ELISA测定乳中磺胺甲基嘧啶残留.pdf

中国兽医学报990 2 2 1中国兽医学报 CH I NESE JO U RNA L O F VET ERINA RY SCIENCE 1999年 第19卷第2 期 No.2 v o l.19 1999ELI SA 测定乳中磺胺甲基嘧啶残留*吴定张羽航*姚汝华*摘要以牛血清白蛋白(BSA)为载体，合成2 种不同的物质的量的比值(约113和142)的磺胺甲基嘧啶抗原，并比较了两者的免疫原性；以卵白蛋白(O A)为载体，合成1种包被抗原；用辣根过氧化物酶标记羊抗兔I g G，工作浓度11 0 0 0；建立的乳中磺胺甲基嘧啶残留ELISA 测定法，抗原亲和常数分别为1.2 8 107（142）和3.2 1107(113)，磺胺甲基嘧啶检测质量浓度为52 2 0 g/L(1.8 7 1088.2 107 m o l/L)，检测限为2.4 g/L,回收率为8 8%118%，与磺胺二甲基嘧啶和磺胺噻唑交叉率分别为6.0%和0.8 4%，与磺胺二甲氧嘧啶和磺胺脒无交叉反应。关键词乳磺胺甲基嘧啶ELI SA 中图分类号S8 54.43En z y m e-l i n k e d Im m u n o s o r b e n t A s s a y o n Su l f a m e t h y l d i a z i n e Co n t e n t i n M i l kW u D i n g Zh a n g Yu h a n g*Ya o Ru h u a*(A n h u i A g r o t e c h n i c a l T e a c h e r s Co l l e g e,Fe n g y a n g,A n h u i 2 3310 0)A b s t r a c t T w o k i n d s o f t h e s u l f a m e t h y l d i a z i n e a n t i g e n w e r e s y n t h e s i s e d w i t h t h e c a r r i e r p r o t e i n o f BSA o r O A a n d t h e i r i m m u n o g e n i c i t y c o m p a r e d;t h e s h e e p a n t i-r a b b i t -g l o b u l i n w e r e l a b e l l e d w i t h t h e h o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e (H RP)a c c o r d i n g t o s o d i u m p e r i o d a t e m e t h o d;t h e ELISA o n s u l f a m e t h y l d i a z i n e c o n t e n t i n m i l k w a s d e v e l o p e d.A f f i n i t y c o n s t a n t o f t h e a n t i b o d y w a s 1.2 8 107(t h e m o l e c u l a r m o l e r a t i o i n a n t i g e n f o r 142)a n d 3.2 1107(113),r e s p e c t i v e l y.T h e d e t e c t a b l e c o n c e n t r a t i o n o f s u l f a m e t h y l d i a z i n e w i t h ELI SA r e v e a l e d 5-2 2 0 g/L(1.8 7 10-8-8.2 10-7 m o l/L)w i t h t h e d e t e c t i o n l i m i t b e i n g 2.4 g/L,t h e r e c o v e r y r a t e o f 8 9%-118%,t h e c r o s s r e a c t i v e r a t e w i t h s u l f a d i m i d i n e a n d s u l f a t h i a z o l e o f 6.0%a n d 0.8 4%,r e s p e c t i v e l y,n o c r o s s r e a c t i o n w i t h s u l f a d i m e t h o x i n e a n d s u l f a g u a n i l i n e.K e y w o r d s s u l f a m e t h y l d i a z i n e;e n z y m e-l i k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a y;ELI SA磺胺甲基嘧啶是治疗奶牛疾病和作饲料添加剂的常用药物之一。奶牛使用抗生素后，一般经7 2 h 就可挤乳出售1。但磺胺甲基嘧啶半衰期较长，7 2 h 后鲜乳中仍有微量残留2，3。食用含磺胺甲基嘧啶的牛乳，能导致过敏机体发生过敏性反应，破坏机体正常菌群生态平衡，引起致病菌产生耐药性4。乳中抗生素残留的测定一般采用T T C法和微生物抑制圈法，但不适合乳中磺胺药残留测定57。本研究在合成牛血清白蛋白-磺胺甲基嘧啶抗原和卵白蛋白-磺胺甲基嘧啶抗原，并在比较2 种不同分子f i l e:/E|/q k/z g s y x b/z g s y 99/z g s y 990 2/990 2 2 1.h t m（第 15 页）2 0 10-3-2 3 16:43:2 5中国兽医学报990 2 2 1结合比偶合抗原免疫原性的基础上，建立了乳中磺胺甲基嘧啶残留的ELI SA 测定方法。1材料与方法1.1主要试剂与仪器磺胺甲基嘧啶(SM D)(山东第四制药厂)、吡啶(上海化学试剂厂)、丁二酸酐(SA)(上海化学试剂厂)、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺(ED C)(M e r c k 公司)、N，N-二甲基甲酰胺(上海化学试剂厂)、牛血清白蛋白(BSA)(上海生化所)、卵白蛋白(O A)(上海血研所)、辣根过氧化物酶(H RP)(RZ 3.0，上海生化所)、羊抗兔Ig G(天津生物制品研究中心)、硼氢化钾(Fl u c k 公司)、过碘酸钾(上海试剂一厂)、3，3，5，5-四甲基联苯胺(Si g m a 公司)。U V-7 54型紫外可见分光光度计(上海第三分析厂)、D G-30 2 2 A 型酶联免疫检测仪(华东电子管厂)。1.2 抗原偶联与抗血清制备 1.2.1SM D-SA 制备取SM D 1.33 g、SA 2.6 7 g，溶于15 m L无水吡啶中，室温静置反应2 4 h 后，转移至2 0 m L蒸馏水中，用二氯甲烷萃取3次，合并萃取液，用0.1 m o l/L盐酸洗3次，然后用蒸馏水洗1次。将二氯甲烷萃取液经无水Na2SO4脱水，然后加甲苯置真空干燥器(50)烘干，得到SM D-SA 粉，再置蒸馏水中重结晶，得纯品SM D-SA。1.2.2 SM D-SA-BSA(或O A)偶联取SM D-SA 10.4 m g、ED C 11.0 m g，加入1.0 m L N，N-二甲基甲酰胺中，然后滴入含BSA 或O A 缓冲液1.0 m L，再加6 m o l/L Na O H 液2 0 L，搅拌反应6 h 后，再加ED C 10.7 m g，室温搅拌过夜，经p H 7.2 缓冲液透析，透析液4保存。1.2.3合成抗原鉴定合成的SM D-BSA 和SM D-O A 抗原以光谱扫描和聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定8。1.2.4抗血清制备与纯化取SM D-BSA 抗原10 0 g，与1.0 m L福氏完全佐剂乳化后，给兔背部皮内散点注射。4周后，取10 0 g 抗原加1.0 m L不完全福氏佐剂，乳化后于兔后腿肌内加强免疫，共强化免疫4次，每次间隔4周。待血清滴度达要求后，采血，获得的抗血清加等体积缓冲液，用饱和硫酸铵法纯化8。1.3酶标羊抗兔Ig G 制备与鉴定采用改良高碘酸钠法，用H RP标记羊抗兔I g G8。H RP/(g.L1)=A40 30.4(A 为吸光值)Ig G/(g.L1)=(A2 8 0A40 30.34)0.6 2 物质的量比值=(H RPI g G)4 用ELISA 测定H RP标记羊抗兔I g G 工作浓度8。1.4乳中SM D ELISA 测定取酶标板，每孔加SM D-O A 抗原10 0 L,于4过夜包被，用p H 7.2 PBS洗板3次(下同)；每孔加2%O A 液2 0 0 L封闭1 h，洗板；取SM D 标准液或牛乳样液10 0 L，与10 0 L抗体于小试管中混合，37 温育1 h，然后每孔加10 0 L，温育1 h，洗板；加H RP标记羊抗兔I g G 10 0 L，37 温育1 h，洗板；加酶标底物液3，3，5，5-四甲基联苯胺和H2O2液10 0 L，37 暗处反应45 m i n，用1 m o l/L H2SO4终止反应。于酶标仪450 n m 处读取吸光值。2 结果与讨论f i l e:/E|/q k/z g s y x b/z g s y 99/z g s y 990 2/990 2 2 1.h t m（第 2 5 页）2 0 10-3-2 3 16:43:2 5中国兽医学报990 2 2 12.1合成抗原的光谱扫描在30 0 50 0 n m 范围内，BSA 和O A 呈递减水平线，而SM D-BSA 和SM D-O A 在430 n m 处有一大吸收峰(图1)。图1合成抗原的扫描光谱.BSA-SM D;.O A-SM D；.BSA；.O A2.2 合成抗原凝胶电泳鉴定BSA、BSA-SM D1和BSA-SM D2的比移值分别为0.2 47、0.2 6 1和0.2 91，即BSA-SM D1和BSA-SM D2中载体蛋白与半抗原分子物质的量比分别约为113和142。2.3不同分子物质的量比值抗原特性用113物质的量比BSA-SM D1免疫兔，最高效价可达12 56 0，而用142 物质的量比BSA-SM D2免疫兔，最高效价为16 40。一般认为，载体蛋白偶联半抗原物质的量比为110 12 59。实际上，每个载体分子连接上1个半抗原分子就足以产生抗体，这已在核糖核酸酶、胰岛素及寡赖氨酸的单价二硝基苯酚(D NP)衍生物等研究中得到证实9。但仍有人认为连接到蛋白分子上的半抗原数以515为宜。本研究以113的偶联抗原刺激机体，产生抗体的效果比142 的好。由此说明，1个载体上连接的半抗原过多反而不利于抗体产生。载体上覆盖半抗原过多，可能不利于载体与淋巴细胞或吞噬细胞表面受体结合，同样也不利于酶与载体接近，而影响免疫应答。2.4H RP标记羊抗兔I g G 质量鉴定合成的酶标记羊抗兔I g G 合物中，H RP为0.49 g/L，I g G 为1.13 g/L，物质的量比值为1.7 3，A40 3A2 8 0为0.57。据报道10，较好结合物的A40 3A2 8 0为0.30 0.6 0；结合物酶量，0.40 g/L效果一般，0.50 g/L效果较好，达1.0 g/L效果最佳；物质的量比值不能作为结合物的主要参数，因结合物中I g G 不完全可靠。不过普遍认为，物质的量比值为0.7 0 时效果一般，1.0 时效果较好，1.52.0 时效果最佳。因此可以认为，本试验合成的酶标羊抗兔I g G 效果较好。当H RP标记羊抗兔I g G 稀释度为11 0 0 0 时，经ELI SA 测定，其吸光值为1.0，即H RP标记羊抗兔I g G 工作稀释度为11 0 0 0。2.5抗SM D 抗体亲和力用Fr i g n e t 等11方法得抗BSA-SM D1和抗BSA-SM D2抗体解离平衡常数分别为3.12 108和7.8 1108，其亲和常数分别为3.2 1107和1.2 8 107。2.6 抗体特异性抗BSA-SM D1抗体与磺胺二甲基嘧啶和磺胺噻唑的交叉率分别为6.0 0%和0.8 4%，而与磺胺二甲氧嘧啶和磺胺脒无交叉反应(表1)。f i l e:/E|/q k/z g s y x b/z g s y 99/z g s y 990 2/990 2 2 1.h t m（第 35 页）2 0 10-3-2 3 16:43:2 5中国兽医学报990 2 2 12.7 标准曲线SM D 检测质量浓度范围52 2 0 g/L(1.8 7 10-88.2 10-7 m o l/L)，最小检测限2.4 g/L。2.8 回收率抗SM D 抗体测定牛乳中SM D 含量回收率为8 9%118%(表2)。表1抗体与类SM D 物交叉反应率化合物抑制50%所需质量 浓度/(m g.L1)交叉率/%磺胺甲基嘧啶0.0 810 0磺胺二甲基嘧啶1.346.0 0磺胺噻唑9.520.8 4磺胺二甲氧嘧啶 1104 1104 0.0 0 1表2 ELI SA 测定牛乳中SM D 的回收率牛乳SM D 含量标准SM D 加入量/n gn回收量/n g回收率/%01058.910.0 48 9.10505 47.32 0.0 294.6010 05 117.8 30.0 9117.82.9SM D 于乳中残留时间的检测给1头产乳奶牛人工静注SM D 液，经ELI SA 测定，发现停药5 d 后，仍可在牛乳中检出SM D 残留(0.17 5 g/L)。因此，病奶牛若用SM D 治疗，停药时间最好1周后再出售其乳。第1作者：吴 定，男，196 2 年生，硕士，副教授 作者单位:安徽农业技术师范学院动物科学系，安徽凤阳 2 3310 0 *国家青年科学基金资助项目(3947 0 6 10)*Fa c u l t y o f Bi o e n g i n e e r i n g,So u t h Ch i n a Ph y s i c a l-e n g i n e e r U n i v e r s i t y *华南理工大学生物工程系参考文献1张献礼，蒋立民.实用奶牛技术.南京：南京大学出版社，1990 2 Br a d y M S,K a t z S EA n t i b i o t i c a n d a n t i m i c r o b i a l r e s i d u e s i n m i l k.J Fo o d Pr o t,198 8,51:811 3La r o c q u e L,Ca r i g n a n G,Sv e d S.Su l f a m e t h a z i n e r e s i d u e s i n Ca n a d i a n c o n s u m e r m i l k.J A s s o c O f f A n a l Ch e m,1990,7 3:36 536 7 4张家铨.药理学.第2 版.北京：人民卫生出版社，1994 5黄伟坤.食品检验与分析.北京：轻工业出版社，198 9 6 中华人民共和国卫生部.食品卫生检验方法理化部分.北京：中国标准出版社，f i l e:/E|/q k/z g s y x b/z g s y 99/z g s y 990 2/990 2 2 1.h t m（第 45 页）2 0 10-3-2 3 16:43:2 5中国兽医学报990 2 2 1198 7 7 T y l e r J W,Cu l l o r J S,Er s k i n e R J.M i l k a n t i m i c r o b i a l d r u g r e s i d u e a s s a y r e s u l t s i n c a t t l e w i t h e x p e r i m e n t a l,e n d o t o x i n i n d u c e d m a s t i t i s.J A m Ve t M e d A s s o c,1992,2 0 1:137 8 138 4 8 吴定.竞争ELI SA 法测定丹贝活性成分大豆甙元：学位论文.南京：南京农业大学图书馆,1995 9张启元.放射免疫测定.天津：天津人民出版社,198 9 10 徐宜为.免疫检测技术.第2 版.北京：科学出版社，1991 11Fr i g u e t B.M e a s u r e m e n t s o f t h e t r u e a f f i n i t y c o n s t a n t i n s o l u t i o n o f a n t i g e n-a n t i b o d y c o r n p l e r e s b y e n z y m e-l i n k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a y.J I m m u n o l M e t h o d s,198 5,7 7:30 5319收稿日期：1998-0 2-0 6f i l e:/E|/q k/z g s y x b/z g s y 99/z g s y 990 2/990 2 2 1.h t m（第 55 页）2 0 10-3-2 3 16:43:2 5ELISA测定乳中磺胺甲基嘧啶残留ELISA测定乳中磺胺甲基嘧啶残留作者：吴定，张羽航，姚汝华，Wu Ding，Zhang Yuhang，Yao Ruhua作者单位：吴定,Wu Ding(安徽农业技术师范学院动物科学系,安徽凤阳,233100)，张羽航,姚汝华,Zhang Yuhang,YaoRuhua(华南理工大学生物工程系)刊名：中国兽医学报英文刊名：CHINESE JOURNAL OF VETERINARY SCIENCE年，卷(期)：1999，19(2)被引用次数：12次 参考文献(11条)参考文献(11条)1.张献礼.蒋立民 实用奶牛技术 19902.Brady M S.Katz S E Antibiotic and antimicrobial residues in milk 19883.Larocque L.Carignan G.Sved S Sulfamethazine residues in Canadian consumer milk 19904.张家铨 药理学 19945.黄伟坤 食品检验与分析 19896.中华人民共和国卫生部 食品卫生检验方法理化部分 19877.Tyler J W.Cullor J S.Erskine R J Milk antimicrobial drug residue assay results in cattle withexperimental,endotoxininduced mastitis 19928.吴定 竞争ELISA法测定丹贝活性成分大豆甙元学位论文 19959.张启元 放射免疫测定 198910.徐宜为 免疫检测技术 199111.Friguet B Measurements of the true affinity constant in solution of antigen-antibody cornpleres by enzyme-linkedimmunosorbent assay 1985 相似文献(6条)相似文献(6条)1.学位论文 王鑫 牛奶中药物残留检测方法的研究 2009 在奶牛的饲养中抗菌药物的使用非常普遍，例如各种抗生素及磺胺药物就被广泛用于预防和治疗牛乳腺炎等疾病。随着公众对食品安全越来越关注，牛奶中的药物残留问题也越来越得到重视。由于在奶牛饲养中不合理的使用药物，会导致牛奶中的药物残留，影响食品的安全性，并有可能污染环境，因此研究牛奶中药物的残留检测方法是必要的。基于此需要，本研究主要进行了以下几方面的研究工作：1.TTC法改进研究及对成都市售纯牛奶中抗生素残留的检测 目的：了解成都市市售纯牛奶中抗生素残留现状；对检测鲜乳中抗生素残留国家标准TTC法增设稀释度试验，找出一个更能满足指标要求的稀释比例。方法：用检测鲜乳中抗生素残留国家标准TTC法对成都市市场上销售的纯牛奶中抗生素残留情况进行检测；在TTC法中增设了菌液稀释度试验。结果：随机在采购成都市市场上销售的纯牛奶样品60份，采用TTC法对样品进行抗生素残留检测。检测出2份阳性，1份可疑，阳性率为33，可疑率为17；在TTC法中增设了菌液稀释度试验中显示试验中设置的几个菌液稀释度中，以1：10的测试效果最好。恰好能够满足指示要求。结论：本次抽检试验样品测试结果比较理想。用灭菌脱脂乳以1：10的比例稀释菌液，测试抗生素残留结果比国家标准中规定的1：1稀释的比例更为准确。2.TTC法测定牛乳中磺胺类药物残留实用性研究 目的：评价微生物法检测牛奶中磺胺药物残留时的实用性。方法：GB/T478927-2003，食品卫生微生物学检验鲜乳中抗生素残留量检验。结果：TTC法对检测牛奶中是否存在磺胺类药物，具有明显的局限性。结论：试验证明该方法虽然简便、易于操作、不需昂贵的仪器和设备，但是该方法费时、不能进行定量分析；该法对磺胺类检验的灵敏度很低，检出限高于国内外对其残留的控制标准，实用性差。3.HPLC法同时测定牛奶中三种磺胺类药物残留的研究 目的：建立同时测定牛奶中中磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶三种磺胺类药物多残留的HPLC检测方法。方法：样品经氯仿-丙酮（2：1，V/V）提取两次，提取液浓缩至干。残渣用流动相甲醇-004磷酸（30：70，V/V）溶解，色谱柱：Hypersil ODS2（250mm46mm，5m大连依利特公司）。流动相：甲醇-004磷酸（30：70，V/V）等度洗脱，流动相为甲醇-004磷酸（30：70，流速08mL/min，检测波长为272nm，柱温为30，进样量10L。结果：这三种磺胺药在00210mg/L浓度范围内呈线性关系，磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶检的检出限为0050mg/L。磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶检的平均回收率分别915974，905986，767890。结论该方法简便、准确、可靠、重复性好，可用于这三种磺胺药含量的测定。2.期刊论文 孙晶玮.赵新淮.SUN Jing-wei.ZHAO Xin-huai RP-HPLC快速分析牛奶中六种磺胺类抗生素残留-食品工业科技2008,(4)研究了牛奶中磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶六种磺胺类抗生素的多残留反相高效液相色谱(RP-HPLC)分析方法.样品经超声波提取两次,提取液浓缩至干.残渣用流动相甲醇-0.08%乙酸(60:40,V/V)溶解,净化后以反相C18柱,甲醇-0.08%乙酸等度洗脱,紫外检测器检测、外标法定量.结果表明,这六种抗生素在0.011.0mgL-1浓度范围内呈线性关系,磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶的栓出限为0.010mgL-1、磺胺甲噁唑、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶的检出限为0.015mgL-1.分析的添加回收率达到80%以上,变异系数9.0%,整体分析时间小于3h.方法具有处理简单、检测快速、准确的特点.3.学位论文 吕红英 高效液相色谱法同时测定动物组织中多种磺胺残留量的研究 2006 第一部分高效液相色谱紫外检测法同时测定动物组织中多种磺胺残留量的研究 磺胺类药物(SAS)是指具有对氨基苯磺酰胺结构的一类抗菌药物的总称，抗菌谱广，被广泛的用作饲料的添加剂，主要是用来增肥小牛和猪1。同时，磺胺类药也用做一种兽药来治疗肠道感染、乳腺炎、肺炎等疾病，并可以残留在动物的体内。该类药物如不按规定使用易导致球虫产生耐药性或引起交叉耐药性，长期连续用药可引起毒性反应。磺胺类药物的副作用有过敏反应、尿和造血紊乱。致癌性物质磺胺二甲嘧啶，能引起人的再生性障碍性贫血，粒细胞缺乏症等疾病。目前，中国、欧盟、日本、美国等均将磺胺类药物列为动物饲养过程中限制使用的药物，其最大残留限量要求为50100g/kg，而日本对磺胺二甲嘧啶的最大残留限量要求为10g/kg左右3。目前，国内也有不少关于动物源性食品中磺胺类药物检测的液相色谱法报道，但由于检测项目单一7-9，或采用梯度洗脱3，10，操作过程复杂，不易实现，而不能满足全方位的要求，在实际应用中受到一定的限制。因此，建立一种采用等度洗脱紫外检测同时测定各国重点监控的9种磺胺类药物残留的通用方法已成为必需。目的：建立高效液相色谱紫外检测法同时测定动物组织中9种磺胺类药物残留量的方法，满足我国食品安全和各国对动物源性食品中磺胺类药物残留限量检测的要求。方法：样品的预处理：肉类样品称取2.5g，肠衣样品称取5g，将样品用0.1mol/L的醋酸酸化后，用乙酸乙酯提取，提取液经冷冻除去类脂物后，利用SCX柱固相萃取净化，最后用25氨水甲醇溶液洗脱，洗脱液浓缩后用流动相定容0.5mL。色谱条件的优化：选择色谱柱、检测波长和流动相的组成、比例、流速，使9种磺胺类药物分离且与杂质峰分开。同时使分离度、理论塔板数、对称因子符合检测要求。方法学考察：分别进行精密度实验、线性、回收率、最低检测限实验。结果：色谱条件：色谱柱为CloversilODS-UC18柱(中检卫康公司)5m，4.6mm250mm；流动相为甲醇-乙腈-0.1乙酸水溶液(20：10：70)；流速为1.0mL/min；检测波长为264nm；柱温35；进样量为30l。色谱系统适用性试验：9种磺胺标准的理论塔板数，最小的磺胺嘧啶为6742，相邻两者之间的分离度以磺胺对甲氧嘧啶和磺胺二甲嘧啶最小为1.42，不对称因子为0.911.33。方法学试验：所分析的磺胺类药物在5.0010-21.00g/mL的浓度范围内线性关系良好(r0.999，n=5)，磺胺类药物在鸡肉中三个不同的添加水平，回收率在58.3101.0，RSD值为3.757.95。结论：本文建立了同时测定动物组织中9种磺胺类药物(磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺甲氧嗪、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲基异恶唑、磺胺二甲氧嘧啶和磺胺喹恶啉)残留的高效液相色谱紫外检测方法，作为一种通用方法，该方法净化效果好，分离度高，灵敏度能够满足各国对出口动物性食品中磺胺类药物残留限量检测的要求。第二部分高效液相色谱荧光检测法同时测定动物组织中多种磺胺残留量的研究 目前，国内外有不少关于动物源性食品中磺胺类药物残留的液相色谱检测报道。多数采用紫外检测法，而很多物质在紫外区有吸收，易造成干扰，致使净化过程十分复杂，且多残留分析多采用梯度洗脱，在实际应用中受到一定的限制。前文建立高效液相色谱紫外检测法同时测定动物组织中9种磺胺残留量的检测方法，由于中华人民共和国动物及动物性食品中残留监控计划要求增加检测水产品中磺胺吡啶和磺胺噻唑残留量，采用紫外检测法与以上9种磺胺同时测定时，对于某些水产品，此两者不易与杂质分离，形成干扰。本文利用荧光检测法对磺胺类药物进行测定，使用荧光胺对磺胺类药物进行衍生，同时在流动相中加入三乙胺，形成离子对，首次采用等度同时测定动物组织中的11种磺胺类药物残留。在简化净化过程的基础上，显著提高灵敏度，大大缩短了检测时间，具有一定的专属性。本方法可同时满足欧盟、日本等国的出口要求和中华人民共和国动物及动物性食品中残留监控计划。目的：简化测定动物组织中磺胺类药物残留预处理方法，建立一种专属性强的高效液相色谱荧光检测法同时测定动物组织中11种磺胺类药物残留的检测方法。方法：样品的预处理：称取5.0g已粉碎均匀的动物组织样品，加入无水硫酸钠后用25mL乙腈提取，在3000rpm离心10min。准确分取5mL提取液于15mL离心管中，40用氮气吹干。用1mL流动相溶解。加入2mL正己烷除去类脂物，流动相层经荧光胺衍生后，待测定。色谱条件的确定：改变色谱柱、检测波长和流动相的组成、比例、流速，使11种磺胺类分离且与杂质峰分开。同时使分离度、理论塔板数、对称因子符合要求。方法学考察：分别进行精密度实验、线性、回收率、最低检测限实验。结果：色谱条件：色谱柱为ODS-2HYPERSILC18柱(ThermoElectronCoporation)5m，250mm4.6mm(i.d.)；流动相为乙腈-0.01mol/L磷酸二氢钾溶液(25：75)，利用三乙胺将流动相pH值调节为5.5，流速为1.0mL/min；检测波长为ex=405nm，em=495nm；柱温为50；进样量为20L。色谱系统适用性试验：11种磺胺标准的理论塔板数以最小的磺胺嘧啶计为30093，相邻两者以磺胺甲氧嗪和磺胺吡啶的分离度最小，为1.40，不对称因子为0.901.16。方法学试验：磺胺类药物在2.001.00102ng/mL的浓度范围内线性关系良好(r0.999，n=6)，回收率和精密度较好。结论：利用荧光检测法建立了一种快速、准确同时测定动物组织中11种磺胺类药物(磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺塞唑、磺胺喹恶啉、磺胺甲氧嗪、磺胺吡啶和磺胺二甲嘧啶)残留量的检测方法，该方法净化方式简单，专属性强，灵敏度高，可满足各国对动物性食品中磺胺类残留限量检测的要求，适合大批量样品的同时测定。4.期刊论文 孙晶玮.赵新淮.SUN Jing-wei.ZHAO Xin-huai 牛奶中多种磺胺类抗生素残留的HPLC快速分析-食品科学2007,28(6)研究了牛奶中磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶六种磺胺类抗生素的多残留高效液相色谱(HPLC)分析方法.样品经氯仿-丙酮(2:1,V/V)提取两次,提取液浓缩至干.残渣用流动相甲醇-0.08%乙酸(60:40,V/V)溶解,净化后以反相C18柱,甲醇-0.08%乙酸等度洗脱,紫外检测器检测、外标法定量.结果表明,这六种抗生素在0.011.0 mg/L浓度范围内呈线性关系,磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶检的检出限为0.010 mg/L、磺胺甲噁唑、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶检出限分别为0.015 mg/L.分析的添加回收率为69.4%123.5%,变异系数为8%,整体分析时间小于3h.方法具有处理简单、检测快速、准确的特点.5.期刊论文 陆勤.林峰.朱柳明 牛奶中磺胺类抗生素的快速检测分析-中国乳业2006,(11)建立牛奶中磺胺类抗生素残留检测的放射免疫方法.通过对磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺甲基异恶唑、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶和磺胺喹恶啉8种磺胺类药物在空白牛奶样品中的加标试验,确定该方法的筛选水平.结果发现,采用放射免疫法检测牛奶中的磺胺类抗生素,筛选水平可达到10g/L,变异系数在1.79%5.56%之间;对8种磺胺类药物的混合标准溶液进行检测,100%可以被检测出,检测限达5g/L.放射免疫法检测牛奶样品中的磺胺类抗生素,方法简便、快速,灵敏度和精确度能够达到检测要求.6.学位论文 郭琳媛 分子印迹技术在渔药残留测定中的应用 2009 分子印迹技术由于其具有广阔的发展前景，广泛应用于诸多领域，涉及医药、环保、生命科学等几乎所有基础研究领域。随着人们对食品安全及环境保护意识的提高，对渔药安全性的要求也不断提高，而渔药残留问题也越来越受人们关注。因此，对动物源性食品中渔药的残留分析变得非常重要。迄今为止，鱼肉样品中渔药残留的分析方法很多，主要是通过对鱼肉这种复杂基体样品中低含量组分进行分离、纯化和富集以获得足够灵敏度。这主要包括液-液萃取(LLE)、超临界流体萃取、微波辅助萃取、固相萃取(SPE)、基质固相分散(MSPD)等。本论文在综述前人工作的基础上，围绕分子印迹用于样品前处理技术进行研究，开展了如下具有原始创新性的工作。(1)以磺胺甲基嘧啶(SMR)为模板分子通过传统溶液聚合合成分子印迹，作为SPE填料，结合高效液相色谱(HPLC)，建立了测定池塘水和鱼肉中SMR残留量分析的新方法；(2)以氯霉素(CAP)为模板分子通过微乳液聚合合成分子印迹，作为MSPD萃取的分散剂，结合HPLC，建立了测定鱼肉中CAP残留分析的新方法；本论文共分为三个部分：第一章：从分子印迹、固相萃取、基质固相分散和渔药等四个方面进行了综述。(1)分子印迹分别从分子印迹的概念、原理、技术方法分类、制备方法分类、特性和性能测试等六个方面进行了总结；(2)固相萃取该内容总结了固相萃取的原理、分类和应用；(3)基质固相分散该内容总结了基质固相分散的原理、特点和应用；(4)渔药该内容介绍了渔药的应用、渔药残留的危害，特别详细介绍了磺胺类药物和氯霉素类药物的相关内容。第二章：提出了以SMR为模板分子合成的分子印迹作为SPE柱填料，利用HPLC技术测定池塘水和鱼肉中SMR残留的分析方法，该分析方法灵敏准确。第三章：以CAP为模板分子采用微乳液聚合合成分子印迹，作为MSPD萃取中的分散剂，利用HPLC技术测定鱼肉中CAP残留的新方法。该工作首次提出了利用CAP分子印迹结合MSPD来测定鱼肉样品中CAP的残留量，并对基体效应进行了考察。引证文献(12条)引证文献(12条)1.吕琦.王泽华.邓双胜.马岚 磺胺甲基嘧啶和磺胺二甲基嘧啶单克隆抗体的制备和鉴定期刊论文-云南大学学报（自然科学版）2007(6)2.刘庆堂.邓瑞广.张改平 磺胺类药物在饲料和畜产品中的残留、危害与检测期刊论文-饲料工业 2007(17)3.赵志华.岳田利.王燕妮.袁亚宏 现代生物技术在乳品工业中的应用研究期刊论文-生物技术通报 2006(4)4.黄丽.潘科.孙远明 克喘素免疫原CL13.2-BSA制备3种鼠抗血清效果比较期刊论文-食品科学 2005(9)5.叶兴乾.刘东红.陈健初 牛奶抗生素残留快速检测技术进展及应用现状期刊论文-农业工程学报 2005(4)6.英瑜 水产品中磺胺二甲嘧啶间接竞争ELISA（ciELISA）检测法的建立及初步应用学位论文硕士 20057.靳烨.侯文慧 牛乳中抗生素的检测方法期刊论文-中国供销商情乳业导刊 2004(8)8.吴瑕.张兰威 牛乳中抗生素残留及其检测方法的研究进展期刊论文-食品与发酵工业 2004(7)9.李晓卉 饲料与畜产品中药物残留的危害与控制期刊论文-畜禽业 2003(12)10.吴定.路桂红 发酵大豆食品中染料木素含量的ELISA测定期刊论文-食品科学 2002(7)11.黄永科.刘清.周光宏 用2种偶联比率偶联蛋白质制备猪抗克伦特罗血清的比较期刊论文-中国兽医科技 2001(2)12.周兰香.徐忠民.李幼荣.王宗元 磺胺对甲氧嘧啶全抗原的制备研究期刊论文-江苏农业研究 2001(4)本文链接：http:/