对虾的主要疾病及其诊断方法.pdf

第 21 卷第5 期2002 年9 月水?产?科?学FISHERIES?SCIENCEVol?21,No?5Sep?,2002对虾的主要疾病及其诊断方法?王吉桥1,徐?锟2(1?大连水产学院 养殖系,农业部海洋水产增养殖生态学重点开放实验室,辽宁?大连?116023;2?营口市水产局,辽宁?营口?115000)摘?要:诊断对虾病原的方法有传统的形态病理学(光镜和电镜直接观察和组织病理学等)、扩增和生物测定、微生物学和血清学方法。对皮下及造血组织坏死病毒病(IHHNV)、肝胰脏细小病毒病(HPV)、拖拉症(T aura syndrome,TS)、白斑综合症(WSSV)、斑节对虾型杆状病毒病(MBV)和杆状对虾病毒病(BP)等病原均采用非放射性的基因组探针。目前已研制出了 NHP、某些弧菌(Vibrio spp)和微孢子虫的传统基因探针。根据聚合酶链式反应(PCR),采用DNA 扩增方法确立的检测某些病原的高敏感性方法也应用在对虾病原诊断上。关键词:对虾;疾病;病原体;诊断;生物技术中图分类号:S968?22?文献标识码:A?文章编号:1003?1111(2002)05?0023?06?我国的对虾养殖业由以黄、渤海地区大排大灌养殖中国对虾(Penaeus chinensis)为主的养殖模式,经过近 10 年的探索发展为以南海地区封闭式健康养殖南美白对虾(P?vannamei)为主的养殖模式,产量由1994 年的 63 872 t,增至 2000年的 217 994 t 1,远超过了西半球的对虾产量(170 000 t),并总结出一套完整实用的防病和诊断技术。1?虾病的发生?养殖对虾患有传染性(病毒、立克次氏体、细菌、霉菌、原生生物和后生生物病等)和非传染性(环境恶化、营养失衡、毒物和遗传因子等病)的各种病害(表 1)2 8。对虾发病是对虾(种类、规格、发育阶段、生理状况等)、环境(生物与非生物等)和病原(种类、密度、致毒力等)三者相互作用的结果 9,10。许多对虾病是多病原或多病因的。病毒感染不仅常伴有细菌和外寄生物次生感染,后者可能引起对虾死亡,而且可能是多种病毒同时感染如在感染白斑综合症病毒(WSSV)的斑节对虾(P?monodon)中就同时发现了黄头病毒(HVY)11。1974 年 Couch 报道了首例对虾病毒 12,1992 年前人们共发现了 6 种对虾病毒,目前已发现了 DNA病毒和 RNA 病毒 2 大类,20 多种 13,分属 7 个科。DNA 病毒有细小病毒科 Parvoviridae(包括皮下及造血组织坏死病毒病 IHHNV,肝胰脏细小病毒 HPV,类淋巴器官细小病毒 LOPV、杆状病毒科 Baculoviri?dae(杆状对虾病毒 BP,斑节对虾型杆状病毒 MBV,澳洲对虾杆状病毒 PBV,中国对虾杆状病毒 PCBV,斑节对虾 C 型杆状病毒 TCBV、对虾血细胞杆状病毒PHBV、类淋巴器官杆状病毒 LOBV,白斑综合症杆状病毒 WSSV、外胚 层和中 胚层 系统 杆状 病毒 病SEMBV)和虹彩病毒科 Iridoviridae(IRDO 对虾虹彩病毒);RNA 病毒有呼肠病毒科 Reoviridae(呼肠类病毒-III REO-III、呼肠类病毒-IV REO-IV)、披膜 病 毒 科 Togaviridae(淋 巴 器 官 液 泡 化 病 毒LOVV)、弹状病 毒科 Rhabdoridae(对虾 杆状病 毒RPS、黄头症病 毒 YHV)和小 RNA 病 毒科 Picor?naviridae(Nodaviridae)(拖拉综合病症病毒 TSV)。南美白对虾易患拖拉病,且抗病力不随规格增大而增强 14;蓝对虾抗拖拉病的能力较白对虾强 15,16;南?收稿日期:2001-04-15;修回日期:2002-04-19?基金项目:辽宁省农业科技攻关资助项目(2001203001)作者简介:王吉桥(1950-),男,教授,博士,研究方向:水产养殖?美白对虾抗 IHHNV 病的能力较蓝对虾强;规格越大抗 IHHNV 的能力越强;经 3 轮选育的无特异病原的南美白对虾成活率提高 1 倍多,增重率提高 21?2%;无特定病原中国对虾生长快 17。表 1?世界不同地区对虾的主要疾病*印度太平洋和东亚美?洲病?毒?病细、霉菌病其?它?病病?毒?病细、霉菌病其?它?病白点病类弧菌病:外共栖生物:拖拉症(T aura弧菌病:外共栖生物:黄头病类 败血肝胰脏 Leucothrixsyndrome TS)Sindrome Leucothrix杆状病毒中肠坏死mucor皮下及造血组Gaviotamucor腺坏死病 育苗期弧菌 有缘毛的原织坏死病毒病 育苗期弧菌 有缘毛的原(BMN)病生动物(含拟(IHHNV)病生动物斑节对虾型杆 发光弧菌病阿脑虫病)*杆状对虾病毒 发光弧菌病簇毛虫状病毒病立克次氏体簇毛虫病(BP)壳病微孢子虫(MBV)幼体真菌病微孢子虫白点病类?NHP 细菌病营养失衡皮下及造血组织坏死病毒病镰孢菌病营养失衡毒物中毒症黄头病类?肝胰脏细小病幼体真菌病镰孢菌病毒物中毒症环境综合症(IHHNV)环境综合症毒病(HPV)!期氵 蚤状幼体肝胰脏细小病呼肠病毒病综合症毒病(HPV)REO-呼肠病毒病淋巴器官液泡(REO)化病(LOVV)对虾弹状病毒(RPS)*引自 Lightner 和 Redman(1998a,b)2,18;*引自俞开康等(2000)。?WSSV、MBV、BMV、HPV、IHHNV 和 YHA 是亚洲和印度 太平洋地区对虾的重要病原,而 TSV、IHHNV 和 BP 是美洲对虾的主要病原。但近年台湾和南方的南美白对虾也爆发了拖拉病 9,引起对虾大批死亡,我国北方对此须高度警惕。2?对虾病原的诊断方法对虾病原的诊断方法最早是用光学显微镜直接观察,后用电子显微镜观察,再用组织学、血清学和微生物学方法,现采用敏感的现代生物技术方法。2?1?血液学和临床化学血液学和临床化学是诊断人、畜病原的主要手段;血细胞数、凝血时间、血液中葡萄糖、氮、氨SGOT(serum glutamic oxaloacetic transaminase,血 清谷-草转氨酶)、碱性磷酸酶和血液总量等血液指标也是对虾和龙虾传染性疾病的重要指标,但只有血淋巴凝固时间和血球数量变化可用于虾病诊断。2?2?组织培养组织培养法是鉴定有鳍鱼类大多数病毒的主要方法,目前已知至少有 5 种病毒活细胞。许多甲壳动物(对虾、蟹、龙虾)研究者试图研制细胞株,通过组织培养来鉴别对虾病毒,虽然有些报告声称获得了成功 20,但目前尚未应用到对虾病毒的诊断中。2?3?毒力学分析方法对虾的非传染性疾病可用毒理学分析方法来诊断。如中毒性病症可根据特殊病理的组织斑块来确诊:蓝藻中毒引起血细胞性肠炎(中肠出现炎症斑);农用杀霉菌剂(benomyl)中毒时肝胰脏中出现特殊的瘀点;黄曲霉毒素病和某些黑鳃和黑壳病也具有特殊的组织症状;残饵和排泄物污染使酚氧化酶、SOD 和溶菌酶活力下降 21;肌肉痉挛、软壳、胡萝卜素缺乏、维生素 C 缺乏症等都具有特殊的组织学症状,要依病史和检查结果来确诊(表 2)。2?4?血清学方法血清学诊断已用于对虾病原的诊断。目前已研制出几种弧菌和病毒的单克隆(Mab)和多克隆(Pab)抗体来诊断对虾病原。如创伤弧菌(Vibrio vulnif i?cus)和哈氏弧菌(V?harveyi)的酶标记免疫吸附测定法(ELISA);解藻朊酸弧菌(V?alginolyticus)、副溶血弧菌(V?parahaemolyticus)、创伤弧菌和哈氏弧菌的单克隆抗体;日本对虾中肠腺坏死状病毒(BMN)的荧光对氨基苯甲 酸检测(PAb);对虾杆状病毒(BP)的ELISA 法。目前正在完善 IHHNV、HPV、YHA、BP和 WSSV 的单克隆抗体,解决 ELISA 中免疫球蛋白(IGM)Mab 与正常组织成分的非特异性反应问题,24水?产?科?学?第 21 卷以提高诊断准确性。薛清刚等(1995)用密度梯度离心纯化的 HPV 颗粒免疫家兔制备特异性抗原血清,建立了一种反向间接血凝法诊断 HPV 感染 22。该方法的敏感性达 ng/ml 病毒蛋白的检测水平。2?5?分子方法第一代 IHHNV 基因探针是从患病的南美白对虾IHHNV 中提纯 ssDNA,将其#正 和#负 链分配成 dsDNA,再 把 dsDNA 的#纯 端拉 长 成 载 体PUC18,最后在大肠埃希氏杆菌(E.coli)?DH?5 细胞中克隆而成。从已克隆的 IHHNV DNA 片断文库中选出了 5个 2?0kbp 或更大一些的 DNA 克隆进一步研究。它们分别称为 BS4?5、BG45、BA401、BA402 和DR22,这 其中 的 4 个 分别 含有 2?3,2?0,3?2 和2?2kbp插入片段。按照其限制酶谱组装在一起,这 5个克隆约相当于 95%4?1kbIHHNV 的 ssDNA 基因组。设备先进的实验室曾用放射标记的基因探针来诊断对虾病原,后来用非放射性的 Genius TMI 试剂盒基因探针诊断对虾病毒病。这种探针含有异羟洋地黄酶苷元?11dUTP(DIG)作 DNA 标记物,最终用 ELISA系统检测,制造出了 IHHNV 的非放射性 DIG 基因探针诊 断 盒,商品 名 为 ShrimpProbes by Diag X?otics(Wilton,C.T.USA)。自 1992 年对虾细小病毒 IHHNV 基因探针问世以来,这项技术一直被用于对虾病毒、立克次氏体状细菌和微孢子虫的诊断中,专门诊断细胞内立克氏体状细菌引起的肝胰脏坏死病原和寄生在东南亚斑节对虾和墨吉对虾(Penaeus merguiensis)体内的对虾八孢虫(Agmasoma sp)。目前,PCR 技 术已 广泛应 用于对 虾病 原的 诊断 24 30。通 常,少 量的 DNA 扩 增后 利用 针对 靶DNA 的专一寡核苷引物,即产生可检测的靶 DNA,再用 PCR 产物通过凝胶电泳与已知的标准比较,即与膜上的专一 DNA 探针反应。有时 PCR 产物本身就标记 DIG 作为专一的 DNA 探针。表 2?中国对虾、南美白对虾、蓝对虾和日本对虾常见病毒的主要病理特征病毒病靶组织?主要病理症状白斑综合症皮下组织、结缔组织、造血组织体色轻度变红或暗淡褪色,甲壳内侧有白点,镜下观,白点呈花朵状;头胸甲易与其下的组织分离,淋巴和肝胰脏肿大;细胞核肿大,核内有大量病毒颗粒;细胞形态模糊,细胞质混浊;电镜下病毒粒子外被双层结构的囊膜,横切面为圆形,纵切面为杆状;线粒体变圆,其嵴模糊。传染性皮下及造血组织坏死病?真皮、前肠 上皮、结缔组织、鳃、淋 巴?慢游水面或体翻转沉卧水底;腹部背面甲壳上有白点或淡黄色斑点;病蓝对虾濒死时体呈浅蓝色,腹部肌肉混浊不清细胞核肿胀,核内有嗜曙红的呈晶状体排列的包涵体;病毒粒子为无囊膜的 20 面体。肝胰脏细小病毒病肝胰脏厌食,不活泼,生长缓慢;病重时肝胰脏微白、萎缩,其管的上皮细胞核肥大,核内有大而显著的包涵体;包涵体近圆形或椭圆形或无定型,嗜碱性(用苏木精和曙红染色),PAS 阴性。中肠坏死杆状病毒病肝胰脏、前、中肠上皮肝胰脏和中肠上皮细胞核肥大,核仁退化到边缘或消失;无包涵体;病毒粒子 72nm%310 nm呼肠病毒病肝胰脏肝胰脏坏死、萎缩;有嗜曙红到洋红染色的包涵体,其内有直径 50 60?m 的病毒粒子集合体或晶体阵列。拖拉综合症体 表、附 肢、后 肠、胃、结缔组织在体表黑色素处和附肢、鳃、后肠、咽胃等处的角化上皮坏死;角化斑呈球形(铅弹型),具细胞质内涵体,细胞核固缩,脱核;分为 3 个发病期;a?前急性-急性期:体淡红色(红色素细胞扩张),蜕皮期间死亡;b?存活的对虾进入过渡期(恢复期);角化上皮出现多病灶黑化点;c?慢性期:虾恢复正常形态。黄头病毒病血 淋 巴、鳃、胃、心、肝 胰脏细胞具致密的嗜碱性内含物,细胞质内有多个具膜的病毒粒子和核壳,形态似WSSV。依雷质文等(2000)23、俞开康等(2000)4、Zarain-Herzberg 和 Ascencio-Valle 等(2001)5、Sahul 等(1998)7、Wang 等(1997)6和 Wang 和 Chang(2000)11的资料整理而成。25第 5 期?王吉桥等:对虾的主要疾病及其诊断方法?模板 DNA 的制备是 PCR 检测中的首要工作。用于 PCR 检测的样品必须经去除抑制 T aq 酶活性的各种杂质、部分纯化样品中的核酸等处理后才能使用。制备检测 IHHNV 的 PCR 模板的关键在于去除蛋白质并解聚病毒的核衣壳。其常用的方法有酚-氯仿抽提法、蛋白酶水解法、玻璃乳提取法、硝酸纤维膜吸附提取法等 34。王馗等(2000)比较了上述几种方法以后认为,煮沸-乙醇沉淀法是一种快速、简捷的从SEMP-Tris 采样液中保存的病虾组织中制备 PCR 模板的方法,用于 PCR 检测 IHHNV 效果很好 352?6?形态与生态结合法表 3表明,IHHNV 是目前已知最小的对虾病毒,而且东、西半球的差异较大。对虾杆状病毒(BP)的大小介于 IHHNV 和 WSSV 之间,且在南美洲自北向南、在美国自西向东减小,很可能有 2 或 3 个品系。日本对虾幼虾的 BMNV 在4&下用乙醚处理存活不到18 h;在 25%,12?5%,0 6?0%NaCl 溶液中分别于10 h,24 h 和 24 h 内不再活动 42。当 pH 值为 1,1?5 2?0,2?5,3 4 时,BMNV 分别 在 10,30,60,180 min 内不再活动 43。海水中的 BMNV 在 30,25,20&和 15&下,4,7,12 d,或 20 d 时不再活动 44。在 15 W 灯、距 离 30 cm 的 条 件(4?1%105?W)下照射 30 min,或在 30,45,50 55,60&下,晒 3 h,120,30,5 min 后,BMNV 不再活动而失活。表 3?几种主要对虾病毒的形态比较病?毒病毒粒子规格核?酸说?明IHHNV20 22 nm,正二十面体ssDNA,4?1 kb,直线型分布于北半球150 nm%450 nm;250 nm%70 nmssDNA我国学者报道TSV31 32 nm,正二十面体ssRNA,9.0kb,直线型BP55 57 nm 有囊膜,杆状dsDNA,160kbp,圆形PvSNPV78 nm%338 nm采于厄瓜多尔南美白对虾(DIG 探针)75 nm%316 nm采于墨西哥湾褐色对虾(DIG 探针)68 nm%354 nm采于佛罗里达桃红对虾(DIG 探针)56 nm%286 nm采于加利福尼亚蓝对虾(DIG 探针)采于墨西哥南美白对虾(DIG 探针)采于夏威夷缘沟对虾(DIG 探针)WSSV83 nm%275 nmssDNAWSSV 在日本称对虾杆状 DNA 病毒87 nm%330 nmssDNA(penaceid rod-shaped DNA virus,100 nm%250 nmssDNAPRDV)和对虾急性病毒血症(Penaeid111 nm%292 nmssDAacute viremia,PAV)。120 nm%360 nmssDNA?依战文斌等(1995)38、Takahashi 等(1998)39、李华等(1994)40、邓国成等(1996)41和Lightnert 和Redman(1998)18的资料整理而成。参考文献:1?李勃生,刘世禄,王耀业,等?关于加快发展我国海水养殖业的探讨 J?海洋科学,2001,25(12):20-22?2 L IGHTNER,D.V.,REDMAN,R.M.Shrimp diseases andcurrent diagnostic methods J.Aquaculture,1998,164:201-2203 LIGHT NER,D.V.,REDMAN,R.M.,Bell,T.A.Observa?tions on the geographic distribution,pathogenesis and morphol?ogy of the baculovirus from penaeus monodon Fabricius J.Aquaculture,1983,32:209-233.4 俞开康,战文斌,周丽?海水养殖病害诊断与防治手册 M?上海:上海科学技术出版社,2000?5 ZARAIN-HERZBERG,M.ASCENCIO-VALLE,F.Taurasyndrome in Mexicofollow-up study in shrimp farms 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morphologicalpathology(direct light microscopy,electron microscopy and histopathology),enhancement and bioassay methods,microbi?ololgy and the application of serological methods?While tissue culture is consideredto be a standard toolin medical and vet?erinary diagnosis,it has never been developed as a usable routine diagnostic tool for shrimp pathogens?The need for rapid,sensitive diagnostic methods lead to the application of modern biotechnology to penaeid shrimp diseases?T he nonradioactivegenomic probes has been used in diagnosis and detection of infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus(IHH?NV),hepatopancreatic parvovirus(HPV),Taura syndrome(TS),white spot syndrome(WSS),Penaeus monodon-typebaculovirus(MBV)and Baculovirus-type penaeus virus(BP),additional genomic probes or viruses(NHP),bacteria(Vibriospp)and microsporidia?These advanced molecular methods like DNA amplification methods based on the polymerase chainreaction(PCR)have been used in diagnosis of shrimp diseases,which promise to improve current shrimp farming?Key words:shrimp;disease;pathogen;diagnosis;biotechnology关于举办海水名优新品种育苗养殖技术研修班的通知为适应加入 WTO 后水产养殖业结构调整的需要,优化和推广海水名特优新品种的养殖,提升企业的竞争能力和盈利能力,围绕良种与病害两大#瓶颈的关键技术,解决养殖的急需问题,辽宁省海水渔业行业特有工种职业技能鉴定站(辽宁省海洋水产研究所)决定于 2002 年 10 月 14 18 日举办#海水名优新品种育苗养殖技术研修班,现将有关事宜通知如下:1?参加对象各单位负责技术的厂长经理、技术人员等。2?培训内容(1)大菱鲆育苗与养成技术;(2)海胆育苗与养成技术;(3)海参育苗与养成技术;(4)海蜇育苗与养成技术;(5)南美白对虾育苗与养成技术。3?主讲人及学习方式:(1)本次研修班由我所及省内著名的专家、教授、研究员讲课。(2)对当前育苗及养殖生产中的热点及问题组织座谈、交流和讨论,适当组织业务考察。(3)研修班结束后,进行考试颁发农业部人事司核发的农业职业#高级、中级技术等级证书,作为学员评职上岗的凭证。4?报名办法电话、传真报名:[phone]?联系人:王鉴?通讯地址:大连市黑石礁街 50 号?邮编 11602328水?产?科?学?第 21 卷