真菌学总论2012.pdf

1 真菌学总论 2 3 The spores in Penicillium often contain blue or green pigments which give the colonies on foods and feeds their characteristic colour.It is the spores in the blue cheese that give the colour to the cheese.4 真菌概述（1）真菌（fungus），也称Eumycota，来源于拉丁文的fungus，即蘑菇 真菌学 mycology来源于myks，也是蘑菇的意思。开始真菌和植物同为一类，因此命名按照国际植物学命名法命名。真菌属于真核细胞型微生物，与原核细胞型微生物有很多区别 5 真菌概述（2）真菌是一种具有真正细胞核和细胞器的真核生物。不含叶绿素，以吸收为营养方式，具无性和有性两种繁殖方式。菌体基本结构为丝状的菌丝体和/孢子，其细胞壁含有几丁质/甲壳质（chitin）和葡聚糖 真菌在自然界中广泛存在，估计有150万种以上，其中对人类有致病性的仅有300余种。6 原核细胞型微生物与真核细胞型微生物比较原核细胞型微生物与真核细胞型微生物比较 原核细胞型微生物原核细胞型微生物 真核细胞型微生物真核细胞型微生物 细胞核结构细胞核结构 核膜核膜 无无 有有 核仁核仁 无无 有有 分裂方式分裂方式 主要以二分裂主要以二分裂 有丝分裂，减数分裂有丝分裂，减数分裂 细胞质结构细胞质结构 质膜质膜 常缺乏固醇常缺乏固醇 常有固醇常有固醇 内膜内膜 较简单，有中介体较简单，有中介体 复杂，有内质网和高尔基体复杂，有内质网和高尔基体 核糖体核糖体 70S 80S 呼吸系统呼吸系统 质膜或中介体质膜或中介体 线粒体线粒体 7 真菌分类 生物中的三大超界或域（domain）：真核域、细菌域、古菌域 真核域的五界：动物界、植物界、真菌界、藻物界、原生生物界 特征 动物界 藻物界 真菌界 植物界 原生生物界 营养 异养 摄食 自养 光合吸收 异养 吸收 自养 光合 自、异养 吞噬光合 细胞壁 无 纤维素 甲壳质 纤维素 无 8 真菌分类真菌分类 与医学有关的真菌为真菌界中的四个门:壶菌门（Chytridiomycota）接合菌门（Zygomycotina）子囊菌门（Ascomycotina）担子菌门（Basidiomycotina）半知菌门（deutermycotina）按形态学分类 分为酵母菌、霉菌、蕈类 9 真菌定义的五大特点 具有真正的细胞壁 通常为分枝繁茂的菌丝体，菌丝呈顶端生长 有硬的细胞壁，大多数为几丁质 通过细胞壁吸收营养物质，分泌胞外酶降解不被吸收的多聚物为简单化合物而吸收，属于异养 通过有性或无性繁殖方式产生孢子延续 10 真菌形态学 属于真核生物，形态多种多样，可以有性生殖和无性生殖，并可借此而鉴定 形态学在真菌鉴定方面有重要的作用，真菌孢子的发生、菌丝顶端生长、产生孢子、有不同的形态，还可以根据色素、大小、形态、多分隔等作为鉴定依据 有的真菌不需要核丝分裂而产孢，为无性期，需要核丝分裂而产孢，为有性期。11 真菌细胞 12 单细胞真菌单细胞真菌 酵母菌：孢子，无菌丝酵母菌：孢子，无菌丝 类酵母菌：芽生孢子，假菌丝类酵母菌：芽生孢子，假菌丝 多细胞真菌多细胞真菌 丝状菌（霉菌）：孢子和菌丝，丝状细胞丝状菌（霉菌）：孢子和菌丝，丝状细胞丝状体丝状体菌丝体菌丝体形成绒毛状菌落形成绒毛状菌落 真菌形态特征真菌形态特征 13 双相真菌 酵母菌：37 霉菌：25 14 双相真菌 组织胞浆菌（Histoplasma capsulatum）皮炎芽生菌（Blastomyces dermatidis）巴西副球孢子菌（Paracoccidioides brasiliensis）粗球孢子菌（Coccidioides immitis）马内菲青霉（Penicillium marneffei）申克孢子丝菌（Sporothrix schenkii）15 19 真菌菌落形态 真菌菌丝和孢子经过大量生长繁殖后可形成真菌集团，叫菌落（colony），分三类 酵母型菌落 类酵母型菌落 丝状型菌落 20 真菌菌落形态 酵母型菌落：大而厚，圆形，柔软，光滑、湿润、粘性奶酪样，光镜下可见单细胞的芽生孢子，无假菌丝 21 真菌菌落形态 类酵母型菌落 外观与酵母型菌落相同 但是有假菌丝 22 真菌菌落形态 丝状型菌落 呈绒毛状、棉毛状、粉末状。光镜下可见有或无分隔，分枝或不分枝，有色或无色的菌丝 23 霉菌的形态结构 霉菌的菌体由分枝或不分枝的菌丝组成 菌丝是真菌的营养体的基本单位 菌丝是中空管状结构，直径一般310um，有分枝，有隔膜或无隔膜。根据菌丝有无隔膜，将真菌分为低等真菌（鞭毛菌门和接合菌门）和高等真菌（子囊菌门、担子菌门和半知菌门）许多菌丝分枝连接，相互交织在一起所构成的形态叫菌丝体（mycelium）24 菌丝分类 营养菌丝 vegetatile hypha 在固体培养基上深入基内的菌丝，行吸收养料的功能 气生菌丝 aerial hypha 向空气中生长的菌丝 繁殖菌丝 reproductive hypha 气生菌丝发育到一定阶段分化成繁殖菌丝 25 菌丝分类 无隔菌丝 1、为长管状单细胞，细胞质内含多个核 2、生长表现为菌丝的延长和细胞核的增多 这是低等真菌所具有的菌丝类型 有隔菌丝 1、菌丝有隔膜，被隔膜隔开的一段菌丝就是一个细胞，菌丝由多个细胞组成，每个细胞内含有一个或多个核。2、隔膜上有单孔或多孔，细胞质和细胞核可以自由流通，每个细胞功能相同，这是高等真菌所具有的类型 26 27 菌丝菌丝 Spore Germinating Spore Food Source Mycelium 28 菌丝菌丝 有隔菌丝 无隔菌丝 29 菌丝类型 透明无隔菌丝 透明有隔菌丝 暗色有隔菌丝 30 菌丝类型 假根 鹿角样菌丝 球拍状菌丝 螺旋菌丝 31 真菌的繁殖 酵母的繁殖主要包括芽殖和裂殖两个类型 菌丝繁殖包括孢子囊孢子、发芽形成分生孢子、隔膜断离形成关节孢子三类。许多真菌繁殖，不止一种方式，如毛孢子菌有出芽和关节孢子两种繁殖方式 32 酵母菌繁殖方式 包括芽殖和裂殖 芽殖：从细胞壁的某一点发芽，母细胞进行核分裂，一部分核进入子细胞，以后在母细胞和子细胞之间产生横隔，成熟后从母体分离，母体上遗留一个瘢痕 芽殖的出芽方式：多边出芽 两端出芽 三边出芽 单边出芽，环境适宜的时候出现假菌丝 裂殖：细胞首先加长，核一分为二，中央产生横隔，分成2个子细胞。进行裂殖的酵母菌种类较少 33 霉菌繁殖方式 繁殖方式 孢子 菌丝片断 有性孢子 无性孢子 卵孢子 接合孢子 子囊孢子 担孢子 孢囊孢子 分生孢子 节孢子 厚垣孢子 34 35 孢子囊孢子 形成特征：形成于菌丝的特化结构孢子囊内 孢子形态：近圆形 根霉 毛霉 36 分生孢子 形成特征：由分生孢子梗顶端细胞特化成单个细胞或成簇的孢子 曲霉 青霉 37 节孢子 由菌丝断裂形成 常呈现串状 短柱状 白地霉 38 厚垣孢子 部分菌丝细胞质浓缩变圆 周围生出厚壁而成 总状毛霉 39 有性繁殖 同宗配合和异宗配合 同宗配合：在同一纯菌落里，不需要交配，产生同宗真核细胞有性期 异宗配合需要交配株，才能产生有性期孢子 有性繁殖三要素：胞质融合 核融合 减数分裂 40 子囊孢子 子囊：两性细胞接触后形成的囊状结构 两个营养细胞直接交配而成，外面没有菌丝包裹 从一个特殊的成为产囊丝的结构上产生子囊，多个子囊外面被菌丝包围而成子实体，成为子囊果 属于子囊菌纲 41 子囊孢子 42 接合孢子 由菌丝生出的结构大小相似 形态相同的或略有不同的两个配子囊接合后发育而成 属于接合菌纲 43 44 真菌的生长特性真菌的生长特性 营养要求不高，常用沙保氏培养基 基本成分：葡萄糖、蛋白胨、琼脂 生长条件：pH4.06.0 温度2228（深部 真菌37）较高的湿度、O2 45 临床标本的采集种类临床标本的采集种类（1）皮肤的角质性物质：毛发、指（趾）甲、皮屑等。（2）各种分泌物和排泄物：生殖道分泌物、耳垢、痰、粪便、尿液等。（3）血液和体液：体液包括胸水、腹水、脑 脊液、淋巴穿刺液等。（4）脓汁及渗出物。46 采集标本注意事项采集标本注意事项 （1）采集的标本要适宜 不同真菌感染应采取不同的临床标 本。怀疑为浅部真菌感染如体癣，应刮取病变边缘的痂、皮屑，发癣应取折断了的病发。怀疑为深部真菌感染应取血液、脑脊液、痰、脓汁等。（2）在用药前采集标本 一般真菌标本须在用药前采集，对已用药者则需停药一段时间后再采集标本。47 采集标本注意事项采集标本注意事项（3）采集的标本量要足 血液和脑脊液标本5ml，胸腔液20ml，皮屑标本两块，活体组织两份（一份送病理科检查，一份作镜检和培养）。（4）严格无菌操作 在采集标本时严格无菌操作，并进行消毒处理，尤其是在采集血液和脑脊液标本时，要避免污染杂菌。（5）采集的标本立即送检 对采集的标本应立即送检，特别是深部真菌标本采集后最长不超过2h。48 真菌的检验方法真菌的检验方法 1.镜检真菌形态 2.真菌抗原检测 3.真菌分离培养与鉴定 4.真菌核酸检测 5.真菌毒素检测 49 真菌标本直接检查真菌标本直接检查 1.直接镜检：方法简便，快速 10%KOH 微加热 低倍/高倍镜检查有无菌丝/孢子 角质标本（皮肤癣菌）直接观察直接观察/染色后观察染色后观察 2.抗原检测:采用免疫学方法检测真菌抗原，常用的方法有胶乳凝集试验、ELISA、半定量放射免疫测定法。50 常用的染色方法常用的染色方法 常用的染色方法有革兰染色、瑞氏染色、荧光染色，乳酸酚棉蓝染色、还有墨汁负染色等。对检测骨髓和外周血中的荚膜组织胞浆菌，需作瑞氏染色或姬氏染色后镜检。检测病人脑脊液标本中新生隐球菌，需作墨汁负染色后检查，背景为黑色，新生隐球菌和荚膜不着色 51 直接镜检意义直接镜检意义 阳性结果意义 1.有诊断意义，如浅部真菌病、隐球菌病、皮肤粘膜假丝酵母菌病等 2.代表组织相，直接镜检看到的真菌形态就是该真菌的组织形态，如假丝酵母的菌丝、浅部真菌的厚膜孢子等；确定某些致病性真菌属或种，如皮肤癣菌、曲霉等 3.判断某些真菌种的致病性等 52 直接镜检意义直接镜检意义 直接镜检局限性 1.阴性结果不能排除真菌感染，直接镜检不如培养敏感，其敏感性随标本类型、数量、采集时间和质量等而有所不同 2.有假阳性结果，如溶解的淋巴细胞在脑脊液印度墨汁湿片中易误认为新生隐球菌；脂肪微滴也可与出芽酵母细胞混淆 53 分分 离离 培培 养养 真菌培养是目前鉴定真菌的唯一方法。培养成功与否与采集的标本是否适当、是否新鲜、培养基的选择、培养温度与时间等有关。大多数真菌培养的温度为28，但深部真菌为37。对二相性真菌培养时,28培养真菌呈菌丝相（霉菌型），37培养为组织相（酵母型）。54 真菌培养方法真菌培养方法 平皿培养:表面较大可使标本散布，便于观察菌落形态，但水分易蒸发，只能培养生长繁殖较快的真菌，如假丝酵母菌、隐球菌。大试管培养:水分不易蒸发，主要用于皮肤癣菌的培养和真菌菌种的保存。玻片培养(微量培养、小培养):可用于真菌菌种的鉴定。55 观察菌落形态时注意观察菌落形态时注意 1.菌落性质，是酵母菌还是霉菌。2.菌落大小,一般病原性真菌菌落小，而条件致病性真菌菌落大。3.菌落颜色，一般病原性真菌颜色淡，污染真菌颜色深。4.致病性真菌菌落下沉，污染性真菌菌落不下沉;致病性真菌有时使培养基开裂，但污染霉菌很少引起培养基开裂。56 真真 菌菌 鉴鉴 定定 菌种鉴定是一个复杂过程，仅观察菌落形态是远远不够的，还需作生化反应，分子生物学鉴定，必要时将菌种送有关单位鉴定。检验真菌常用的生化反应有糖(醇)类发酵试验、同化碳源试验、同化氮源试验或利用硝酸钾试验、牛乳分解试验、酚氧化酶试验、明胶液化试验和脲酶试验等。试验方法同细菌试验，主要用于检验深部感染真菌如假丝酵母菌、隐球菌等。57 1.多烯类，如两性霉素B、制霉菌素 2.咪唑类，包括咪康唑 酮康唑 3.三唑类，伊曲康唑、氟康唑、伏立康唑 4.嘧啶类，氟胞嘧啶 5.棘白菌素类，卡泊芬净 抗真菌药物分类抗真菌药物分类-化学结构分类化学结构分类 58 1.作用于真菌细胞膜：破坏细胞膜：两性霉素B、制霉菌素 抑制麦角固醇合成：唑类、丙烯胺类 2.作用于真菌细胞壁：尼可霉素Z、卡泊芬净等。3.作用于真菌核酸：干扰真菌DNA合成，5氟尿嘧啶（5FC）等。4.其他：大蒜新素（allitridum）及冰醋酸等。抗真菌药物分类抗真菌药物分类-作用机理分类作用机理分类 59 抗真菌药体外抗菌谱比较 真菌真菌 AMB FCZ ITZ VCZ PCZ RCZ CF MF AF 白色念珠菌 热带念珠菌 近平滑念珠菌 克柔念珠菌 光滑念珠菌 新生隐球菌 荚膜组织胞浆菌 皮炎芽生菌 粗球孢子菌 巴西副球孢子菌 卡氏肺孢子虫 烟曲霉菌 毛霉菌 根霉菌 镰刀菌 吡咯类吡咯类 棘白菌素类棘白菌素类 多烯多烯 60 1两性霉素B 两性霉素对大多数深部致病真菌具有活性，如念珠菌、新型隐球菌、曲菌、组织胞浆菌、双 相真菌等均有较强的抑制作用。但对皮肤和毛发 癣菌大多耐药。2酮康唑(ketoconazole)对念珠菌、着色真菌 属、球孢子菌属等有 抗菌活性，对毛发癣菌亦具抗菌活性。临床常用抗真菌药物 61 3氟康唑(fluconazole)对念珠菌、隐球菌 具有较高抗菌性。4氟胞嘧啶 为窄谱抗生素，对念珠菌、新型隐球菌和球拟酵母有较高抗菌活性，对其他真菌抗菌作用差，易产生耐药性，故常和两性霉素B联合使用。临床常用抗真菌药物 62 5伊曲康唑(itraconazole)伊曲康唑体外有广谱抗真菌活性。对念珠菌、隐球菌、曲霉菌、组织胞浆菌、马内非青霉均有效。6伏立康唑（Voriconazole）伏立康唑适用于侵袭性曲霉病及严重真菌感染不能耐受其他药物或经其他药物治疗无效者，如足放线病菌属、镰刀菌属等感染。临床常用抗真菌药物 63 抗真菌药物药敏试验原则抗真菌药物药敏试验原则 1.提供两种以上有相当活性的抗真菌药物的可信测量方法 2.和体内的活性具有相关性，可预测治疗的效果 3.可用来监控敏感群体菌株的耐药性发生 4.可预期研究新药的潜在治疗效能。64 真菌药物敏感试验过程真菌药物敏感试验过程 方法:肉汤稀释法，包括常量稀释法和微量稀释法（CLSI M27 M38）。培养基:含谷氨酰胺和pH指示剂，不含碳酸氢钠RPMI 1640培养基。程序:药物原液配制 接种菌液制备 药液稀释 常量稀法 微量稀释法 结果判断 质量控制 65 真菌非培养检测技术真菌非培养检测技术 动物试验:分离病原性真菌、确定真菌菌种的致病性、研究药物对真菌的作用等。核酸检测:操作简便、省时省工、敏感性和特异性高的优点，但要一定的实验条件，并大多仍处于实验研究阶段，故目前不可能完全替代常规鉴定方法。真菌毒素的检测:生物学方法、薄层层析法、高效液相色谱法和间接竞争ELISA法等。66 培养、鉴定用的培养基 沙氏葡萄糖培养基（SDA）：主要用于菌种的分离 储存 葡萄糖 40g 蛋白胨 10g 琼脂 12-15g 蒸馏水 1000ml 氯霉素 200mg 放线菌酮 250mg 121度10min高压灭菌 67 培养、鉴定用的培养基 皮肤癣菌试验培养基（DTM）主要用于皮肤癣菌的筛选，80的皮肤癣菌能使DTM由酸变碱，培养基1周内由黄色变成红色 菌落有深红色色素产生判断为阳性，表示为红色毛癣菌 玉米粉吐温培养基（CMA）可以促进白念产生假菌丝和厚壁孢子 促进暗色孢科真菌孢子形成 尿素琼脂 用于鉴别红色毛癣菌和须癣毛癣菌 68 培养、鉴定用的培养基 米饭培养基 用于鉴别犬小孢子菌和奥杜昂小孢子菌 并促进其他一些皮肤癣菌产生孢子 奥杜昂小孢子菌在米饭培养基生长不良，产生棕色色素 犬小孢子菌生长快而茂盛，有较多典型的梭形大分生孢子，并产生淡黄色色素 维生素试验琼脂 又称毛癣菌培养基 用于发现皮肤癣菌的不同维生素需要 疣状毛癣菌：需要维生素B1和肌醇 断发 紫色和同心性毛癣菌需要维生素B1 69 培养、鉴定用的培养基 溴甲酚紫乳固体葡萄糖琼脂（BCP-MSG）I类反应 第一阶段（14天）：培养基颜色不变，菌落生长受限 第二阶段（14天后）：培养基颜色改变，由灰蓝色变成紫蓝色，同时菌落生长加快 红色 毛癣菌 II类反应 培养基PH值快速升高，由蓝色变成紫色，7-10天即有明显的碱化，变成紫色 菌落呈扩散型生长 须癣毛癣菌 疣状毛癣菌和紫色毛癣菌可以观察到清晰的水解晕 III类反应 稳定的维持中性的PH值，培养基保持原有的灰蓝色 菌落过度生长 70 传统鉴定方法步骤 快速生长 直径3-9cm 对于不能快速识别的菌种，将其接种到CMA、玉米、尿素或毛癣菌琼脂上 皮肤癣菌采用SDA 25度培养7天后的菌落直径大小判断其生长速度 非常快速生长 直径9cm 中等速度 直径1-3cm 首先对SDA上原始分离菌进行菌落形态学观察和镜下观察 缓慢速度 直径0.5-1cm 71 微生物检验 72 微生物学检验 73 微微 生生 物物 检检 验验 二、直接显微镜检查:74 微微 生生 物物 检检 验验 二、直接显微镜检查:浮载液：痰：DTT或蛋白酶+10KOH 怀疑马拉色菌毛囊炎:派克染液 等体积的KOH+派克墨水 湿的标本：钙荧光白染色，显微镜需要配备荧光装备 体液：离心后直接镜检 75 微生物检验 三.分离培养 毛发、皮屑和小段的指甲：直接放在琼脂上压入表面，使之与培养基有良好的接触。活检组织：需要研磨或者切成小片 血液组织：首选采用含双相介质的培养瓶 温度：皮肤癣菌的最适温度为26-30度，但念珠菌、结核菌、曲霉菌等可以在37度。皮肤癣菌需要7-14天生长期，其他真菌如曲霉菌生长较快，1周内可以作出鉴定。76 微生物学检验 四、鉴定 真菌尤其是皮肤癣菌按照形态学鉴定，很少根据其生理学特征鉴定。鉴定特征：菌落的质地、表面颜色、培养皿背面的色素 镜检的方法：挑取一部分纯培养物放在载玻片上，滴上一滴LPCB 用胶带条粘取纯培养菌落，置于含有一滴LPCB的玻片上，可以揭示孢子的原位的排列 玻片小培养：在置于玻片上的琼脂块上的每一面进行接种，加盖一块玻片，湿盒中培养孵育，将载玻片和盖片制成染色的标本皮肤癣菌