HPLC-ELSD法测定痰咳净片中桔梗皂苷D含量-刘爱明,周文君.pdf

53第 1 7 卷 第 3 期 2015 年 3 月辽 宁 中 医 药 大 学 学 报JOURNAL OF LIAONING UNIVERSITY OF TCMVol.17 No.3 Mar.，2015痰咳净片收载于卫生部药品标准中药成方制剂第二十册，是桔梗、咖啡因、远志、冰片、苦杏仁、五倍子和甘草7味药制备而成的复方制剂，具有通窍顺气、消炎镇咳、促进排痰等作用。用于急慢性支气管炎、胸闷、咽喉炎、肺气肿等引起的咳嗽痰多、气促、气喘等症。在其原标准中，只有咖啡因的含量HPLC-ELSD法测定痰咳净片中桔梗皂苷D含量刘爱明，周文君（朝阳市食品药品检验所，辽宁 朝阳 122000）摘 要：目的：建立痰咳净片中桔梗皂苷D的含量测定方法。方法：采用高效液相色谱法-蒸发光散射检测器（HPLC-ELSD），色谱柱为Kromasil C18（4.6 mm250 mm，5 m），流动相为乙腈-水（2674），流速为1.0 mL/min，ELSD漂移管温度为80，气体流速为2.6 SLPM/min。结果：桔梗皂苷D进样量在0.499 412.485 4 g线性范围内峰面积线性关系良好（r=0.999 7），平均回收率98.51%，RSD=0.8%（n=6）。结论：该方法准确、可靠，重复性好，灵敏度高，可用于痰咳净片的质量控制标准。关键词：痰咳净片；桔梗皂苷D；高效液相色谱法-蒸发光散射检测器中图分类号R284 文献标志码：A 文章编号：1673-842X (2015)03-0053-03收稿日期：2014-08-15作者简介：刘爱明（1982-），女，辽宁朝阳人，主管药师，硕士，研究方向：抗生素药品的化学检验及中药微生物限度、无菌药品的检验。Determination of Platycodin D in Compound TankejingTablets by HPLC-ELSD MethodLIUAiming，ZHOUWenjun（ChaoyangInstituteforFoodandDrugControl，Chaoyang122000，Liaoning，China）AbstractObjective：ToestablishamethodfordeterminationthecontentofplatycodinDinCompoundTankejingTablets.Method：Highperformanceliquidchromatographywithevaporativelightscatteringdetector（HPLC-ELSD）methodwasused.ThecolumnwasKromasilC18（4.6mm250mm，5m）andthemobilephaseacetonitrilewaterwas2674.Theflowratewas1.0mL/minandtheELSDdrifttubetemperaturewas80andthegasflowratewas2.6SLPM/min.Results：ThelinearrangeofPlatycodinDwas0.499412.4854g（r=0.9999）.Theaveragerecoverywas98.51%，RSD=0.8%（n=6）.Conclusion：ThemethodisaccurateandreliablewithgoodreproducibilityandhighsensitivityandcanbeusedforthequalitycontrolofCompoundTankejingTablets.Key words：Tankejingtablet；platycodinD；HPLC-ELSD质量标准评价体系提出了新的思路和新的方向，对于揭示中药的本质及现代中药的研究方向具有重大意义。（3）实验表明，在葛根治疗糖尿病的这四组药对中，黄酮类药效组分（3-羟基葛根素-葛根素-大豆苷-大豆苷元）均以葛根素的含量最高，大豆苷元的含量最低。使用单因素方差分析，P0.05，说明葛根-天花粉、葛根-黄芪、葛根-知母、葛根-玄参四组药对中各药效组分的含量与比例相近，没有显著性差异，从而确定了葛根生津功效的药效组分比例与临床的关系。而在葛根-玄参药对中虽然葛根的用量为玄参的两倍，但各药效组分的含量和比例均为最低，因此说明中药在与不同饮片配伍发挥不同的治疗目的时，其所含的药效组分的含量和溶出量并不是一成不变的，伴随着不同的配伍，都有相应的药效组分与之相对应。通过此次实验论证了药效组分理论，说明了药效组分理论与临床密切的结合性，充分体现了中药治疗疾病的本质，药效组分理论是中药研究的新思路、中药质量标准的新指标。参考文献1崔向微，张贵君.组分中药与中药现代化J.时珍国医国药，2009，20(5 )：1290-1291.2张贵君，杨晶凡.中药标准物质的科学内涵及其研究思路J.现代药物与临床，2009，24(2 )：71-72.3中华人民共和国药典 委员会.中华人民共和国药典（一部）S.北京：化学工业出版社，2005：233-234.4王立群.中医临床常用药对手册M.北京：学苑出版社，2001：5.5胥庆华.中药药对大全M.北京：中国中医药出版社，1996：3.6周霈，黄亦琦.药对配伍对方剂复方研究的意义探讨J.现代中医药，2013，33(5 )：20.DOI：10.13194/j.issn.1673-842x.2015.03.01854 辽宁中医药大学学报 17 卷测定方法，而桔梗为处方中的君药，具有宣肺、利咽、祛痰、排脓的作用1。痰咳净片的镇咳祛痰的作用与桔梗含量高低密切相关。桔梗提取物具有多种生物活性和很好的药用价值2，是市场畅销的中药提取物之一。桔梗总皂苷是桔梗提取物的主要药效成分，其中桔梗皂苷D含量最高，药效较确定3。但桔梗皂苷D无共轭结构，无强的发色基团，末端吸收检测干扰较大，故本文采用高效液相色谱-蒸发光散射检测器法测定痰咳净片中桔梗皂苷D的含量，从而可以有效的控制药品质量，保证临床用药安全有效4-9。1仪器与试药Waters2695型高效液相色谱仪，Waters2424型蒸发光散射检测器，CPA225D电子分析天平（德国赛多利斯公司），9860A型超声仪（费纳米科技发展有限公司），桔梗皂苷D对照品（中国药品生物制品 检 定 所，批 号：111851-201204）；痰 咳 净 片（吉林白山正茂药业股份有限公司，批号：20130105，20130801，20121005）；乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂（甲醇，正丁醇，三氯甲烷）均为分析纯。2实验方法与结果2.1 色谱条件色谱柱KromasilC18（4.6mm250mm，5m）；流动相：乙腈-水（2674）；流速：1.0mL/min；漂移管温度：80，气体流速2.6SLPM/min。理论板数按桔梗皂苷D峰计算不低于3000。2.2 溶液制备精密称取桔梗皂苷D对照品适量置25mL量瓶，加甲醇适量使之溶解，再加甲醇至25mL，制成每毫升约含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。精密称定本品20片量，精密称取3.9256g，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50mL，称定重量，超声处理（功率250W，频率40kHz）30min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25mL，置水浴上蒸干，残渣加水20mL，微热使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次20mL，合并正丁醇提取液，用氨试液50mL洗涤，弃去氨液，再用正丁醇饱和的水50mL洗涤，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇3mL使溶解，加硅胶0.5g拌匀，置水浴上蒸干，加于硅胶柱100120目，10g，内径为2cm，用三氯甲烷-甲醇（91）混合溶液湿法装柱上，以三氯甲烷-甲醇（91）混合溶液50mL洗脱，弃去洗脱液，再用三氯甲烷-甲醇-水（60203）混合溶液100mL洗脱，弃去洗脱液，继续三氯甲烷-甲醇-水（60296）混合溶液100mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇溶解，并转移至5mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得供试品溶液。按处方称取不含桔梗的其他药材，按制备工艺制备阴性样品，并按供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液。2.3 方法学考察2.3.1 阴性干扰实验精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液，分别注入高效液相色谱仪，在上述色谱条件下测定。结果可见该色谱条件下桔梗皂苷D峰形良好（图1a），相邻的成分与桔梗皂苷D达到分离要求（图1b），阴性对照色谱在相应的保留时间附近未检出干扰峰，表明其他组分对测定无干扰。（图1）abca.对照品；b.供试品；c.阴性对照图1痰咳净片HPLC色谱图55 17 卷 辽宁中医药大学学报 2.3.2 线性关系考察分别精密吸取对照品溶液1、5、10、15、20、25L，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。以对照品进样量为横坐标（X），峰面积积分值为纵坐标（Y）（见表1），绘制标准曲线（见图2）。得回归方程为Y=70469X-6914（r=0.9997）。结果表明，桔梗皂苷D对照品进样量在0.499412.4854g范围内与峰面积有良好的线性关系。2.3.3 精密度试验精密吸取对照品溶液10L，重复进样6次，按上述色谱条件测定桔梗皂苷D的峰面积。并计算RSD为0.38%（n=6），结果表明仪器精密度良好。2.3.4 重现性试验取同一批号（批号为20130105）样品6份，分别依法处理后按上述色谱条件测定桔梗皂苷D的峰面积。计算结果的RSD为0.85%，表明该方法重复性良好。2.3.5 稳定性试验取同一供试品溶液（批号为20130105）10L，按上述色谱条件，分别于0、2、4、8、12、24h时测定，以峰面积计算，RSD为0.94%。结果表明供试品溶液在24h内基本稳定。2.3.6 加样回收率试验精密称取己知含量的供试品（批号20130105，桔梗皂苷D含量为0.1256mg/g）6份，每份2.0g，精密加入一定量的桔梗皂苷D对照品，按供试品溶液方法制备，依法测定含量并计算回收率，结果见表1。表1回收率试验测定结果取样量（g）样品含量（mg）对照品加入量（mg）测得量（mg）回收率（%）平均回收率（%）RSD（%）1.99050.25000.24970.496698.7698.510.81.99260.25030.24970.498199.241.99120.25010.24970.493897.601.99480.25050.24970.495698.161.98890.24980.24970.497999.361.98760.24960.24970.494297.962.4 样品含量测定 取3批样品，按供试品溶液方法制备，分别进样10L，依法测定，采用外标两点法计算样品中桔梗皂苷D的含量，结果为：批号20130105桔梗皂苷D含量为0.02512mg/片；批号20130801桔梗皂苷D含量为0.02578mg/片；批号20121005桔梗皂苷D含量为0.02505mg/片。3讨论现在蒸发光检测器（ELSD）越来越多的作为通用型检测器用于高效液相色谱、超临界色谱（SFC）和逆流色谱中。目前应用最主要的是HPLC-ELSD联用10。ELSD最大的优越性在于能检测不含发色团的化合物，如：碳水化合物、脂类、聚合物、未衍生脂肪酸和氨基酸、表面活性剂、药物，并在没有标准品和化合物结构参数未知的情况下检测未知化合物。ELSD的通用检测方法消除了常见于传统HPLC检测方法中的难点，不同于紫外和荧光检测器，ELSD的响应不依赖于样品的光学特性，任何挥发性低于流动相的样品均能被检测，不受其官能团的影响，对于无紫外或紫外末端吸收的大分子有机化合物的检测，显示出极大的优越性。ELSD的响应值与样品的质量成正比，因而能用于测定样品的纯度或者检测未知物11-14。在我国，以中药材为原料的中药提取物被用于医疗或保健食品已形成了一定的生产规模。规范中药提取物的质量对中药产业的发展至关重要，大量中药提取物还有待制订国家标准或行业标准15。目前，有相当大的一部分中药，其中所含的主要成分、活性成分或者质量控制的目标成分均没有紫外吸收或仅在紫外末端有吸收，给质量控制工作带来了一定的难度。采用HPLC-ELSD方法，针对于那些没有紫外吸收或末端吸收的目标成分，可以制定对中成药、中药饮片及配方颗粒尽量科学准确的质量控制方法10。由于桔梗的活性成分桔梗皂苷D只有一个C=C双键，紫外吸收弱，且末端吸收在203nm有较大的干扰。选用高效液相色谱-蒸发光散射检测器法，可以避免以上问题，提高检测的精密度，所以本文采用HPLC-ELSD法对其进行定量分析。对色谱条件和ELSD参数进行反复试验，最终确定以乙腈-水（2674）为流动相、流速为1.0mL/min、ELSD漂移管温度为80、载气流速为2.6SLPM/min时样品中桔梗皂苷D峰与其他组分峰可以达到分离要求。参考文献1国家药典委员会中华人民共和国药典2010版（一部）S.北京：化学工业出版社，2010：259.2付文卫，窦德强，裴月湖.桔梗的化学成分和生物活性研究进展J.沈阳药科大学学报，2006，23(3 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