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1、硝化细菌的分离与鉴定 要筛选生长速度快、硝化作用强的硝化细菌用于水产养殖水处理。硝化细菌包括亚硝化 菌和硝化菌两个生理菌群，分别可将水中的氨态氮转化为亚硝酸盐和硝酸盐。实验结果 表明经5周培养，亚硝化菌可使培养液中的氨氮含量下降到60％，硝化菌可使培养液中的 亚硝酸盐含量下降到 60％。实验可通过测定培养液中亚硝酸盐的含量变化来测定细菌的 氨转化作用或硝化作用。 关键词：硝化菌，亚硝化菌，硝化作用，筛选。 氨氮和亚硝酸盐都是在水产养殖过程中产生的有毒物质，且亚硝酸盐还是强烈的治癌物 质，因此如何降解这两种物质，是科学工作者近年来的工作重点。 硝化细菌
2、是一类具有硝化作用的化能自养菌，包括硝化菌和亚硝化菌两个生理菌群，其 主要特性是自养性，生长速率低，好氧性，依附性和产酸性等。可通过NH4+→ NO2- → NO3-这一过程将NH4+转化为NO3-。能有效降低水体中氨氮及亚硝酸氮的含量，对水产养 殖业及环境保护具有重要意义。硝化细菌是生物硝化脱氨中起主要作用的微生物，直接 影响硝化效果和生物脱氨的效率。 研究表明，水体中硝化细菌的浓度对生物脱氨具有十分重要的意义，由于大多数硝化细 菌生长缓慢，硝化及脱氨效果欠佳，处理水产养殖污水的效果不是很好。因此筛选出生 长速率高硝化作用强度大的硝化细菌有很大的用途。 本
3、文对硝化细菌的研究主要在富集培养和固定化细胞方面，能够有效提高硝化细菌的产 率和硝化细菌的利用率。通过富集培养的硝化细菌浓度是未经富集培养的12.5～20.0倍 ，利用细胞固定化技术可使氨氮去除率提高16.5个百分点。国外在硝化细菌的培养方面 的研究已有一些专利技术，其中一些已形成工业化生产，但产品价格较昂贵，并且必须 不断向反应器中补充流失的硝化细菌。硝化作用包括两个步骤：氨转化为亚硝酸盐和亚 硝酸盐转化为硝酸盐，这两个步骤分别由亚硝化菌和硝化菌完成，至今还未发现有能将 氨直接转化为硝酸盐的细菌。 氨和亚硝酸分别是亚硝化菌和硝化菌的唯一能源。对于硝化细菌来说生长
4、环境中的温度 对其影响较大，pH值和盐度的影响相对较小。大多数硝化细菌的合适生长温度为10～38 ℃，高于20℃时硝化细菌的活性较高，但超过38℃消化作用将会消失。当环境气温低于 20℃时，氨的转化会受到影响。 一般认为，适宜硝化菌和亚硝化菌生长介质的pH值分别为6.0～8.5和6.0～8.0。水体DO 的高低影响到好氧、厌氧微生物的比例，大多数研究人员认为DO的浓度应当控制在1.0～ 2.0 mg/L，低于0.5 mg/L时硝化作用明显减弱。另外，碳氮比、碱度等对硝化及脱氨均 有影响。 本文中筛选硝化细菌的依据主要是生长速率和硝化作用强度，生长速率主要采用
5、活菌计 数，因为硝化细菌的液体培养基中有沉淀，用OD600测的值误差较大。氨转化效率和硝化 作用强度主要用比色法测定，利用亚硝酸根的显色反应。亚硝化菌测定其培养液中亚硝 酸根的增加量，硝化菌测定其亚硝酸根的减少量。 1 材料和方法 1.1 实验材料 1.1.1 菌种 由海洋中分离得到 1.1.2 培养基 亚硝化菌培养基 (NH4)2SO4 0.5g NaCl 0.3g FeSO4•7H2O 0.03g K2HPO4 1g MgSO4•7H2O 0.03g CaCl2 7.5g 蒸馏水 1000ml PH 自然固体培养
6、基加5％琼脂 硝 化菌培养基 NaNO2 1g MgSO4•7H2O 0.03g MnSO4•4H2O 0.01g K2HPO4 0.75g Na2CO3 1g NaH2PO4 0.25g 蒸馏水 1000ml PH 自然固体培养基加5％琼脂 肉汤培 养基牛肉膏 0.5％蛋白胨 1％氯化钠 0.5％琼脂 2％ 1.1.3 试剂 牛肉浸膏 上海长阳生化制药厂蛋白胨 上海东海制药厂磷酸氢二钾 浙江临平化工试剂厂 磷酸二氢钠 南京化学试剂一厂磷酸氢二钠 南京化学试剂一厂氯化钠 南京化学试剂一厂 MnSO4•4H2O 南京化学试剂
7、一厂琼脂 江苏疾病预防控制中心微生物试剂厂（NH4） 2SO4 南京化学试剂一厂 FeSO4•7H2O 上海试剂二厂 MgSO4•7H2O 上海试剂 四厂 CaCl2 华东师范大学化工厂 Na2CO3 上海虹光化工厂 NaNO2 淮安化工二厂磺胺酸 天津瑞金特化学品有限公司 α-萘胺 上海泗联化工厂 1.2 实验方法 1.2.1 硝化细菌的分离 将采集到的海水样本分别放在两个培养皿中，分别加入亚硝化菌液体培养基和硝化菌液 体培养基，放在24℃地培养箱中培养5天，然后取培养液在固体培养基上进行分区划线， 得到单菌落，再挑取单菌落进行
8、分区划线分离。 1.2.2 形态结构鉴定 （1）将分离得到的单菌落分别接种到肉汤培养基的平板上看其是否生长（硝化细菌是严 格的自养菌，在肉汤培养基上不能生长）。 （2）镜检观察：单染色法 （3）在培养液中加入格利斯试剂，亚硝化菌培养液变红即可判断为阳性，硝化菌的培养 液需比色计算出其亚硝酸根浓度是否降低，才能判断是否为硝化菌。 1.2.3 细菌的培养（摇瓶、发酵罐） （1）摇瓶培养：将初步鉴定是硝化细菌的菌落接种到摇瓶中20-28℃培养，200转/分钟 ，每隔五天取样一次测硝化作用强度和菌浓度。 （2）发酵培养：将培养5天的种子加入发酵罐中
9、于20-28℃培养，其中pH控制在6.0以 上。每隔12小时取样测亚硝酸根浓度和菌浓度。 1.2.4 硝化作用测定 1.2.4.1 试剂 （1）格利斯试剂溶液Ⅰ：称取磺胺酸0.5g，溶于150ml醋酸溶液（30％）中，保存于棕 色瓶中。 溶液Ⅱ：称取α-萘胺0.5g，加入50ml蒸馏水中，煮沸后，缓缓加入30％的醋 酸溶液150ml中，保存于棕色瓶中。 （2） 2%醋酸钠溶液 将2g无水醋酸钠加入到100ml蒸馏水中，混匀溶解。 1.2.4.2 方法 ☆标准曲线的绘制 ①称取4.500g分析纯亚硝酸钠于干燥的小烧杯中，加蒸馏水溶解后洗入1
10、00ml容量瓶中， 加蒸馏水至刻度定容，摇匀，溶液中NO2-的浓度为30mg/ml，用时稀释至NO2-为0.03 mg/ml。 ②吸取NO2-标准液（NO2-0.03 mg/ml）0、1、2、3、4、5 ml，分别放入50 ml容量瓶中 ，每一容量瓶NO2-浓度为0、0.6、1.2、1.8、2.4、3.0μg/ml；各加入1 ml格利斯试剂 Ⅰ，放置10分钟，再加入1 ml格利斯试剂Ⅱ和1ml2％醋酸钠溶液，显色后稀释至刻度。 ③用分光光度计于520nm处比色，以浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制标准曲线。 ☆培养液中NO2-测定 ①亚硝化菌氨转化作
11、用测定 取1 ml培养液于50 ml容量瓶中，加入1 ml格利斯试剂Ⅰ， 放置10分钟，再加入1 ml格利斯试剂Ⅱ和1ml2％醋酸钠溶液，显色后稀释至刻度。用分 光光度计于520nm处比色。 ②硝化菌硝化作用强度测定 取1 ml培养液稀释100倍（视培养液中NO2-浓度而定），取 稀释后的培养液1 ml于50 ml容量瓶中，加入1 ml格利斯试剂Ⅰ，放置10分钟，再加入1 ml格利斯试剂Ⅱ和1ml2％醋酸钠溶液，显色后稀释至刻度。用分光光度计于520nm处比色 。 ☆结果计算 ＠标准曲线以浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制标准曲线。回归得到方程y=ax+
12、b ＠亚硝酸根浓度= ，mg/ml d=稀释倍数 1.2.5 细菌浓度测定 （1）取0.1ml培养液加到0.9ml生理盐水中，混匀，就得到10－1的菌悬液，再取出0.1ml 加到0.9ml生理盐水中，得到10－2的菌悬液，同样方法依次稀释到10－3、10－4的菌悬 液，具体情况视菌悬液浓度而定。 （2）将稀释好的菌悬液取0.1ml，与冷却到50℃的琼脂培养基混匀，于24℃培养5天，进 行计数。 2 结果 2.1 亚硝酸盐浓度测定标准曲线用亚硝酸根标准液，加入格利斯试剂，于752分光光度计 上520nm处比色，以亚硝酸根浓度为横坐标，A值为纵坐
13、标，绘制标准曲线。见图1。 图1 亚硝酸盐浓度测定的标准曲线 Fig 1 The standard curve of nitrite detection 2.2 硝化细菌的鉴定 2.2.1 形态结构鉴定—单染色法经单染色法观察，亚硝化菌为椭圆形球菌，体积较大； 硝化菌体积较小。与文献所述相同。见图2和图3。 图2 亚硝化菌的形态 Fig 2 The morphology of sub-nitrobacteria 图3 硝化菌的形态 Fig 3 The morphology of nitrobacteria 2.2.2 培养特征将挑选出来的菌落接种到肉汤琼
14、脂培养基上，没有生长，可以认为该菌 为自养菌。（硝化细菌是严格的自养菌不能在肉汤培养基上生长） 2.2.3 硝化作用鉴定将亚硝化菌和硝化菌接种到液体培养基中，于24℃培养5天，在亚硝 化菌的培养液中加入格利斯试剂，溶液变红可以判断为亚硝化菌；将硝化菌的的培养液 取出1ml稀释100倍，加入格利斯试剂，于752分光光度计上比色，看其中的亚硝酸根含量 减少，可以断定为硝化菌。 2.3 氨转化作用和硝化作用 2.3.1 亚硝化菌的氨转化作用亚硝化菌经过5周的摇瓶培养能使培养液中亚硝酸根的浓度 能上升到300 μl/ml以上，说明其具有亚硝化作用。实验结果见图4。
15、 图4 亚硝化菌的 氨转化作用 Fig 4 The ammonia conversion of sub-nitrobacteria 2.3.2 硝化菌的硝化作用硝化菌经过10天左右的发酵培养可使发酵液中的亚硝酸根浓度 下降40％左右。实验结果见图5。 图5 硝化菌的硝化作用 Fig 5 The nitrification of nitrobacteria 2.4 硝化细菌的培养 2.4.1 发酵培养硝化细菌的pH值变化由于硝化细菌产酸，发酵罐中的pH值一直呈下降的 趋势，但是由于酸性环境不利于硝化细菌的硝化作用，所以pH值最好控制在6.0以上。实 验结果
16、见图6。 2.4.2 发酵培养硝化细菌溶氧的变化硝化细菌是一种好氧的自养菌，由于硝化细菌生长 速度缓慢，发酵液中的菌浓度一直较低，因此溶氧一直较高，最低时也有68％左右。在 发酵后期随着菌体的自溶，溶氧还有上升的趋势，实验结果见图7。 图6 发酵罐培养硝 化细菌的pH值变化曲线 Fig 6 The pH curve of nitrobacteria cultivation in fermenter 图7 发酵罐培养硝化细菌的DO值变化曲线 Fig 7 The DO curve of nitrobacteria cultivation in fermenter
17、 2.4.3 发酵培养硝化细菌的生长曲线该生长曲线由发酵液活菌计数得到，横坐标为发酵 时间，纵坐标为含菌量的对数值。由该生长曲线可以看出硝化细菌和一般的异养菌的不 同，硝化细菌的生长较缓慢，其对数生长期要5天左右才能到达，菌浓度也很低。实验结 果见图8。 图8 发酵培养硝化细菌的生长曲线 Fig 8 The growth curve of nitrobacteria 3 讨论 3.1 本研究的主要目的是筛选生长速度快、硝化作用强度大的硝化细菌。主要步骤如下 ：采集水样 分离 鉴定 培养 硝化作用测定 菌种保存 发酵培养 细菌浓度测定 3.2 测定硝化作用
18、强度的原理是：NO2-能与格利斯试剂反应生成紫红色化合物，此反应 不受NO3-N的干扰。因此可通过比色测定出培养基中亚硝酸的含量。 3.3 在摇瓶培养和发酵培养的后期，菌的亚硝化率和硝化率都有所下降，可能的原因是 培养液中的产物累积的太多，对亚硝化作用和硝化作用有抑制，特别是硝酸根对硝化作 用的抑制，因此，对于硝化细菌最好采用连续培养。总之，随着水产养殖业的迅速发展 ，硝化细菌已逐渐成为水产养殖界的热门话题，它在水产养殖中的重要作用已引起广泛 的关注，可以说，启今日为止，在大规模、集约化的水产养殖模式中，如果没有硝化细 菌参与其中的净水作用，想获得成功的养殖，几乎是不可能之事。硝化细菌作为生物硝 化脱氨的主要微生物，由于其生长速率低，要想提高硝化细菌的工作效率，一方面要避 免硝化细菌的流失，一般可做成固定化细胞，还有就是要富集培养，此外，对催化硝化 细菌的酶也可以进行更多的研究。对硝化细菌的研究在这几方面还大有作为。 6
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