实时荧光定量RT-PCR法检测膀胱移行.pdf

论 著实时荧光定量 RT-PCR 法检测膀胱移行细胞癌 VEGF 的表达和意义安全意1,张金刚2,刘德斌3,李 成4,马可为5,姜丽萍6 【摘要】目的 建立实时荧光定量逆转录-多聚酶链反应(real-time quantitative,RT-PCR)检测膀胱移行细胞癌(BTCC)组织 VEGF mRNA 表达的方法,并验证其与免疫组织化学检测 VEGF 蛋白表达的相关性。方法 采用免疫组织化学SP 法和实时荧光定量 RT-PCR 法分别从蛋白水平和 mRNA 水平检测了 31 例 BTCC 和 15 例正常膀胱黏膜组织中 VEGF 的表达。结果 BTCC 中 VEGF mRNA 表达水平显著高于正常组,两组比较差异有显著性(P 0.05);BTCC 中表达水平在高分化组与中低分化组之间、Tis-T1 期与 T2-T4 期间的差异均有显著性(P 0.05)。VEGF 的阳性表达率在 BTCC 组中为 100%,显著高于正常组(P 0.05),在高分化组与中低分化组之间、Tis-T1 期与 T2-T4 期间的差异均有显著性(P 0.05)。结论 本研究所建立的用于检测人 BTCC 组织 VEGF mRNA 表达的实时荧光定量 RT-PCR 方法,是一种快速有效、灵敏度高、特异性好的定量检测方法,与免疫组化 SP 方法检测的 VEGF 蛋白表达具有良好相关性,可作为研究膀胱肿瘤的生物学行为和判断预后的参考指标。【关键词】膀胱癌;血管内皮生长因子;免疫组织化学;实时荧光定量 RT-PCR 【中图分类号】R737.14 【文献标识码】A 【文章编号】1606-8106(2009)02-0081-05Detection of VEGF mRNA in bladder transitional cell carcinoma by real-timefluorescence quantitative RT-PCRAN Quan-yi,ZHANG Jin-gang,LIU De-bin,et al.The Police Group of Dalate Qi,Neimenggu 014300,China【Abstract】Objective To establish a real-time fluorescence quantitative RT-PCR for detection of VEGFmRNA expression in bladder transitional cell carcinoma(BTCC)and verify the correlation with protein expressiondetected by the immunohisochemistry method.Methods Total RNA was extracted with Trizol from the tissues andmRNA was transcribed reversely into cDNA.The real-time quan-titative RT-PCR was used to detect the ex2pression of VEGF mRNA in 31 in BTCC and 15 control normal bladder mucosa tissues.The immunohistochemistrySP method was used to evaluate the protein expression of VEGF.Results The expression of VEGF mRNA was sig2nificantly higher in BTCC tissues than that in the normal bladder mucosa tissue tissues(P 0.05).BTCC expres2sion levels in well-differentiated group and between groups of poorly differentiated,Tis-T1 with T2-T4 perioddifferences were statistically significant(P 0.05).Conclusion Real-time fluorescence quantitative RT-PCRused to detect the expression of VEGF mRNA might be a reliable method for early diagnosis of BTCC.The expres2sion of VEGF mRNA is correlated with that of the VEGF protein significantly.It can be used to study the biologicalbehavior of bladder cancer and judg the prognosis.作 者单位:1 014300 内蒙 古鄂尔 多斯,鄂 尔多 斯市达 拉特旗 公安 局刑警 大队2 017000 内蒙 古鄂尔 多斯,鄂 尔多 斯市东 胜区公 安局 刑警大 队3 010011 内蒙 古呼和 浩特,内 蒙古 自治区 人民检 察院 技术处4 100112 内蒙 古呼和 浩特,内 蒙古 武警总 队医院5 010015 内蒙 古呼和 浩特,内 蒙古 自治区 医院6 010059 内蒙 古呼和 浩特,内 蒙古 医学院 基础医 学院(通 讯作 者)18中华中西医杂志 Chinese Journal of Traditional&Western Medicine 2009 年第 10 卷 第 2 期【Key words】bladder cancer;vascular endothelial growth factor;immunohistochemistry;real-time fluorescencequantitative RT-PCR 膀胱肿瘤是泌尿系统最常见的恶性肿瘤,其中膀胱移行细胞癌(bladder transi-tional cell carcino2ma,BTCC)占 90%以上,且复发率极高,复发后肿瘤恶性度可增高、浸润、转移等行为有增强趋势。此过程与肿瘤细胞外基质的降解、新生血管的大量形成有密切关系。血管内皮生长因子(vascular endothe2lial growth factor,VEGF)是血管内皮细胞的特异性有丝分裂原,能促使肿瘤的血管生成、血管内物质外渗、为肿瘤细胞血管生长和迁移提供基质。在肿瘤发生发展过程中起重要作用。血管内皮生长因子(VEGF)是调节肿瘤血管生成的重要因子,具有促进血管内皮细胞有丝分裂,增强血管通透性,促进内皮细胞增殖并延缓其凋亡等多重功能 1。近来研究者在多种恶性肿瘤组织中检测到 VEGF 的高表达,并推测其与 肿瘤生 长和 转移密 切相 关 2,3;与BTCC 血管生成相关的多种促血管生成因子中,组织 VEGF 表达含量最高,可能与 BTCC 浸润和转移密切相关,可作为预后判断的重要指标之一。但以往检测组织中 VEGF 的表达主要采用免疫组化和常规 PCR 技术,国内尚未见采用实时荧光定量 PCR检测 BTCC 组织 VEGF mRNA 表达的报道,国外亦极少见报道。本 研究拟 建立 实时荧 光定 量 RT-PCR 测定 BTCC 组织 VEGF mRNA 表达的方法,并验证其与免疫组织化学 SP 方法检测 VEGF 蛋白表达的相关性。并结合 BTCC 的病理分级 和临床分期,探讨了 VEGF 在 BTCC 发生发展中作用,以期为BTCC 准确的临床诊断、治疗和评价预后提供依据。1 资料与方法1.1 一般资料 BTCC 样本选自伊盟医院泌尿外科 15 例和内蒙古自治区医院 16 例,其中男 21 例,女 10 例,平均 60.91 岁。所有标本均经病理检查证实。所有患者术前均未行药物化疗、放射治疗、免疫或生物治疗。按 WHO 标准病理分级:G1,G2,G3。临床分期按分期采 UICC-TNM 标准:浅表性(Tis-T1),浸润性(T2-T4)。另取 15 例正常膀胱黏膜作为对照。全部标本平均分成两份,一份经 4%中性甲醛溶液固定,石蜡包埋、切片,并行 HE 和免疫组织化学染色。另一份经生理盐水清洗后投入液氮罐中,移入-70低温冰箱贮存备用。1.2 免疫组化法1.2.1 具体操作 按即用型 S-P 试剂盒说明书进行。一抗分别为鼠抗人 VEGF 多克隆抗体,每次实验均设阳性及阴性对照,VEGF 阳性对照为已知胃癌的免疫组化染色阳性片,阴性对照为 PBS 液替代一抗。1.2.2 结果判定标准 高倍显微镜(400)下观察 5 个视野,每个视野计数 100 个细胞,以阳性细胞百分率和染色强度为判定标准 4,5。胞质无染色为阴性(-);阳性细胞数 60%为强阳性(+)。1.3 实时荧光定量 RT-PCR 法1.3.1 试剂和仪器 试剂:Trizol 试剂(Gibco 公司,美国),逆转录酶 M-MLV(Promega 公司),Taq酶(Sangon 公司),DEPC(Sigma 公司),引物 荧光探针合成 和 PCR 反应 试 剂 盒(上 海 生 工 公司):VEGF 上 游 引 物 序 列 为 5 -ATGAACTTTCTGCT2GTCTTGG-3,下 游 引 物 序 列 为 5 -TCACCGCCTCGGCTTGTCACA-3;-actin 上游引物序列为5-GATTGGAATCTGGCTACT-3,下游引物序列为5-TAGGGCTGAAGACAGGG-3;仪器:实时定量PCR 仪(美国 MJ OPTICON-2)。1.3.2 RNA 提取和反转录 按照大连宝生物工程有限公司 Trizol 总 RNA 提取试剂说明 提取 RNA。用紫外分光光度计及琼脂糖凝胶电泳检提取到的RNA 的完整性、纯度和含量。剩余 RNA 于-70保存备用。反转录前直接将6.5 l 的 RNA 加入到反转录体系中合成 cDNA。反应体系为 10 l,其中 PrimeScriptRT Enzyme Mix I 0.5 l(TaKaRa DRR037S)、5 Prime2Script Buffer 2 l、Random 6mers(引物)0.5 l、OligodT Primer(引物)0.5 l。于 PCR 仪进行反转录,反应条件为:3715min,85 5s。28中华中西医杂志 Chinese Journal of Traditional&Western Medicine 2009 年第 10 卷 第 2 期1.3.3 实时定量 PCR 采用 SYBR Green I 荧光染料法进行实时定量 PCR 扩增的检测。PCR 反应体系为20 l,其中2 SYBRpremixEXTaq TM10 l(TaKaRaDRR041A)、上下游引物各 0.4 l(10 mol/L)、cDNA2 l、dH2O 7.2 l。于实时定量 PCR 仪(美国 MJ OP2TICON-2)分别进行 VEGF 和-actin 的 PCR 反应,扩 增条 件 为:95 预变 性 30s;95 变 性 10s,58退火 15s,72延伸 10s,45 个循环后,72延伸10min。反应过程中同时设阳性对照,以水替代 cD2NA 为 阴 性 对 照。VEGF mRNA 相 对 表 达量 采 用2-CT进行计算,CT=CTVEGF-CT-actin。1.3.4 PCR 扩增产物特异性的确定 PCR 产物经单一熔解曲 线峰进 行确 定,并取 5 l PCR 产 物经2%琼脂糖凝胶电泳(100V,15min)确定扩增产物片段大小后,送交上海生工进行序列测定。1.4 统计学分析 应用 SPSS 11.0 统计软件采用2检验及相关性分析,P 0.05 为差异有显著性统计免 疫组化结 果;采用进行 单因子方 差分析 P 0.05为差异有显著性统计荧光定量 PCR 结果。2 结果2.1 免疫组化结果2.1.1 BTCC 组与正常对照组的关系 VEGF 的阳性染色主要位于癌细胞胞浆内,呈弥散性分布,部分间质细胞也有表达(见图 1 3)。在正常膀胱黏膜细胞中均不表达或低表达,而在 BTCC 中阳性表达率 分别 为 100%。两组 比 较 差 异有 显 著 性(P 0.05)(如图 1 3,表 1)。表 1 BTCC 组与正常对照组 VEGF 的表达(%)BTCC 组正常对照组阴性013/15(0K.87)弱阳性8/31(0z.26)2/15(0D.13)中阳性12/31(0.39)0?强阳性11/31(0.35)0?阳性率3100%3 313%3阴性率0.00%87%注:BTCC 组与 正常对 照组比 较差异 有显著性(P 0.05)2.1.2 VEGF 表达与病理分级、临床分期的关系 VEGF 分别在 BTCC 的病理分级和临床分期中表达的差异均有显著性(P 0.05,见表 2)。表 2 VEGF 在 BTCC 病理分级及临床分期中的阳性表达指标(VEGF)病理分级(%)G1LG2G3临床分级(%)Tis-T1T2-T4弱阳性2/31(0C.06)3/31(0.1)3/31(0.1)2/31(0o.06)6/31(0.19)中阳性1/31(0C.03)3/31(0.1)8/31(0.26)1/31(0o.03)11/31(0.35)强阳性01/31(0.03)10/31(0.32)1/31(0.03)10/31(0.32)阳性率9.68%#22?.58%67.74%12.90%387&.09%注:G2、G3 与 G1 比较有统计学意义(P 0.05),T2-T4 与 Tis-T1 比较有统计学意义(P 0.05)2.2 实时荧光定量 PCR 结果 实时定量 PCR 检测 BTCC 组和正常对照组 VEGF 的 mRNA 的变化(见图 4)。3 讨论VEGF 是一种由肿瘤细胞分泌的二聚体多肽,相对分子量为 34 45KD,基因定位于 6P21.3,有 5种分子变异体 6。一些直接、间接的证据已经证明肿瘤生长是血管依赖的 7。与大多数实体的恶性肿瘤一样,BTCC 的发生发展依赖血管生成 8。肿瘤进展过程中肿瘤组织可分泌多种因子和多种蛋白水解酶类,特别是 VEGF 转移到内皮细胞和血管基底膜表面,以促进内皮细胞分裂,增加毛细血管的通透性,利于内皮细胞的增殖和迁移,促进肿瘤新生血管的形成。同时 VEGF 还能促进内皮细胞和恶性肿瘤细胞表达整合素,以利用肿瘤细胞的迁移、黏附和浸 润 9。BTCC的分 级越高,细胞 的分化水 平就越38中华中西医杂志 Chinese Journal of Traditional&Western Medicine 2009 年第 10 卷 第 2 期图 4 BTCC 组在不同病理分级与临床分级中 mRNA 相对表达量变化G2、G3、T2-T4 与 control 相比较 P 0.05低,细胞的生长就越活跃,这可能是在肿瘤组织和患者的血液研究中,都得出随着肿瘤的病理学分级的升高,组织和血液中的 VEGF 含量都逐步升高的原因,浸润性肿瘤的细胞生长当然比浅表性肿瘤的细胞生长要活跃,可见,浸润性肿瘤的细胞 VEGF 的含量当然要比浅表性肿瘤细胞 VEGF 的含量高。免疫组化研究发现正常组织中 87%无 VEGF 阳性表达,而 31 例 BTCC 组织中 VEGF 阳性表达为 100%,且随着病理级别的增高,VEGF 阳性信号明显加强,进一步表明了 VEGF 蛋白在 BTCC 中的表达与 BTCC细胞的分化程度有关系,在浸润癌中 VEGF 的阳性信号明显高于浅表癌,提示 VEGF 表达与膀胱癌细胞的浸润能力有关。实时 RT-PCR 是一种能精确测定基因 mRNA表达水平的荧光检测系统,在每一个 RT-PCR 循环的延伸阶段,基因产物都有一次定量检测,这种新方法和传统 RT-PCR 相比有很多优点。本研究采用实时 RT-PCR 定量方法进行 BTCC 组织 VEGF mR2NA 定量分析,结果显示,BTCC 组织中 VEGF mR2NA 表达水平明显高于正常组织(P 2500g,身长 50cm左右)随机分为两组;观察组(泳疗组)50 例;对照组 50 例。观察测定两组新生儿夜间睡眠变化。结果 两组新生儿夜间睡眠差异有显著性。结论 新生儿泳疗有利于新生儿睡眠增加而促进生长发育。【关键词】泳疗;新生儿睡眠;观察 【中图分类号】R722 【文献标识码】B 【文章编号】1606-8106(2009)02-0085-02 泳疗对婴幼儿生长发育的促进作用已被越来越多的人所接受。我科总结国内外先进的技术,开展了新生儿泳疗对新生儿睡眠影响。现将临床研究结果报告如下。1 资料与方法1.1 研究对象 选取 2006 年 12 月2007 年 10 月在我院产科出生的新生儿 100 例经家属同意随机分成两组观察组(泳疗组)50 例,对照组 50 例。两组母婴均无妊娠合并症及并发症,阿普卡评分 10 分。1.2 研究方法 根据新生儿体质较弱的特点,在泳疗时需要对水质,水温,室温严格控制;水质;新生儿泳疗时用的水要 1 人 1 池 1 水。水温;水温要求在38 40之间。室温;室温保持在 26 32之间。肚脐;泳疗前要对新生儿的肚脐进行消毒后,使用防水护脐贴保护脐部,泳疗完毕后取下护脐贴,泳疗前后均用碘伏消毒脐部,无一例脐炎发生。适当的泳疗时间;应在新生儿安静不哭不闹,不饥饿的情况下进行泳疗。使用专用游泳项圈,避免新生儿发生呛水。专业护士陪伴;新生儿泳疗时需要专业护士的陪伴,受过专业训练的护士了解新生儿怎样的反射动作并准确判断害怕或是喜欢,可以适时给予作 者单位:133000 吉林延 吉,延边 大学医 院安抚或回应。新生儿出生 24h 后至围产期内进行泳疗(10 15min,1 天 1 次),吃奶后 1h 后进行。由经过专门培训合格护士操作,操作过程;选用中国优生科学协会,中华医学会,围产医学分会主办,北京英勇宝贝科贸有限公司协力的,新生儿泳疗金太阳健康工程 研制生产国际医药级无损伤材质的双保险新生儿游泳圈及游泳池。医院游泳池大小 50cm 65cm 55cm 水深 50cm,泳疗用水为洁净水。新生儿期的泳疗内容为 5min 关节操,10min 新生儿自主游两部分,由经过专门培训合格的护士进行操作,整个操作过程均为一对一进行。1.3 观察项目 观察并记录泳疗新生儿与不泳疗新生儿的夜间睡眠及哭闹变化。2 结果两组新生儿睡眠水平变化比较。婴幼儿泳疗可以促进新生儿睡眠水平提高,明显高于未进行泳疗的新生儿。3 讨论新生儿泳疗,其历史可追溯到 20 世纪 60 年代欧美兴起的婴幼儿游泳,对象一般为 8 个月以上的婴儿,40 多年来理论逐渐成熟,技术日益完善,但一直 未突 破出 生后6 个月 禁区 1。我们 借鉴 国际 经(下转第 91 页)58中华中西医杂志 Chinese Journal of Traditional&Western Medicine 2009 年第 10 卷 第 2 期