乳小鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞的分离培养及荧光鉴定.pdf

收稿日期:2011 05 24基金项目:国家自然科学基金资助项目(编号:81070077);省部共建重点教育部心血管重塑相关疾病重点实验室项目(编号:110267);首都医科大学基础 临床合作基金重点项目(编号:11JL09)作者简介:辛毅(1968 )，女，北京市人，学士，主管技师，主要从事细胞生物学研究。通讯作者:李温斌(1965 )，男，河南焦作人，博士，主任医师，博士生导师，主要从事心脏外科的基础与临床研究欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁氉氉氉氉。本文引用:辛毅，许秀芳，黄益民，等 乳小鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞的分离培养及荧光鉴定J 新乡医学院学报，2011，28(5):541-547乳小鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞的分离培养及荧光鉴定辛毅1，许秀芳2，黄益民2，张颖1，李温斌3(1 首都医科大学附属北京安贞医院北京市心肺血管疾病研究所实验中心，北京100029;2 首都医科大学附属北京安贞医院北京市心肺血管疾病研究所分子生物学研究室，北京100029;3 首都医科大学附属北京安贞医院心外科，北京100029)摘要:目的探讨和建立适用于乳小鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞体外分离、培养及鉴定的技术方法。方法乳小鼠心脏剪成组织块，用型胶原酶加胰蛋白酶联合消化法分离细胞，再通过差速贴壁分离法分别收集、培养乳小鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞。光学显微镜下分别观察成纤维细胞和心肌细胞的基本形态特征的变化，并对 2 种细胞行苏木素-伊红(HE)染色，用第2 代心肌成纤维细胞行波形蛋白免疫荧光鉴定，而原代心肌细胞行-横纹肌肌动蛋白、心肌肌钙蛋白和心肌肌球蛋白重链免疫荧光鉴定。结果差速贴壁分离法心肌成纤维细胞原代培养 90 min 基本贴壁，贴壁较早，培养第 3 5 代细胞生长良好，72 h 心肌成纤维细胞波形蛋白免疫荧光鉴定纯度高达 97%;而心肌细胞贴壁较晚，24 h 贴壁后部分心肌细胞出现自发性搏动现象，48 h 后细胞逐渐展开，72 h 后逐渐形成细胞簇并出现同步搏动，心肌肌球蛋白重链、心肌横纹肌肌动蛋白、心肌肌钙蛋白免疫荧光鉴定心肌细胞纯度分别为 95%、93%、95%。结论差速贴壁分离法结合免疫荧光鉴定可分离乳小鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞，此方法成熟、稳定、有效，为研究心脏疾病的基础与临床研究提供了理想的实验模型。关键词:心肌成纤维细胞;心肌细胞;原代培养;乳小鼠;免疫荧光中图分类号:Q95-33;Q2-33文献标志码:A文章编号:1004-7239(2011)05-0541-07Isolation，primary culture and identification of cardiac fibroblasts and cardiac myocytes of neonatalmouseXIN Yi1，XU Xiu-fang2，HUANG Yi-min2，ZHANG Ying1，LI Wen-bin3(1 Beijing Anzhen Hospital，Capital Medical University，Department of Experimental Center，Beijing Institute of Heart，Lung andBlood Vessel Diseases，Beijing 100029，China;2 Beijing Anzhen Hospital，Capital Medical University，Department of MolecularBiology，Beijing Institute of Heart，Lung and Blood Vessel Diseases，Beijing 100029，China;3 Department of Cardiac Surgery，Beijing Anzhen Hospital，Affiliated to Capital Medical University，Beijing 100029，China)Abstract:ObjectiveTo build the isolation，culture and identification techniques of cardiac fibroblasts and cardiacmyocytes of neonate mouse MethodsThe heart of neonate mouse was cut into pieces，then type collagenase plus trypsi-nase digestion method were used for isolating cell and then cardiac fibroblasts and cardiac myocytes were collected and culturedby different speed adherence The basic shape change of cardiac fibroblasts and cardiac myocytes were observed under the opit-ical microscope and the two kinds cells were given hematoxylin-eosin staining The second generation cardiac fibroblasts wereassayed by vimentin immunofluorescence and cardiac myocytes were assayed by-sarcomeric-actin，cardiac troponin and cardi-ac myoglobulin heavy chain immunofluorescence ResultsFibroblasts were adhered after 90 minutes of primary culture by themethod of different speed adherence，and the third generation to the fifth generation cells growth well The expression of vimen-tin of 97%fibroblasts were positive after 72 hours culture But cardiac myocytes were adhered after 24 hours of culture andthere was spontaneous beating phenomenon of part cardiac myocytes The cells gradually spread after 48 hours The cells clus-ters were formed and there was synchronous pulsation after 72 hours The positive expression rate of cardiac myoglobulin heavychain，-sarcomeric-actin and cardiac troponin was 95%，93%，95%，respectively after 72 hours culture ConclusionDiffer-ent speed adherence method and immunoflurescence were effective and stable to isolate the cardiac fibroblasts and cardiacmyocytes This method provide an ideal experimental model for the basic and clinical research of heart diseaseKey words:cardiac fibroblasts;cardiac myocytes;primary culture;neonatal mouse;immunoflourescence145第 28 卷第 5 期2011 年 9 月新乡医学院学报Journal of Xinxiang Medical CollegeVol 28No5Sep 2011随着分子、细胞生物学的发展，细胞水平的研究日益受到重视。国内外诸多学者开展了心肌细胞的生理、病理、药理、代谢等方面的基础研究1，体外培养的心肌细胞可保持结构及功能上的某些特点，并具有自发性节律搏动、不传代，且心肌细胞的培养具有不受体内神经体液因素的影响等特点。成纤维细胞是结缔组织中最常见的细胞，可合成和分泌胶原纤维、弹性纤维、网状纤维及有机基质，并且在外伤等因素刺激下，部分纤维细胞可重新转变为幼稚的成纤维细胞，其功能活动也得以恢复，参与组织损伤后的修复。实验研究中由于心肌细胞和成纤维细胞在原代细胞培养时均是贴壁细胞，故需要建立一种技术方法将 2 种细胞分离开并保持各自的纯度。差速贴壁纯化法是根据成纤维细胞和心肌细胞在培养皿表面贴壁时间不同而进行分离的，操作简单，对细胞影响小，分离纯度高。本实验参照 Simpson等2-3 心肌细胞的培养方法并作了部分改进，用型胶原酶、胰蛋白酶联合消化法替代单一胰蛋白酶消化提高心脏组织的消化效率，并结合 90 min 差速贴壁及心肌细胞专用培养基(cardiac myocyte medium，CMM)的应用，从根本上提高心肌细胞的存活率和纯度，同时又能分离培养纯度很高的心肌成纤维细胞，为研究心脏疾病提供理想的实验模型。1材料与方法1 1材料1 1 1实验动物乳小鼠 C57BL/6，雌雄不限，1 3 日龄，体质量 1 2 1 5 g，来源于北京维通利华实验动物技术有限公司。11 2主要试剂高糖/杜尔伯科改良伊格尔培养基(high glucose/dulbecco modified eagle medium，HG/DMEM)、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、青霉素、链霉素均为美国 Gibco 公司产品，型胶原酶、胰蛋白酶、4，6-联脒-2-苯基吲哚(4，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)、3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基溴化四氮唑蓝 3-(4，5-dimethyl-2-thiahiazo)-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)均为美国 Sigma 公司产品。波形蛋白(Vimentin)兔抗小鼠(一抗，美国Santa Cruz)、异硫氰酸罗丹明(tetraethyl rhodamineisothiocyanate，TRITC)标记的羊抗兔 IgG(二抗，美国 Jacson);心肌肌钙蛋白(Troponin I，Tn I)羊抗人(人与鼠有交叉反应性，一抗，美国 Santa Cruz)、TRITC 标记的兔抗羊 IgG(二抗，美国 Jacson);小鼠腹水单克隆抗体-横纹肌肌动蛋白(-sarcomeric-actin，-SA;美国 Sigma，EA-53)、TRITC 标记的羊抗鼠 IgG(二抗，美国 Jacson);肌球蛋白重链(myosinheavy chain，MHC)小鼠单克隆抗体(英国 Abcam，3-48)，CMM 为美国 ScienCell 公司产品。细胞培养板、离心管、培养皿等耗材购自美国 Corning 公司。1 1 3主要仪器荧光倒置显微镜(德国 Leica，4000B 型)，荧光正置显微镜(日本 OlympusBX-51)，CO2细胞培养箱(日本三洋公司产品)，酶标检测仪(德国 Beckman)，超净工作台(北京昌平长城净化空气仪器厂)，离心机(上海安亭科学仪器厂 TGL-16C)。1 2方法12 1取材将乳鼠于体积分数 75%乙醇缸中浸泡 10 s，转移至超净台。将乳鼠固定于左手掌中，右手用无菌棉签蘸体积分数 75%酒精消毒胸、腹部皮肤 3 次。用眼科虹膜剪在剑突处正中线稍偏左向上开胸后，用剪子压住胸骨右缘，使心脏自然跳出，用弯镊子勾住心尖根部，取出心脏，置于装有预冷0.01 molL1磷酸盐缓冲溶液(phosphate bufferedsolution，PBS)的培养皿中。将鼠心脏全部取出后，剪去心房、剔除心脏上结缔组织、脂肪及血管，于预冷 0.01 molL1PBS(含双抗)清洗 3 次，去除血污。将心脏剪成约 1 mm 1 mm 1 mm 的组织块，备用。12 2双酶消化分离培养法组织碎块放入100 mL锥形 瓶 中，再 加 入 2 g L1 型 胶 原 酶 和2 5 gL1胰蛋白酶(11)联合消化液体积为心肌组织的10 15 倍，置37、80 rmin1水浴摇床消化 20 min 后，吸管轻轻吹打组织块2 min 分散细胞，此时消化液变混浊，小部分组织块变成白色，用吸管吸取细胞悬液放入 15 mL 的离心管中，加入含体积分数 10%FBS HG/DMEM 终止消化，收获细胞;在其余未完全消化的组织块中加入联合消化液，为上次消化液总体积的 1/2，余步骤同前;重复消化 4次，所有的细胞悬液过 200 目铜网。1 2 3细胞培养吸取细胞悬液入15 mL 离心管，1 000 rmin1离心 5 min，弃上清，细胞沉淀中加入含体积分数 10%HG/DMEM 10 mL，吹打均匀后放入 100 mm 培养皿，置体积分数 5%CO2、37 培养箱中培养，放置 90 min 差速贴壁，最先贴壁为心肌成纤维细胞，将未贴壁的细胞悬液(含有心肌细胞)收集到 15 mL 离心管中，1 000 rmin1离心5 min，弃上清，加入含体积分数10%FBS HG/DMEM 1 mL245新乡医学院学报http:/www xxyxyxb com2011 年第 28 卷重悬细胞，用台盼蓝染色法计数调整细胞浓度，将其调成细胞浓度为 1 0 1084 0 108L1后接种于6 孔板中，置体积分数 5%CO2、37 培养箱中继续培养，再 加 入 10 mL 含 体 积 分 数 10%FBSHG/DMEM于 100 mm 培养皿，继续培养心肌成纤维细胞。第 2 天 6 孔板中的 HG/DMEM 换成 CMM 培养基，100 mm 培养皿换成新鲜的10 mL 含体积分数10%FBS HG/DMEM。每 2 d 换液 1 次。12 4分离纯化心肌成纤维细胞和心肌细胞在细胞培养中，心肌成纤维细胞具有分裂增殖能力，且生长迅速，贴壁较早，依据成纤维细胞与心肌细胞贴壁时间不同的原理做差速分离。待成纤维细胞生长到培养皿的50%60%时，加入0 01 molL1PBS洗 1 次，用2 5 gL1胰蛋白酶消化，在显微镜下观察消化程度，细胞形态由长梭形逐渐变成圆形，加入含体积分数 10%FBS HG/DMEM 终止消化，将细胞悬液收集到 15 mL 离心管中，1 000 rmin1离心5 min，弃 上 清，加 入 含 体 积 分 数 10%FBSHG/DMEM 13 传代。可传 6 代，细胞 5 代以后逐渐衰老;最后贴壁的是心肌细胞，它不具分裂增殖能力，且对胰蛋白酶比较敏感，在显微镜下严格控制消化时间，一般为 1 2 min，待细胞的突起、触角逐渐回缩时，加入 FBS 使细胞终止消化，轻轻吹打培养皿底部，使细胞悬浮，把细胞悬液收集到15 mL 离心管中，1 000 rmin1离心 5 min，弃上清，CMM 重悬，调整细胞数接种于不同的培养皿、培养板中，进行后续实验的应用。1 2 5心肌成纤维细胞和心肌细胞活力测定1 2 5 1MTT 法测定心肌成纤维细胞增殖活力取生长良好的心肌成纤维细胞，以每孔约 2 103个细胞等量接种于 96 孔板中，每孔加入 100 L 培养液，置 37、体积分数 5%CO2细胞培养箱内孵育。每隔 24 h 向其中 5 孔加入 5 gL1的 MTT 溶液20 L，孵育 4 h 后吸弃培养液，加入 150 L 的 DM-SO，置于37、体积分数5%CO2孵育10 min，每日测 5 孔，连续测 7 d。设立平行对照孔(加入培养液，不加细胞)并调零，用酶标仪在 490 nm 波长处测定各孔的光密度值(D490 nm)，MTT 法连续 7 d测定心肌成纤维细胞增殖及存活能力。1 2 5 2心肌细胞活力测定在原代心肌细胞培养第 3 天，观察心肌细胞搏动的节律，并在高倍视野下计数有自发搏动的细胞 20 个，记录每分钟搏动频率，进行统计学比较。1 2 6心肌成纤维细胞和心肌细胞形态学观察1 2 6 1倒置光学显微镜观察观察心肌成纤维细胞和心肌细胞生长状态、形态变化，心肌细胞搏动的节律，并在高倍视野下计数有自发搏动的细胞个数，进行摄像。1 2 6 2苏木素-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色观察取传2 代心肌成纤维细胞和原代心肌细胞以105个接种于放有无菌盖玻片的 6 孔板，2 3 d 后用001 molL1PBS 洗 3 次，每次 2 min;40 gL1多聚甲醛固定20 min，001 molL1PBS 洗 3 次，每次2 min;苏木素染色2 5 min，水洗 2 min;5 gL1盐酸分化至细胞核染色清晰，水洗，并浸于水中至核变蓝;伊红液染色 1 2 min，水洗 2 min;体积分数80%乙醇浸洗 1 min、体积分数 90%乙醇、无水乙醇浸洗1 min;二甲苯浸洗5 min，取出盖玻片后中性树胶封片并在显微镜下观察。1 2 7心肌成纤维细胞和心肌细胞的免疫荧光法鉴定12 7 1心肌成纤维细胞 Vimentin 抗原的鉴定取传 2 代心肌成纤维细胞和原代心肌细胞以 105个接种于放有无菌盖玻片的 6 孔板，2 3 d 后用0 01 molL1PBS 洗 3 次，每次 2 min;40 gL1多聚甲醛固定 20 min，0 01 molL1PBS 洗 3 次，每次2 min;3 gL1聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)室温封闭 30 min，用 0 01 molL1PBS 洗 3次，每次 2 min;200 L FBS 室温封闭 1 h，滴加1100 稀释 200 L 兔抗小鼠 Vimentin 一抗，室温孵育 1 5 h，用 0 01 molL1PBS 洗 3 次，每次2 min;然后加 1100 TRITC 标记的羊抗兔 IgG 二抗200 L，室温避光孵育 1 h，用 0 01 molL1PBS洗 3 次，每次 2 min;最后用 DAPI 染核，室温避光孵育15 min;同时做同型对照，不加一抗，余步骤同前，在荧光显微镜下观察，统计阳性细胞数。1 2 7 2心肌细胞 MHC、Tn I 和-SA 抗原的鉴定取传2 代心肌成纤维细胞和原代心肌细胞以 105个接种于放有无菌盖玻片的 6 孔板内制作细胞爬片，2 3 d 后取出爬片，0 01 molL1PBS 洗 3 次，每次2 min;40 gL1多聚甲醛(pH 7.2)固定40 min，001 molL1PBS 洗 3 次，每次 2 min;3 gL1Triton X-100 室温封闭 30 min，用001 molL1PBS洗3 次，每次 2 min;200 L FBS 室温封闭 1 h，取200 L 1100 稀释的 MHC 一抗滴到接种有心肌细胞的盖玻片上，室温孵育 1.5 h，用0.01 molL1PBS 洗 3 次，每次 2 min;1100 TRITC 标记羊抗鼠IgG 二抗室温避光孵育2 h，用 0.01 molL1PBS 洗345第 5 期辛毅，等:乳小鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞的分离培养及荧光鉴定3 次，每次 2 min;最后用 DAPI 染核，室温避光孵育15 min，在荧光显微镜下观察细胞，统计阳性细胞数。随机取 10 个高倍视野计数阳性细胞及细胞总数。阳性细胞率=阳性细胞数/细胞总数 100%。一抗分别用 200 L 1100 稀释羊抗人 Tn I(人与鼠有交叉反应性)和 1100 稀释兔抗羊 IgG 二抗、200 L 1100 稀释的-SA 一抗和 1100 TRITC标记的羊抗小鼠 IgG 二抗做免疫荧光染色;同时做同型对照，不加一抗，余步骤同前。2结果21心肌成纤维细胞和心肌细胞的生物学特性原代分离培养中刚分离的混合细胞呈大小不一的球形，培养 90 min 细胞开始陆续贴壁生长，最先贴壁的为心肌成纤维细胞，细胞呈不规则形或椭圆形，后变为长梭形(图 1A)，培养 2 3 d 观察，可见明显增殖，2 3 d 即可呈融合状态，细胞排列紧密，有的交叉重叠生长，无自发性搏动，细胞生长达到 70%80%可传代，5 代之后会出现明显衰老;将 90 min 后未贴壁的心肌细胞悬液(图1B)接种于6 孔板中，第2 天待心肌细胞贴壁后，换成 CMM 培养基替代化学抑制纯化法，继续培养 2 3 d 观察，未见增殖，视野中绝大多数细胞为已开始自发性搏动的心肌细胞(图 1C)。A:培养90 min 心肌成纤维细胞(贴壁);B:培养90 min 心肌细胞(悬浮);C:培养 3 d 心肌细胞(贴壁)图 1光镜下原代培养成纤维细胞和心肌细胞形态Fig 1Shape of fibroblasts and cardiac myocytes underlight microscope22心肌成纤维细胞和心肌细胞活力测定结果心肌成纤维细胞生长前2 d 与3 d 比较，其细胞活力差别有统计学意义(P 0 01)(表 1)，提示增殖能力较弱;3 7 d 变化较为显著，提示此段时间内细胞增殖较为旺盛，两两比较差别无统计学意义(P 005)，可进行传代;心肌细胞原代培养 2 3 d 部分开始搏动，第 3 天开始呈现有规律、不同步搏动，第7 天后细胞融合形成细胞簇或团，细胞呈现同步搏动，其搏动由周缘向心搏动，收缩明显而有力。故活力测定从第 3 天开始，随机计数 20 个细胞搏动频率(表 2)。搏动频率多为 70 100 次min1，同一培养板中细胞间的搏动频率可不同。培养第 3 天与第15 天心肌细胞搏动频率比较差别无统计学意义(P 0 05)，说明培养的心肌细胞3 15 d 无论细胞形态还是细胞活力都良好，在此期间可进行实验研究;第 17 天后与培养 15 d 前心肌细胞搏动频率比较差别有统计学意义(P 0 01)，说明心肌细胞第17 23 天心肌细胞活力开始下降，搏动次数减少，其搏动由周缘向心搏动变为从两端向中心方向收缩，颇似肌纤维束的收缩，细胞出现衰老状态。表 1培养心肌成纤维细胞活力测定Tab 1Vitality test of cultured fibroblasts(珔x s，n=5)培养时间/d光密度值(D490 nm)10064 000620077 000930126 0012a40138 0010a50203 0010a60230 0019a70219 0018a与 2 d 前比较aP 001表 2培养心肌细胞活力测定Tab 2Vitality test of cultured cardiac myocytes(珔x s，n=20)培养时间/d搏动/(次min1)385 30 334585 70 362784 10 223984 20 4001182 20 4891381 80 5321580 00 4641762 70 510a1948 30 16 00a2127 20 12 04a238 40 295a与 15 d 前比较aP 0012 3心肌成纤维细胞和心肌细胞 HE 染色观察结果差速贴壁法最先贴壁的为心肌成纤维细胞，细胞平坦，胞质透明，颜色淡，显得很薄，细胞核较大，椭圆形，经常含有 2 3 个核(图 2A)。心肌细胞胞质颜色较深，有颗粒样物质，略显粗糙，细胞核小，椭圆形，颜色较深，通常为 1 个核，有自发性搏动(图2B)。445新乡医学院学报http:/www xxyxyxb com2011 年第 28 卷A:心肌成纤维细胞;B:心肌细胞图 2心肌成纤维细胞和心肌细胞(HE 染色，200)Fig 2Cardiac fibroblasts and cardiac myocytes(HE stai-ning，200)2 4心肌成纤维细胞和心肌细胞的纯度鉴定培养的成纤维细胞 Vimentin 抗原表达呈阳性反应，阳性细胞率为 97%(图 3A)，同时做心肌细胞对照实验，呈阴性反应(图 3B);培养的心肌细胞 72 h 后行MHC 免疫荧光鉴定抗原表达阳性，阳性细胞率为95%(图 4A)，同时做心肌成纤维细胞 MHC 对照实验，免疫荧光呈阴性反应(图 4B);72 h 后心肌细胞行 Tn I 免疫荧光鉴定抗原表达阳性，阳性细胞率为95%(图 5A)，同时做成纤维细胞 Tn I 对照实验，免疫荧光呈阴性反应(图 5B);72 h 后心肌细胞行-SA 免疫荧光鉴定抗原表达阳性，阳性细胞率为93%(图 6A)，同时做成纤维细胞-SA 免疫荧光鉴定抗原表达阴性(图 6B)。A:心肌成纤维细胞;B:心肌细胞图 3心肌成纤维细胞和心肌细胞 Vimentin 抗原表达情况(免疫荧光染色，200)Fig3Vimentin antigen presentation of cardiac fibroblastsand cardiac myocytes(immunofluorescence staining，200)A:心肌细胞;B:心肌成纤维细胞图 4心肌细胞和心肌成纤维细胞 MHC 抗原表达情况(免疫荧光染色，200)Fig 4MHC antigen presentation of cardiac myocytes andcardiac fibroblasts(immunofluorescence staining，200)A:心肌细胞;B:心肌成纤维细胞图 5心肌细胞和心肌成纤维细胞免疫荧光 Tn I 抗原表达情况(免疫荧光染色，200)Fig 5Troponin I antigen presentation of cardiac myocytesand cardiac fibroblasts(immunofluorescence staining，200)A:心肌细胞;B:心肌成纤维细胞图 6心肌细胞和心肌成纤维细胞免疫荧光-SA 抗原表达情况(免疫荧光染色，200)Fig 6The-SA antigen presentation of cardiac myocytesand cardiac fibroblasts(immunofluorescence staining，200)3讨论心脏是由心肌细胞和非心肌细胞组成。其中心肌细胞约占心脏组织的 25%，近 75%的细胞是非心肌细胞(如成纤维细胞和血红细胞)，心肌成纤维细胞较心肌细胞更容易贴壁且具有分裂很强的增殖能力，很容易生长成优势细胞。心脏成纤维细胞构成心肌层绝大多数的非心肌细胞，对心肌功能的正常运作起着重要作用4。一方面心肌成纤维细胞通过产生细胞外基质，如胶原蛋白和纤维连接蛋白，构成了心肌细胞的机械框架;另一方面，心肌成纤维细胞还可以产生心室重构过程中所需的金属蛋白酶、各种生长因子和细胞因子。临床上，心肌成纤维细胞的增殖参与了高血压左心室肥厚、缺血性心脏病、扩张型心肌病及充血性心力衰竭等多种心血管疾病的病理过程，研究心肌成纤维细胞对于现代心血管疾病的研究也具有重要意义。基础与临床实验需要将心肌细胞和成纤维细胞完全分离开来。体外培养时非心肌细胞的快速生长与体内的情况完全不同，可能使心肌细胞生长出现密度抑制的现象，因此，获得纯度高的心肌细胞培养模型对研究方法的科学性及结果的可靠性具有重要意义。545第 5 期辛毅，等:乳小鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞的分离培养及荧光鉴定在以往的乳鼠心肌细胞原代培养中，分离心肌细胞的方法有机械收集法和酶消化法，用吸管反复吹打的机械分离方法，吹打不易控制，极易损伤心肌细胞，成活细胞率较低。单一胰蛋白酶消化法主要用于分解组织间质的蛋白质，作用强，对细胞膜、细胞内微丝及微管损伤较大，而且组织经过胰蛋白酶处理后会释放出大量的胶原蛋白，胶原蛋白呈絮状，使上清很难分离开，获得的心肌细胞数量少而且活力差，影响心肌细胞获得率，而胶原酶作用缓和，主要用于消化细胞间质中的胶原纤维以释放心肌细胞，因此，本研究采用较低浓度的胰蛋白酶和较高浓度的型胶原酶的混合消化酶消化心肌组织，既能很好地将心肌细胞和成纤维细胞分离出来，又不损伤心肌细胞，也能很好地收集心肌细胞，消化酶作用时间对心肌细胞的获得影响很大，消化时间过长，胰蛋白酶对心肌细胞损害增加，消化时间过短，胶原酶起不到消化作用。因此，每次消化时间不应过长，最佳时间为 10 20 min，且多次重复消化及时终止。本研究用改良法成功地进行了新生小鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞分离，依据心肌成纤维细胞贴壁速度很快，而心肌细胞相对较慢，通过差速贴壁90 min，可以比较有效地分离心肌成纤维细胞和心肌细胞5-7，在心肌细胞体外培养中，传统的培养基使用含 0 1 mmolL15-溴脱氧尿嘧啶 HG/DMEM培养基，近年来有学者发现高糖能诱导心肌细胞凋亡8-10，可能通过氧化应激诱导心肌细胞凋亡11;还有可能通过影响凋亡相关基因的表达而诱导心肌细胞凋亡12。CMM 的应用替代化学抑制纯化法，前者使心肌细胞纯度高、细胞存活率高、细胞贴壁快、搏动早且操作简便、重复性好;而后者利用化学物质对非心肌细胞的生长进行抑制或破坏作用来分离纯化心肌细胞，不适于培养较长时间的实验，同时加入化学物质会对心肌细胞活力产生一定影响。细胞骨架包括微管、微丝和中间纤维，中间纤维家族中包含 Vimentin、角蛋白等许多成员，其中 Vim-entin 是间质细胞中最主要的中间纤维，它存在于中胚层起源的细胞中，如成纤维细胞、内皮细胞和白细胞等13，并与微管、微丝共同形成了一个细胞支架网络而维持细胞完整性。实验表明成纤维细胞表达Vimentin 阳性，可根据 Vimentin 表达阳性来鉴定成纤维细胞。成纤维细胞的数量大约是心肌细胞的 2 倍，分裂增殖能力旺盛14。研究发现成纤维细胞 Vimen-tin 与线粒体功能有关:Vim+/+小鼠和 Vim/小鼠的成纤维细胞中线粒体的数量、形态和活性均有所差异。有学者在研究 Vimentin 和线粒体的关系发现，多次传代后的 Vim/成纤维细胞的线粒体DNA 拷贝数是传代前的 215 倍，线粒体 DNA 与线粒体质量比高达 415，并且线粒体 DNA 出现明显缺失，说明 Vim/成纤维细胞对线粒体 DNA 的调控能力较低，导致线粒体 DNA 容易发生改变15。Tol-stonog 等16 研究发现，在细胞永生化过程中，与Vim+/+成纤维细胞相比，Vim/成纤维细胞转变成永生化细胞的比例很低，而且需要较长的时间才能形成数量较多的单层永生化细胞，更为重要的是，在Vim/成纤维细胞中，线粒体呼吸链和氧化磷酸化偶联过程比正常细胞弱，细胞核及核周区域中有大量的活性氧簇产物进行性地积聚。由此可见，Vim-entin 不仅能够引发细胞永生化，而且在成纤维细胞老化过程中发挥保护作用，保护其不发生退行性变化。Vimentin 还能与细胞核 DNA 分子结合，影响基因的修复和重组，也有助于细胞获得永生化的能力。心肌细胞增殖能力低，多数实验来源于心肌细胞的原代培养，原代培养的成功与否直接关系到实验的进程，提高心肌细胞的存活率和纯度是心肌细胞培养成功的关键。肌组织分骨骼肌、心肌和平滑肌 3 种，前 2 种属横纹肌。肌动蛋白是细胞的一种重要骨架蛋白，是横纹肌肌纤维中的一种主要蛋白成分，也是肌肉细丝及细胞骨架微丝的主要成分。肌动蛋白具有收缩功能，分布广泛，在细胞分泌、吞噬、移动、细胞质环流和细胞质分裂等生命活动中起重要作用。Tn 由 Tn I、T、C 3 个亚基构成，和原肌球蛋白一起通过调节钙离子对 ATP 酶的活性来调节肌动蛋白和肌球蛋白相互作用。Tn 是组成横纹肌细丝的结构蛋白，可调节钙介导的肌动蛋白和肌球蛋白之间的相互反应，本身为多肽，其亚单位 I、T 和C 组成复合物。其中 Tn I 是肌原纤维 ATP 酶的抑制单位，可抑制肌球蛋白与肌动蛋白结合，阻止肌肉收缩。故本实验用-SA、Tn I 和心肌肌球蛋白重链17 单克隆抗体来荧光标记心肌细胞，心肌细胞呈阳性反应。总之，本研究通过长时间的实验证实，利用低浓度的胰蛋白酶与胶原酶联合应用、多次消化心脏组织，通过差速贴壁 90 min、CMM 培养基的使用，并通过特异性免疫荧光鉴定，能够建立一种较为理想的心肌成纤维细胞和心肌细胞原代培养方法，以满足心血管疾病发生、发展机制及心血管药物和心脏组织工程学的研究及多种生理生化实验的要求。645新乡医学院学报http:/www xxyxyxb com2011 年第 28 卷参考文献1邸美仙，李应东 乳鼠心肌细胞的培养J 中华中医药学刊，2007，25(4):691-692 2Simpson P，Savion S Differentiation of rat myocytes in single cellcultures with and without proliferating nomyocardial cellsJ CircRes，1982，50(1):101-116 3张乃菊，陈天平，祝晓光，等 乳鼠心肌细胞和心脏成纤维细胞的原代培养 J 蚌埠医学院学报，2010，35(6):558-561 4Baudino T A，Carver W，Giles W，et al Cardiac fibroblasts:friendor foe J Am J Physiol Heart Circ Physiol，2006，291(3):1015-1026 5Dosenko V E，Nagibin V S，Tumanovskaya L V，et al Postcondi-tioning prevents apoptotic necrotic and autophagic cardiomyocytecell death inculture J Fiziolohichny Zhurnal，2005，51(3):12-17 6Kim K H，Kim T G，Bruce K，et al Dynamic expression patterns ofleucine-rich repeat containing protein 10 in the heartJ DevDyn，2007，236(8):2225-2234 7王宁，李应东 乳鼠心肌细胞原代培养方法的改进J 中国心血管病研究，2007，5(12):920-922 8Singh V P，Le B，Khode R，et al Intracellular angiotensinII produc-tion in 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