻藻液中含有8.4x107个绿藻细胞。
结果见下表：

叶绿素a（g/细胞）
叶绿素b（g/细胞）
总叶绿素（g/细胞）
蓝藻
7.1x10-13
—
7.1x10-13
绿藻
1.735x10-11
1.252x10-11
2.987x10-11

七、 结果与讨论
（1）请说明蓝藻只采用单色法测定叶绿素的原因。
单色分光光度法测定叶绿素含量时，要测定665和750nm处的吸光度。蓝藻只含有叶绿素a，不含有叶绿素b，所以只采用单色法测定叶绿素。
（2）请比较绿藻单色法与三色法测定结果的差异，并说明理由
从单色法与三色法的测定结果比较得出，一般单色法测定的Chl-a的数值要高于三色法。因为，单色法计算所得的叶绿素a的含量是在663nm处所有吸光的叶绿素含量，不仅仅包括叶绿素a，还有部分叶绿素b，而三色法计算所得的叶绿素a减去了在663nm处吸光的叶绿素b的含量，计算所得的是纯叶绿素a的含量，所以单色法的测定结果要高于三色法的测定结果。
（3）试分析叶绿素含量单位mg/L与g/个细胞的意义，与可能适用的情况。
叶绿素含量以mg/L为单位时表示的是每升藻液中叶绿素的含量，而以g/个细胞为单位时表示的是藻液每个细胞内含有的叶绿素的含量，后者体现了藻密度对叶绿素含量的影响。当需要表示藻类叶绿素的总体含量时用mg/L为单位，要表示藻类单个细胞中叶绿素含量高低时用g/个细胞。